القياسات المكانية للالإرواء، الخلالي الضغط السائل والليبوزومات تراكم في الأورام الصلبة

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تراكم غير متجانسة داخل ورمي من الجسيمات الشحمية هو عامل حاسم من فعاليتها. وترتبط كل من دوران الأوعية الدقيقة الورم الفوضى ورفع IFP للتوزيع داخل ورمي غير متجانسة من أنظمة توصيل الدواء القائمة على تكنولوجيا النانو مثل الجسيمات الشحمية. في هذه الدراسة، تم التحقيق العلاقة بين دوران الأوعية الدقيقة الورم، IFP مرتفعة، وتراكم الجسيمات النانوية من خلال في الجسم الحي التجريب. وقد تحقق ذلك من خلال تقييم دوران الأوعية الدقيقة الورم باستخدام تباين ديناميكية معززة التصوير المقطعي (DCE-CT) وقياس IFP الورم باستخدام نظام إبرة الروبوتية صورة موجهة رواية التنسيب متصلا الماسح الصغير-CT. تم تحديد تراكم داخل ورمي من الجسيمات الشحمية التي كتبها التقييم المستندة إلى الصور المقطعية للصياغة liposomal جسيمات متناهية الصغر التي تغلف مستقر وiohexol عامل تباين (CT-الجسيمات الشحمية). CT التصوير يسمح للمشاركة في توطين التوزيع المكاني للديناميكا الدم السرطانية، IFP وتراكم CT-الحويصلية في نموذج طعم أجنبي الماوس تحت الجلد الفردية من سرطان الثدي. أدت القياسات إلى اكتشاف أن نضح وحجم البلازما جزء وسطاء قوية للتوزيع داخل ورمي من الجسيمات الشحمية. وعلاوة على ذلك، تشير النتائج إلى أن IFP يلعب دورا غير مباشر في التوسط توزيع الحويصلية من خلال تحوير تدفق الدم.

Introduction

قياس تراكم داخل ورمي نظم تسليم المخدرات جسيمات متناهية الصغر يمكن أن توفر أداة هامة لتحديد ما إذا كان قد تحقق تركيز كاف من المخدرات السامة للخلايا داخل الورم. تطوير نظم liposomal "صورة قادرة" تسمح لغير الغازية والكمي في الجسم الحي الكشف عن سيارة لتوصيل الدواء باستخدام طرائق التصوير مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) مضان البصرية والتصوير المقطعي (CT) 3، (4) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 5. وقد استخدم التصوير لتحديد الدوائية وbiodistribution أنظمة توصيل الحويصلية والكشف عن مدى التجانس بين الموضوع وداخل ورمي في تراكم جسيمات متناهية الصغر 6،7. ومع ذلك، والتصوير الجسيمات النانوية وحدها لا تحدد الحواجز البيولوجية التي ساهمت في ضعف التراكم وتوزيعها. هذه المعرفة أمر بالغ الأهمية لصتطوير الاقلية البرلمانية من الصيغ أكثر فاعلية، واستراتيجيات لتحسين تراكم داخل ورمي 8. وقد ثبت أن استراتيجيات علاجية يمكن تطبيقها لتعديل الحواجز البيولوجية المحددة مما أدى الى تحسين النقل جسيمات متناهية الصغر 9. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير الصيغ جسيمات متناهية الصغر للتغلب على وجه التحديد الحاجز النقل بيولوجية معينة (10). في كلتا الحالتين، والقياسات الحواجز البيولوجية يمكن أن تستخدم لتوجيه استخدام استراتيجية مناسبة تسليم المخدرات جسيمات متناهية الصغر.

ويعتقد أن دوران الأوعية الدقيقة الورم وارتفاع IFP أن اثنين من المحددات الرئيسية لتراكم داخل ورمي النانوية، مثل الجسيمات الشحمية، في الأورام الصلبة 9،11. ومع ذلك، والحواجز الأخرى التي لتساهم في تراكم الحويصلية الفقراء وتشمل مصفوفة كثيفة خارج الخلية، الأوعية الدموية غير منفذة، وضغط الأنسجة الصلبة 12. وترتبط هذه الحواجز في والزمانية المكانيةالطريقة، مع تدفق الدم غير طبيعي وارتفاع ضغط السائل الخلالي يجري عاملين مهمين القيادة التسليم المبدئي والتسرب من الجسيمات النانوية. كما نوقش سابقا، وتحدد العلاقة بين دوران الأوعية الدقيقة الورم، IFP مرتفعة، وتراكم داخل ورمي من الجسيمات الشحمية لا بد للتفسير السليم للبيانات الحويصلية التصوير. هنا الأساليب الكمية لقياس العلاقة بين دوران الأوعية الدقيقة الورم، IFP مرتفعة، وتراكم جسيمات متناهية الصغر في الأورام الصلبة يتم عرض. يتم ذلك عن طريق إجراء القياسات المحلية المشتركة للتوزيع داخل ورمي من وكيل الحويصلية النقيض CT باستخدام التصوير الحجمي CT، دوران الأوعية الدقيقة الورم باستخدام تباين ديناميكية تعزيز حسابها التصوير المقطعي، وورم IFP باستخدام الروبوت نظام إبرة المواقع الموجهة الصورة، ووصف الروبوت CT-IFP 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب المجراة في إطار بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام شبكة الصحة جامعة.

1. نموذج حيواني

  1. الثقافة بين 5-7 × 10 6 MDA-MB-231 خلايا غدية الثدي السرطانية في DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و100X التخفيف من البنسلين ستربتومايسين.
  2. حصاد الخلايا عندما تكون 80٪ متموجة باستخدام 0.05٪ حل التربسين-EDTA. بعد 3-5 دقائق تحييد التربسين-EDTA مع حجم بقوة 3x من DMEM. اتخاذ قسامة 15 ميكرولتر من الخلايا والعد باستخدام عدادة الكريات. خلايا الطرد المركزي في بيليه لمدة 5 دقائق في 200 x ج، وإعادة تعليق في HBS بتركيز 10 × 10 6 خلايا لكل مل.
  3. زرع تحت الجلد (SC) الأورام عن طريق حقن 1-2 × 10 6 خلايا في أطرافهم هند من كل 8 إلى 12 أسبوع من العمر فئران SCID (ن = 5). استخدام معيار إبرة 25 G للحقن.
  4. مراقب رumor الفرجار النمو باستخدام (المجلد = 0.5 × طول × العرض 2) وتبدأ القياسات مرة واحدة الأورام SC قد وصلت إلى حجم> 200 مم 3 (حوالي 7-9 أيام).

2. CT-الحويصلية تحضير وتوصيف

  1. إعداد الحويصلية
    1. حل مكونات الدهون (200 مليمول / لتر) لCT-الجسيمات الشحمية، بما في ذلك 1،2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DPPC)، والكولسترول (CH)، و1،2-distearoyl-SN-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-بولي (جلايكول الإثيلين) 2000 (DSPE-PEG2000) في الإيثانول لا مائي عند 70 درجة مئوية في نسبة المولي من 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
    2. تتبخر الإيثانول عن طريق الحفاظ على الحرارة عند 70 درجة مئوية، ثم إضافة وكيل iohexol CT النقيض من (300 ملغ / مل من اليود) في حل مثل أن تركيز الدهون النهائي هو 100 ملم.
    3. الحفاظ على الحل عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع vortexing لكثرة.
    4. للحصول على الحويصلات unilamellar، قذف العينة 5 تيموفاق من خلال اثنين من مكدسة 200 الأغشية حجم نانومتر مسام عند ضغط 250 رطل وقذف مرة أخرى بنسبة 5 دورات من خلال اثنين من مكدسة 80 نانومتر الأغشية حجم المسام في 400 رطل باستخدام 10 مل الدهون الطارد. ماصة لحجم 10 مل من الجسيمات الشحمية في الطارد في بداية كل دورة قذف وجمع في العقيمة المخروطية أنبوب أو زجاج القارورة بعد كل دورة قذف.
    5. إزالة iohexol مغلفة الامم المتحدة قبل 16 ساعة من غسيل الكلى باستخدام 100 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (MWC) كيس غسيل الكلى مقابل وحدة تخزين فائض 250 أضعاف من 0.02 حل مخزنة HEPES ملم المالحة (HBS، ودرجة الحموضة 7.4). على سبيل المثال، ضع 1 مل من محلول الحويصلية داخل كيس غسيل الكلى مع 250 مل من HBS خارج الكيس في كوب.
    6. تركيز CT-الجسيمات الشحمية باستخدام نظام MWC nomical 750،000 التجاري عرضية تدفق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. التركيز إلى تركيز اليود النهائي من حوالي 55 ملغ مل -1.
  2. الحويصلية توصيف
    1. قياس كفاءة التغليف من قبل تمزيق CT-الجسيمات الشحمية باستخدام فائض حجم 10 أضعاف من الإيثانول للافراج عن ioxehol ثم تمييع باستخدام فائض حجم 100 أضعاف من الماء منزوع الأيونات (أي 10 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية تمزق باستخدام 100 ميكرولتر من الإيثانول ثم يخفف إلى الحجم النهائي من 10 مل).
    2. تحديد تركيز iohexol باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية مع الكشف عند طول موجي 245 نانومتر. حساب الكفاءة التلخيصات بأخذ كمية نسبة كيل iohexol صدر لكمية من وكيل وأضاف أثناء التحضير.
    3. قياس القطر وزيتا الهيدروديناميكية إمكانية استخدام تشتت الضوء حجم الجسيمات نظام تحليل ديناميكية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع الحل CT-الحويصلية من قبل 200X (أي 5 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية في 1 مل من الحجم النهائي) في الماء منزوع الأيونات لتسهيل القياسات.

3. التصوير المقطعي للدوران الأوعية الدقيقة ورم وCT-الحويصليةتوزيع

ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة الصانعة لإجراء فحص الحجمي إذا تم استخدام مختلف إصدار البرنامج أو المعدات.

  1. تخدير كل فأر باستخدام 2٪ الأيزوفلورين مختلطة مع الهواء الطبي أو الأكسجين وتأكيد عن طريق معسر أخمص قدميها، ومراقبة أي رد فعل. تطبيق مرهم للعين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. شل الحيوان في وضعية الرقود عن طريق تسجيل الكفوف إلى لوحة رقيقة من البلاستيك.
  2. وضع مخصص 27 G القسطرة، متصلا 20 سم على PE10 أنابيب، إلى الوريد الذيل الأفقي وآمنة في مكان مع عدة قطع من الشريط.
  3. تحضير حقنة 1 مل لاحتواء لا يقل عن 200 ميكرولتر من CT-الجسيمات الشحمية. تحضير حقنة 1 مل مع المياه المالحة لاستخدامها لمسح القسطرة. وأخيرا، وإعداد حقنة 1 مل مع لا يقل عن 150 ميكرولتر من iohexol مجانا مختلطة مع المياه المالحة (9: 1 نسبة من حيث الحجم).
  4. ضع الماوس عرضة على السرير الماسح الضوئي CT الجزئي. استخدام نظام تحديد المواقع ليزر لوضع tumo(ص) في حوالي نفس التوجه لكل المسح الضوئي.
  5. وضع حقنة CT-الحويصلية في ضخ حقنة وإرفاق القسطرة إلى الحقنة. تعيين معدل ضخ 10 ميكرولتر لكل ثانية.
  6. تهيئة النظام عن طريق إجراء فحص المعايرة مشرق الظلام باستخدام برنامج حدة CT-الماسح الضوئي. حدد الخيار مسح مشرق الظلام لكل بروتوكول التصوير من الفائدة، حدد مشرق الظلام من القائمة المنسدلة واضغط على زر المسح الضوئي لبدء المعايرة.
  7. إجراء الحجمي التشريحية-CT الجزئي للورم قبل أي حقن عامل تباين. نظرة على مؤشر البرمجيات وحدة CT الماسح الضوئي لضمان سلامة CT-الماسح الضوئي تم تطهيرها المتداخلة. على CT الماسح الضوئي وحدة التحكم حدد مسح تحديد الطاقة الأشعة السينية من 80 كيلو فولت، تيار أنبوب من 70 مللي أمبير، ويلتقط 1000 توقعات صورة مع مرور الوقت و 16 ثانية. اضغط على زر المسح الضوئي لبدء المسح الضوئي.
  8. استخدام مضخة الحقن لحقن البلعة من CT-الجسيمات الشحمية بتركيز 400 كجم اليود ملغ-1. تعيين مضخة لضخ وبلغ حجم التداول حوالي 150 ميكرولتر (على افتراض 25 غ الماوس). اضغط على زر "البدء" على مضخة لضخ. طرد يدويا القسطرة مع 50 ميكرولتر من المياه المالحة (ضعف حجم القسطرة) للتأكد من كمية وكيل بأكمله تم حقن والقسطرة واضح.
  9. انتظر لمدة 10 دقيقة بعد حقن CT-الجسيمات الشحمية ثم إجراء فحص تشريحي الثاني باستخدام نفس الطريقة والإعدادات الموضحة في 3.5.
  10. إجراء فحص DCE-CT عن طريق تعيين ضخ حقنة لحقن حجم 100 ميكرولتر من iohexol مجانا مختلطة مع المياه المالحة (9: 1 نسبة من حيث الحجم) باستخدام نفس الإعداد معدل الحقن وصفها في 3.3.
    1. على وحدة CT-الماسح الضوئي حدد مسح الديناميكي 5 دقائق يستخدم إعداد طاقة الأشعة السينية من 80 كيلو فولت، وهي طاقة أنبوب من 90MA، ويلتقط 416 توقعات صورة كل ثانية لمدة 30 ثانية الأولى وتليها عملية استحواذ كل 10 ثانية . القبض على 5 ثانية من البيانات DCE-CT ثم اضغط على زر البداية على مباشرة صبن مضخة.
    2. بعد الفحص DCE-CT إجراء التشريحية المسح الجزئي-CT الحجمي.
  11. التقاط الصور المقطعية التشريحية بين 48 و 72 ساعة بعد الحقن من CT-الجسيمات الشحمية، باستخدام نفس الإعدادات CT الحجمي كما هو موضح في الخطوات 3.5.
  12. اعادة البيانات المقطعية وDCE-CT التشريحية باستخدام برنامج GPU-إعادة الإعمار.
    1. تحميل الصورة في برنامج إعادة الإعمار. تحديد المنطقة التي تهم إعادة بنائها من خلال الاعتماد على العائد على الاستثمار فوق الصورة باستخدام الماوس. تعيين موقع حفظ واسم لإعادة بنائها تصوير وتحديد المخرجات نوع ملف باسم '.mat ".
      ملاحظة: سوف يقوم البرنامج تلقائيا تعيين حجم فوكسل أعيد إلى 0.153 س 0.153 س 0.153 مم 3 لاجراء الفحوصات التشريحية و 0.153 س 0.153 س 0.462 مم 3 لاجراء الفحوصات DCE-CT. انقر على "بدء إعادة الإعمار 'زر.
  13. استخدم قبل حقن و 10 دقيقة بالاشعة بعد حقن CT-الحويصلية لحساببلازما حجم جزء كما هو موضح سابقا 3. وعلاوة على ذلك، استخدم قبل حقن و 5 دقائق بالاشعة بعد الحقن من iohexol لحساب نسبة حجم الخلالي كما هو موضح سابقا 7.
  14. الحصول على الوقت كثافة منحنيات (الحيازات) عن طريق استيراد البيانات DCE-CT في البرامج التي توفر القدرة على تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ضمن حجم الورم. ثم حساب متوسط ​​CT تعزيز في العائد على الاستثمار بوصفها وظيفة من الزمن. في هذه التجربة تم تطوير برامج مخصصة لتحديد العائد على الاستثمار وحساب TIC.
  15. الحصول على تقديرات كمية لنضح ونفاذية الأوعية الدموية عن طريق تركيب الحيازات قياسها باستخدام نموذج حركي التتبع في أقسام اثنين. تركيب يمكن تنفيذها باستخدام DCE-CT برامج التحليل واستخدام التقديرات APRIORI من نسبة حجم البلازما وكسور حجم الخلالي كمعلمات الثابت في النموذج الحركي التتبع في أقسام اثنين. استخدام أساليب ذكرت سابقا للحصول على تقديرات APRIORI من بلازماووكسور حجم فراغي 14.

4. المقاييس المكانية من ورم الخلالية ضغط السائل

  1. لقياس IFP ربط إبرة في العمود الفقري 25 G لمحول الضغط ولنظام الحصول على IFP خلال 50 سم من PE20 البولي ايثيلين أنابيب. مسح نظام كامل مع الحل الهيبارين كبريتات / المالحة (01:10). تعقيم الإبرة مع 70٪ الآيزوبروبيل قبل الاستخدام.
  2. تشغيل نظام الحصول وإطلاق برنامج الحصول على IFP وتحميل ملفات الإعدادات لمعايرة نظام للحصول على قياسات IFP في مم زئبق. انقر على زر اكتساب لجمع البيانات بشكل مستمر IFP.
  3. إجراء قياسات IFP بين 48 و 72 ساعة بعد الحقن من CT-الجسيمات الشحمية (وهذا يتوافق مع الوقت التقريبي للذروة تراكم CT-الجسيمات الشحمية في الورم)، وذلك باستخدام الأساليب المذكورة في 4.8. إرفاق الإبرة IFP للروبوت CT-IFP.
  4. القيام بمسح المعايرة لمواءمة نظم تنسيق لالروبوت CT-IFP وماسح التصوير المقطعي. إضافة المرفق علامة إيمانية للروبوت CT-IFP وإجراء الاشعة المقطعية أربعة الحجمي مع علامة الإيمانية في أربعة مواقع مختلفة.
    1. إطلاق برنامج تحكم الروبوت CT-IFP، تهيئة الروبوت، وتحريك الروبوت إلى المراكز الثلاثة عن طريق إدخال س، ص، ض يستهدفون مواقع والنقر على زر 'اذهب'.
    2. أخذ الاشعة المقطعية في س التالية، Y، Z إحداثيات: (1) 0،0،0. (2) -10،0،0. (3) 0،7،0. و (4) 0،0،10. اختيار 90 كيلو فولت، 10 أمبير، 16 ثانية المسح الضوئي باستخدام برنامج CT-الماسح الضوئي ثم اضغط على "ابدأ" لبدء المسح الضوئي. إعادة الفحص كما هو موضح في 3.10.
  5. إطلاق CT-IFP برنامج المواءمة الروبوت. انقر على زر "إضافة" تحميل في المنطقة "بيانات التسجيل" وحدد أربعة بمسح تسجيل أعيد بناؤها تم الحصول عليها في 4.3، ثم انقر على 'فتح'.
    ملاحظة: سيتم تلقائيا موقع بكسل من علامة إيمانية إدخالها في softwaإعادة.
    1. انقر على زر "حساب تحويل" ثم انقر فوق الزر "تطبيق تحويل". وهذا يولد البيانات موازنة التي سيتم استخدامها لتحويل الروبوت CT-IFP تنسيق النظام إلى ماسح التصوير المقطعي تنسيق النظام. بعد معايرة كاملة، ونعلق على منصة الحيوان إلى الإنسان الآلي CT-IFP.
  6. تخدير كل فأر باستخدام 2٪ الأيزوفلورين مختلطة مع الهواء الطبي أو الأكسجين وتأكيد عن طريق معسر أخمص قدميها، ومراقبة أي رد فعل. شل الحيوان على منصة الروبوت CT-IFP ووضع مؤشر الماوس مثل أن الورم هو الوصول إلى نظام الروبوت CT-IFP. لشل حركة الورم باستخدام الشريط بحيث لا تتحرك أثناء IFP إبرة الإدراج.
  7. إجراء مسح الدقيقة CT التشريحي قبل إدخال الإبرة IFP. اعادة البيانات المقطعية باستخدام الخطوات الموضحة في 3.10.
  8. تحميل قبل إبرة بيانات الإدراج CT في البرنامج محاذاة الروبوت CT-IFP. ضبط النافذة ومستوى لتصور الورم. انقر على الالبريد حافة الورم في أي صورة، ثم انقر على موقع حافة الثاني.
    ملاحظة: يقوم البرنامج بحساب سلسلة من المواقف على طول خط الخطي بين الموقفين. لاحظ x و y و z إحداثيات سلسلة من 5-8 المواقف متباعدة بشكل متساو من القائمة.
  9. إعداد نظام IFP عن طريق تنظيف الإبرة مع الحل الهيبارين المالحة قبل الإدراج.
  10. أدخل الأولى المواقف إبرة محددة مسبقا في س، ص، ض، في برنامج حاسوبي لمراقبة الروبوت CT-IFP والصحافة الانتقال إلى زر 'اذهب' لتحريك الروبوت إلى الموضع المطلوب. انقر فوق الزر "إدراج إبرة" لادخال الإبرة في النسيج.
    1. بعد إدخال الإبرة ضمان الاتصال السائل الجيد بين إبرة IFP والأنسجة عن طريق معسر والافراج عن أنابيب PE20، مشيرا إلى أن الزيادات قياس IFP وترجع إلى ما قبل معسر القيمة على اقتناء البرمجيات IFP. رفض القياسات التي لا عودة إلى خط الأساس.
  11. اكتسابالاشعة المقطعية التشريحي مع إبرة، ثم انقر على زر "تتراجع عن إبرة" على برنامج حاسوبي لمراقبة الروبوت CT-IFP لسحب الإبرة من الأنسجة. رفض أي قياسات حزب انكاثا للحرية حيث لا يرجع قيمة IFP إلى القيمة الإدراج قبل إبرة بعد الانسحاب من الإبرة. هذا يعني قد يكون انسداد الإبرة أثناء القياس. كرر الخطوات من 4،8 حتي 4،10 لكل موقف إبرة.
  12. تحديد موقف إبرة داخل حجم الورم عن طريق حساب س، ص المواقف، و z من ميناء إبرة نسبة إلى مركز كتلة حجم الورم على النحو المحدد في مرحلة ما بعد الإدراج المسح الضوئي التصوير الضوئي الحجمي من الإبرة.
  13. عودة الحيوانات إلى القفص بعد كل القياسات كاملة. لا تترك الحيوانات غير المراقب، ورعاية للاطلاع عليها حتى يتم استعاد وعيه وأنها قادرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول المذكور ينبغي أن تسفر CT-الجسيمات الشحمية مع التركيز مغلفة من iohexol، يعني قطر الحويصلية، وإمكانات زيتا من 55 ملغ مل -1، 91.8 ± 0.3 نانومتر، و-45.5 ± 2.5 فولت، على التوالي. ويتضمن الشكل 1A التمثيلي التصوير DCE-CT النتائج، مما أسفر عن سلسلة زمنية من البيانات الحجمي التي تظهر التغيرات الزمانية في تراكم داخل ورمي من iohexol. اختيار العائد على الاستثمار داخل الورم تعطي TIC التي يمكن كميا باستخدام التتبع أساليب النمذجة الحركية للحصول على تقديرات التروية، نفاذية الأوعية الدموية والبلازما حجم جزء، وجزء من حجم الخلالي (الشكل 1B). في هذه الدراسة، تم استخدام النموذج الحركي التتبع في أقسام اثنين ومناسبا لTIC المقاس باستخدام غير الخطية منحنى روتين المناسب تنفذ في Matlab 14. بتجزئة حجم الورم إلى مناطق متعددة من الفائدة متساوية في الحجم يسمح للالكمي رانه المكانية توزيع المعلمات الديناميكية الدموية داخل حجم الورم (الشكل 1C). تقسيم لا يمكن أن يؤديها إما يدويا، والتي تستغرق وقتا طويلا وصعبا، أو تلقائيا كما يقوم هنا باستخدام خوارزمية الذي يقسم الورم في عدة رويس متساوية الحجم باستخدام نظام الإحداثيات الكروي. توفر الطرق DCE-CT التقديرات الكمية للتوزيع المكاني للنضح، نفاذية الأوعية الدموية والبلازما حجم جزء، وجزء الخلالي حجم. وقد لوحظت هذه المعايير أن تكون غير متجانسة مكانيا مع مستويات أعلى من نضح، والبلازما وكسور حجم فراغي على امتداد المحيط الخارجي مقارنة مع حجم الورم المركزي.

طريقة التصوير المقطعي الحجمي يكشف biodistribution والتوزيع داخل ورمي من CT-الجسيمات الشحمية. ويبين الشكل 2A وbiodistribution من CT-الجسيمات الشحمية في 48 ساعة بعد الحقن. وكيل مازال ينتشر في الالبريد الأوعية الدموية، مع امتصاص كبير لوحظ في الطحال والكبد. وقد لوحظ تراكم داخل ورمي من CT-الجسيمات الشحمية أن تكون غير متجانسة، مع تراكم في الغالب هامشية بالمقارنة مع المركز، كما يرمز لها المناطق المشرقة في حجم الورم (الشكل 2B).

الحجمي التصوير المقطعي يمكن استخدامها لتتبع الموقع من القياسات IFP إجراؤها باستخدام الإعداد الروبوت CT-IFP. ويوضح الشكل 3A موضع إبرة IFP داخل حجم الورم كما تصويرها باستخدام عالية الدقة المتناهية الصغر CT. يمكن أن تكون واضحة وتحديد الإبرة داخل حجم الورم مما يسمح لتوطين المكاني للقياسات حزب انكاثا للحرية في حجم الورم (الشكل 3B). فمن الممكن لتوليد الخريطة المكانية الشركة الدولية للمعارض في جميع أنحاء الورم عن طريق إجراء قياسات متعددة حزب انكاثا للحرية في حجم الورم. وIFP المكاني ويمكن بعد ذلك أن تكون مرتبطة مع القياسات نفسها مندوران الأوعية الدقيقة الورم وتراكم CT-الحويصلية.

الحجمي التصوير المقطعي يسمح لإطار مرجعي مشترك مما يجعل من الممكن أن تشارك في توطين قياسات haemodynamics، IFP، وتراكم CT-الحويصلية الشكل 4 يعطي مثالا على القياسات مكانيا المشارك المترجمة من تراكم CT-الحويصلية، IFP، نضح، نفاذية الأوعية الدموية والبلازما حجم جزء، وجزء الخلالي حجم. ولوحظ أن نضح وجزء حجم البلازما ترتبط بشكل كبير مع تراكم داخل ورمي من CT-الجسيمات الشحمية في تحت الجلد MDA-MB-231 الأورام. وعلاوة على ذلك، وتوزيع شعاعي من IFP ترتبط مع القياسات الديناميكية الدموية. وتشير هذه النتائج وجود علاقة المكانية والزمانية المعقدة بين دوران الأوعية الدقيقة الورم، IFP وتراكم داخل ورمي من الجسيمات الشحمية 14.

شكل 1 الشكل 1: DCE-CT التصوير من دوران الأوعية الدقيقة ورم (أ) سلسلة تمثيلية من الصور المقطعية الزمنية التي تم جمعها في حجم الورم، والتي تصور حركية عامل تباين بوصفها وظيفة من الوقت. يمثل كفاف الأحمر العائد على الاستثمار حيث يتم قياس منحنى وقت الشدة (TIC). (ب) TIC يصلح باستخدام التتبع النموذج الحركي-المقصورة اثنين لانتاج تقديرات كمية من المعلمات الديناميكية الدموية داخل العائد على الاستثمار. (ج) التوزيع المكاني الممثل المعلمات الديناميكية الدموية الكمية في الورم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الحجمي CT-تصوير الحويصلية بطاريات أوجه. (أ) التمثيلية تقديم الصورة الحجم 3D مما يدل على biodistribution من CT-الجسيمات الشحمية. (ب) محوري الممثل، الاكليلية، وشرائح السهمي اتخذت من خلال مركز الورم تبين تراكم داخل ورمي من CT-الجسيمات الشحمية في 48 ساعة بعد الحقن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: صورة استرشادا القياسات IFP) أ (3D صورة المقدمة حجم ممثلة للنظام الروبوت CT-IFP (الأخضر) الإدراج بعد الإبرة إلى ورم تحت الجلد في 48 ساعة بعد الحقن من CT-الجسيمات الشحمية (برتقالي). (ب) صورة CT تمثيلية من الإدراج بعد إبرة./54226/54226fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: قياسات مترجمة شركة من دوران الأوعية الدقيقة ورم، IFP، وتراكم CT-الحويصلية يظهر الفريق التمثيلي المكاني شارك في توطين CT-الحويصلية تراكم تؤخذ 48 ساعة بعد الحقن، IFP، نضح، نفاذية الأوعية الدموية، وحجم البلازما جزء و الخلالي حجم الكسر. إعادة طبع بإذن من 14. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أساليب لقياس الصورة القائمة المقدمة هنا تمكن تحديد التوزيع المكاني للخصائص الورم دوران الأوعية الدقيقة، IFP، وتراكم CT-الحويصلية. وقد اعتمدت المحاولات السابقة لربط هذه الخصائص على أداء قياسات السائبة عبر عدة الحيوانات الحاملة للورم، وبالتالي تفتقر إلى الحساسية لتوضيح الآليات المسؤولة عن عدم التجانس في تراكم داخل ورمي الذي عادة وحظ لأنظمة توصيل الدواء نانو الحجم 15. DCE-CT يوفر أداة لقياس الاختلافات داخل ورمي في خصائص دوران الأوعية الدقيقة الورم، ويوفر التصوير الضوئي الحجمي وصفا دقيقا للحركية ترسب CT-الحويصلية، ويوفر نظام الروبوت CT-IFP أداة لأداء رسم الخرائط المكانية الشركة الدولية للمعارض في نفس الحيوان. وعلاوة على ذلك، DCE-CT التصوير هو أسلوب معتمد سريريا لقياس ديناميكا الدم ورم في إعداد سريرية، مما يجعل النتائج التي توصلت إليها هذه الدراسة transl يحتمل سريرياatable.

ونظرا لتعقد القياسات، وهناك العديد من العوامل الحاسمة لضمان جمع مجموعات البيانات القوية. DCE-CT الكمي القائم من دوران الأوعية الدقيقة الورم يمكن القول إن أصعب لضمان تقديرات دقيقة للhaemodynamics الورم. ويتطلب ذلك الحصول على الحيازات المشتركة مع إشارة إلى ارتفاع نسب الضوضاء (SNR) وتوظيف خوارزمية المناسب قوية لتحديد الحيازات 16،17. الفحص البصري التشنجات اللاإرادية يمكن استخدامها لإزالة البيانات SNR منخفضة من التحليل. وعلاوة على ذلك، إذا لم يتم توخي الحذر ثم تركيب عالية SNR الحيازات قد يؤدي أيضا إلى تقديرات خاطئة للنضح الورم، ونفاذية الأوعية الدموية والبلازما حجم جزء، وحجم الخلالي جزء 16. من أجل تحقيق أقصى قدر من دقة القياس الكمي كان يعمل استراتيجية للحصول على تقديرات مستقلة نموذجية من البلازما وحجم الخلالي كسور، والتي تستخدم في وقت لاحق كمعلمات الثابتة خلال نموذج يصلح التشنجات اللاإرادية قياسها. هذه الطريقةيضمن يتم الحصول على تقديرات قوية من نضح الورم ونفاذية الأوعية الدموية 15.

يتطلب تحليل دقيق للتوزيع داخل ورمي من CT-الجسيمات الشحمية أداء الحجمي التصوير CT بعد تراكم ما يكفي من وكيل. من الدراسات السابقة، وتراكم الورم ذروة CT-الجسيمات الشحمية يحدث بين 48 إلى 72 ساعة في xenografts الماوس 3،15. وعلاوة على ذلك وجود علاقة خطية بين تركيز CT-الحويصلية وتعزيز التباين في التصوير CT السماح لتقدير بسيط من الاختلافات في تراكم داخل ورمي من CT-الجسيمات الشحمية 15.

تتطلب قياسات دقيقة من IFP باستخدام أسلوب قائم على إبرة الاتصالات السوائل جيد بين القسطرة والأنسجة. وعلاوة على ذلك، من المهم أن الأورام استخدام الوحيدة التي تعاني من ارتفاع الورم IFP المركزي (> 5 إلى 10 مم زئبق)، وإلا سوف تكون هناك اختلافات المكانية الحد الأدنى في IFP. القياسات المكانية للIFP باستخدام CT-IFP سرقةبعد التمديد systemcan تكون صعبة بسبب الحركة الأنسجة الناجمة عن إدخال الإبرة. مرحلة ما قبل التصوير ووضع آخر إبرة أمر حاسم لتحديد دقيق لموضع إبرة. ومع ذلك، يمكن أن يكون من الصعب ربط الموقف بين مواضع إبرة لاحقة بسبب التشويه الأنسجة بين القياسات. وقد تبين أن اختيار عشوائيا مواقف إبرة النتائج في تشوه النسيج كبيرا خلال إبرة. ونتيجة لذلك، تقدم هذه الطريقة التعيين المكاني أقلها دقة من IFP. على العكس من ذلك، وأداء القياسات على طول المسار الخطي عبر حجم الورم وإدخال الإبرة عرضية إلى المسار يمكن أن تحسن دقة مكانية القياسات IFP. إدخال الإبرة عرضية إلى المسار يقلل من آثار تشوه النسيج على طول اتجاه قياس المسار.

وأظهرت هذه الدراسة أن القدرة على قياس التوزيع المكاني للدوران الأوعية الدقيقة الورم، IFP وتراكم CT-الحويصلية في الورم الفردية. بعد اتقان هذه التقنيات، فمن الممكن بعد ذلك لأداء هذه القياسات بشكل مستقل أو معا لتميز المكروية الورم وآثاره على تسليم المخدرات. استخدام هذه الأساليب في نموذج طعم أجنبي الثدي MDA-MB-231 كشفت أن نضح وحجم البلازما جزء وسطاء قوية للتوزيع داخل ورمي من الجسيمات الشحمية 14. وهناك لم يتبين أنه على علاقة قوية بين IFP وتوزيع الحويصلية. ومع ذلك، فقد ارتبط IFP بقوة لقياسات من نضح الورم، مما يوحي بأن IFP قد تلعب دورا غير مباشر في التوسط توزيع الحويصلية من خلال تعديل تدفق الدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19, (12), 2577-2584 (2008).
  2. Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12, (3), 148-160 (2013).
  3. Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8, (12), e81157 (2013).
  4. Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
  5. Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24, (6), 1193-1201 (2007).
  6. Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7, (2), 243-254 (2001).
  7. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172, (1), 351-357 (2013).
  8. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
  9. Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. Springer. 241-272 (2013).
  10. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33, (9), 941-951 (2015).
  11. Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4, (10), 806-813 (2004).
  12. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
  13. Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40, (1), 011909 (2013).
  14. Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
  15. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172, (1), 351-357 (2013).
  16. Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36, (7), 2923-2933 (2009).
  17. Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37, (1), 30-51 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics