Citologia ad impressione del coperchio Area Wiper

1Centre for Contact Lens Research, University of Waterloo
Medicine

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Muntz, A., van Doorn, K., Subbaraman, L. N., Jones, L. W. Impression Cytology of the Lid Wiper Area. J. Vis. Exp. (114), e54261, doi:10.3791/54261 (2016).

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Abstract

Introduction

La palpebra superiore umano esegue circa 10.000 lampeggia ogni giorno 1, con appena un 1 - regione congiuntivale due millimetri stretta opposti del globo oculare. Grazie al suo moto di pulitura durante il lampeggio, questa porzione del margine coperchio è stata definita la regione "coperchio tergicristallo" 2. Si presume che l'attrito aumenta in questa regione durante lampeggiamento abituale, grazie al coperchio pulire il mondo. Questo può svolgere un ruolo significativo in termini di comfort oculare. Di lenti a contatto, in particolare, l'esperienza disagio oculare e questo è uno dei motivi principali per cessare l'obiettivo di usura 3. Quando una lente a contatto è posto sugli occhi, il coefficiente di attrito tra il materiale della lente e la superficie oculare ha dimostrato di cambiare 4. Ci sono prove che suggeriscono che i sintomi di secchezza potrebbero essere correlati a questo attrito alterato 2,5,6.

Questa associazione può anche tradursi in fenomeni osservabili clinicamente, in particolare coperchio wiper epiteliopatia (LWE), chiamato anche palpebra superiore margine di colorazione (ULMs) 6. LWE è un segno precoce di irritazione oculare e un potenziale fattore predittivo per la malattia dell'occhio secco. Si è osservato e misurato dalla colorazione vitale delle regioni margine coperchio superiore e inferiore. Anche se questo sistema di classificazione 2 e la sua validità clinica (ad esempio, la correlazione con i sintomi soggettivi) sono ancora in discussione, fastidio oculare rimane un enigma per i medici e gli scienziati allo stesso modo e, soprattutto, un inconveniente per i pazienti.

Ad oggi, poco si sa circa le variazioni clinicamente rilevanti nel (sotto) l'anatomia e la fisiologia cellulare del coperchio zona tergicristallo 7 e un solo rapporto fa uso di metodi citologici 8. Citologia ad impressione (IC) è stato impiegato per più di 40 anni per raccogliere le cellule dalla superficie epiteliale del bulbare o congiuntiva tarsale mediante l'applicazione di una membrana 9,10. Dopo la rimozione, le cellule aderenti subiscono ccolorazione ytological e di imaging microscopico. A causa delle differenze anatomiche e cellulari della regione tergicristallo coperchio, questa tecnica richiede l'ottimizzazione.

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Protocol

Etica dichiarazione: prima di raccogliere le cellule da soggetti umani, consenso informato e l'approvazione etica deve essere ottenuto.

1. Preparare Stain

NOTA: Preparare macchia il giorno dell'esperimento.

  1. Aggiungere 5 ml di etidio (o 4 micron) e 5 ml calceina AM (o 4 micron) a 2,5 ml di tampone fosfato salino (PBS) in 15 ml provetta da centrifuga; mescolare. Avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce e conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.

2. Le cellule Raccogliere

  1. Rimuovere gli inserti colture cellulari dalla loro confezione e un'etichetta per ogni palpebra da campionare. Mark orientamento della raccolta delle cellule sul lato del supporto in plastica a membrana usando pennarello indelebile. Comportamento fessura ispezione lampada con ingrandimento moderata (circa 20X) per confermare appropriata la salute della regione a subire IC.
  2. Erogare una goccia di anestetico topico (0,5% proparacaina cloridrato) nel sacco congiuntivale inferiore each occhio e istruire partecipante di tenere gli occhi chiusi per un minuto.
  3. Evert superiore palpebra e tenere in posizione dalle ciglia; evitare il contatto con l'area coperchio tergicristallo.
    Optional: l'aiuto di un investigatore secondaria può essere richiesto di eseguire questo passaggio.
  4. Applicare membrana perpendicolarmente sulla parte centrale della regione tergicristallo coperchio con pressione minima.
  5. Tenere membrana in posizione per 3-5 secondi. Osservare la membrana diventare trasparente nella zona di contatto. A questo punto, rimuovere delicatamente la membrana e permettere il coperchio del partecipante a "flip" al suo posto.
  6. applicare prontamente una goccia di PBS al campione, per evitare che si secchi. Membrane diventerà traslucida e non deve girare opaco in qualsiasi momento, come indica essiccazione. Avere l'investigatore secondaria a procedere immediatamente con l'elaborazione di campioni (sezione 3).
  7. Condurre controllo occhio finale per garantire l'integrità della congiuntiva. Dispensare lubrificanti oculari e istruire partecipanteper evitare di strofinare gli occhi fino a effetto anestetico svanisce (circa 15 min.).

Processing 3. Campione

  1. Utilizzando micro-forbici, tagliare la membrana a metà (la metà per ciascuna delle analisi a valle), perpendicolarmente attraverso il centro della raccolta delle cellule. Tagliare lungo il margine esterno di una metà membrana per separarlo dal supporto di plastica; evitare l'interazione con le cellule raccolte sulla membrana, tra cui quella che la membrana non si piega su se stesso.
  2. Fissare la membrana con una pinzetta prima completamente staccando dal titolare. Posizionare la membrana in etichetta provetta 2 ml contenente 500 ml di 95% (v / v) di etanolo e lasciare a fissare per un minimo di 20 minuti ad un massimo di 2 ore prima della trasformazione (paragrafo 4.2).
  3. Immediatamente separata seconda metà di membrana (come descritto nella sezione 3.2) e prontamente procedere con la sezione 4.1.

La colorazione 4. Campione

  1. Immunocytochemical colorazione
    1. Posizionare con cura la membrana su 35 mm fondo piatto cultura di vetro con il lato rivolto verso il basso di raccolta; garantire membrana è piatta.
    2. Pipettare 20 ml di composizione macchia immunocitochimica assemblato nella sezione 1 a membrana. Se riccioli campione, usare puntali monouso per appiattire con attenzione la membrana spingendo i bordi verso il basso. Evitare il contatto con le zone di raccolta delle cellule.
    3. coprire delicatamente la membrana con copertura in vetro antiscivolo. Evitare movimenti inutili di campione. Coprire con coperchio e sigillare con lab-pellicola intorno ai bordi. Non ostruire la trasparenza di piatto (in alto e in basso) e la visibilità del campione. Etichetta con pennarello laboratorio.
    4. Immediatamente procedere con l'imaging (paragrafo 5.1), poi tornare alla sezione 4.2 per continuare con colorazione citologica dell'altra metà della membrana.
  2. citologico colorazione
    1. Gradualmente idratare membrana aggiungendo lentamente 500 ml di acqua distillata al tubo used per la fissazione nella sezione 3.4. Aspirare il contenuto più volte in punta della pipetta per mescolare, quindi rimuovere il contenuto.
    2. Aggiungere 500 ml di acqua distillata. Lasciate riposare per qualche secondo, quindi rimuovere. Aggiungere 500 ml di alcian blu e lasciar riposare per 3 min. Rimuovere macchie ed eseguire 3 consecutivi acqua distillata 500 microlitri risciacqui o fino a quando il liquido risciacqua chiaro.
    3. Aggiungere 500 ml di Hematoxylin # 1 macchia e lasciare per 3 min. Rimuovere macchie e di eseguire tre consecutivi 500 microlitri risciacqui acqua distillata o fino a quando il liquido risciacqua chiaro. Disidratare (inverso del paragrafo 4.2.1) aspirando il liquido chiaro.
    4. Aggiungere 500 ml di Papanicolaou OG 6-macchia e lasciare per 3 min. Rimuovere macchie ed eseguire una 500 microlitri 95% (v / v) etanolo risciacquo.
    5. Aggiungere 500 ml di Papanicolaou EA-65 macchia e lasciare per 3 min. Rimuovere macchia ed eseguire 3 consecutivi 500 microlitri 95% (v / v) di etanolo risciacqua.
    6. Completamente disidratano utilizzando tre consecutivi 500 microlitri 100% risciacqui etanolo. utilizzando tweEzers, rimuovere il campione dalla soluzione; evitare le zone di raccolta delle cellule commoventi.
    7. Posizionare la membrana sul vetrino; assicurare che la linea di raccolta delle cellule è parallelo o perpendicolare scorrere margine per facilitare l'allineamento durante l'imaging.
    8. Applicare una goccia di 100% di etanolo e coprire con slip in vetro. Immediatamente procedere con l'imaging (paragrafo 5.2).

Imaging 5. Campione

  1. Imaging fluorescenti immunocitochimiche Macchie
    1. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser (CLSM) 11 o microscopio a fluorescenza 12, dotato di una fotocamera digitale a colori, collegato a un computer che esegue un software di acquisizione delle immagini. Grazie ai campioni essendo contenuto all'interno piastre di coltura, un microscopio invertito può essere necessario.
    2. Impostare microscopio 11,12 secondo assorbimento ed emissione spettri di etidio omodimero-1 (528/617 nm maxima Ex / Em in presenza di DNA) e calceina AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
    3. Selezionare l'ingrandimento più basso del microscopio (ad esempio, oggettiva 2.5X) e attivare il sistema di imaging digitale; osservare il campione visualizzata sul monitor del computer.
    4. Controllare campione per le caratteristiche cellulari di interesse.
    5. Selezionare l'ingrandimento del microscopio desiderato e di acquisire le immagini utilizzando il software di imaging.
    6. Salvare i file sia in formato di file microscopio nativo o un formato di file non compresso (ad esempio, * .raw, * .tiff).
  2. Imaging citologico Macchie
    1. Utilizzare un microscopio standard di laboratorio in campo chiaro senza filtri, dotato di una fotocamera digitale a colori, collegato a un computer che esegue un software di acquisizione delle immagini.
    2. Luogo e vetrino di blocco (dal punto 4.2.8) sul palco microscopio. Reidratare campione con 100% di etanolo come necessario, durante l'intera procedura di imaging.
    3. Selezionare l'ingrandimento più basso del microscopio (ad esempio, oggettiva 2.5X) e attivare °sistema di imaging digitale e; osservare il campione visualizzata sul monitor del computer.
    4. raccolta delle cellule Garantire è allineato con entrambi gli assi X o Y del controllo palco microscopio. Regolare, se necessario, rimuovendo il vetrino e ruotando il campione con un puntale o di una pinzetta.
    5. Utilizzando il software di imaging, cattura di immagini (s) dell'intero campione con il più basso di ingrandimento del microscopio.
    6. Passare a un ingrandimento al microscopio moderata (ad esempio, 10 - 20X obiettivo) e regolare fonte di luce microscopio e parametri di imaging software (esposizione, contrasto, bilanciamento del bianco, ecc), e disabilitare il controllo del software automatizzato. Salvare queste impostazioni per un utilizzo futuro.
    7. Determinare inizio e fine i punti di scansione (ad esempio, in alto a sinistra e angoli basso a destra della raccolta delle cellule).
    8. Utilizzando il software di imaging, cattura di immagini (s) di tutta l'area di raccolta delle cellule all'interno dei punti iniziale e finale. Garantire un 20% side-to-side e top-to-bottom sovrapposizione between tutte le immagini adiacenti.
    9. Salvare i file utilizzando il formato di file nativo del microscopio o un formato di file non compresso (ad esempio, * .raw, * .tiff).
    10. Genera immagine panoramica finale utilizzando software automatici di cucitura di scelta (ad esempio, Adobe Photoshop Elements). Utilizzare immagini di riferimento prese a passo 5.2.5) per confermare l'accuratezza delle cuciture automatizzata nell'immagine finale.

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Representative Results

La membrana coltura cellulare attraversato tutto il supporto di plastica è un comodo strumento per la raccolta portatile delle cellule epiteliali della congiuntiva coperchio tergicristallo. Questo metodo elimina la necessità di strumenti sterilizzati supplementari tipicamente usati per preparare e gestire membrane IC. Figura 1 illustra la IC dell'area tergicristallo coperchio usando un inserto di coltura cellulare. Abbiamo ottimizzato due diversi protocolli di colorazione che si completano l'un l'altro per caratterizzare le cellule epiteliali dalla zona tergicristallo coperchio in un romanzo di moda. Fluorescenti coloranti immunocitochimica rivelano attività esterasi, un indicatore della vitalità cellulare, e acidi nucleici, la colorazione dei quali riflette compromesso membrana cellulare, come mostrato in Figura 2. Il protocollo di colorazione citologica permette una sottile distinzione tra cheratinizzazione gradi. La Figura 3 mostra la transizione tra bassi cheratinizzazione nella congiuntiva tarsale e cheratina avanzatazazione nel tergicristallo congiuntiva e epidermide coperchio. immagini panoramiche di collezioni di cellule citologia macchiate permette l'analisi di tutta l'area di raccolta, al contrario di una regione selezionata di interesse. La risoluzione dell'immagine è sufficiente per lo zoom al livello del nucleare; morfologia cellulare può essere determinata con precisione. La Figura 4 mostra l'immagine finale di una raccolta di cellule citologicamente macchiato, cucite insieme usando circa. 100 file ad alta risoluzione separati. Questi strumenti possono essere utilizzati per valutare gli effetti di attrito e / o occhio secco in un modo nuovo.

Figura 1
Figura 1. citologia ad impressione del coperchio Wiper zona. Citologia ad impressione effettuata sulla regione coperchio tergicristallo esposta dal eversione della palpebra superiore. Membrana utilizzata è la cellula Cultura Inserisci, 12 mm, PTFE idrofilo. Nota le linguette del titolare della membrana, che può essere trattenuta (a differenza di prestudi cedenti sulla congiuntiva bulbare, in cui sono stati rimossi prima dell'applicazione) in quanto non interferiscono con l'applicazione della membrana sul margine palpebrale stretta e possono effettivamente aiutare l'allineamento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. cellule fluorescenti dal coperchio Wiper Regione. Laser confocale a scansione microscopio che mostra la variazione della morfologia delle cellule tra grandi cellule squamose (A) e le più piccole cellule colonnari / cubico (b). Verde fluorescenza della calceina AM indica attività esterasi nel corpo cellulare (vale a dire, vitalità cellulare). fluorescenza rossa di etidio rivela acidi nucleici, indicando compromesso membrana cellulare. Poche cellule mostrano verde intenso e senza fluorescenza rossa, possibilmente in tive, di integrità della membrana cellulare (c). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. citologico colorazione di IC del campione. Le cellule della regione spettacolo coperchio tergicristallo varia morfologia e diversi gradi cheratinizzazione. colore blu di piccole, colonnari e cubico cellule con grandi nuclei, che si trovano nella congiuntiva marginali / tarsale, indica l'assenza di cheratinizzazione (a); rosso / arancio macchia di grandi cellule squamose con nuclei condensati della giunzione muco-cutanea (Linea MCJ / Marx ') e anuclear cellule dell'epidermide rappresenta cheratinizzazione avanzato (c). colore di transizione (rosso / blu) e la morfologia delle cellule del tergicristallo zona congiuntivale coperchio suggeriscono di cheratinizzazione limitati (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Immagine composita di coperchio Wiper cellulare Collection. Citologia ad impressione della zona tergicristallo coperchio dopo la colorazione citologica. Immagine cucite insieme usando circa. 100 singole foto scattate con un microscopio e l'obiettivo 20X. (A) Piccolo colonnare / cubica cellule epiteliali del tarsale / congiuntiva marginale. Cellule qui esibiscono / / colore viola verde blu che indica non cheratinizzazione; (B) le cellule della congiuntiva coperchio tergicristallo, transitorie morfologia e macchia di colore tra regioni (a) e (c); (C) grandi cellule squamose della giunzione linea / Marx 'muco-cutanea. Arancione macchia di colore indica un certo grado di cheratinizzazione, e rosso / rosa indica la fase avanzata di transizione squamose; (D) meibum impressione; (E) anuclear, cellule corneo dell'epidermide; (F) Gimpressione cellule oblet o mucine film lacrimale. Freccia verso il basso indica un'area congiuntivale tarsale, freccia verso l'alto indica coperchio esterno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Citologia ad impressione viene in genere eseguita sulla congiuntiva bulbare, utilizzando cellulosa misto membrane estere. I campioni sono tagliati a misura da fogli di materiale alla rinfusa, sterilizzati, applicati e rimossi dalla superficie congiuntivale con pinze. Utilizzando lo stesso materiale della membrana, un dispositivo IC pistone controllato è stato recentemente progettato per abbinare la geometria della superficie della congiuntiva bulbare, e mantenere la pressione costante tra le applicazioni 13. Questi approcci sono inefficienti per la stretta, il coperchio ben visibile curva tergicristallo regione (vedi Figura 1). Inoltre, cellulosa mista membrane estere non forniscono la necessaria trasparenza nelle situazioni in cui è necessario, in campo chiaro microscopia per allineare i campioni prima di imaging a fluorescenza. Gli inserti colture cellulari proposti in questo protocollo sono convenienti perché sono sterilizzati, idealmente dimensioni e possono essere gestite manualmente, senza ulteriori attrezzature, garantendo collezioni rapidi. Le membrane sono realizzateidrofila PTFE, che fornisce un'adeguata trasparenza per l'analisi al microscopio confocale.

Nel complesso, le caratteristiche morfologiche delle cellule raccolte coincidono con precedenti relazioni di letteratura 7,8,14,15. Sostituzione del comunemente usato acido Schiff-macchia (e cromaticamente molto intenso) periodica (PAS) con il blu Alcian consente per le successive coloranti Papanicolaou per visualizzare la variazione cromatica più fine, consentendo una prospettiva più dettagliata a livello cheratinizzazione cellulare, che ha riferito prima 7,8.

immagini al microscopio di campioni citologici di solito comporta l'ispezione visiva attraverso gli oculari, e ad alto ingrandimento fotografia delle strutture ritenute "di interesse". Con questo approccio, gli aspetti "quadro più ampio" della intera collezione può essere perso. Colpi di basso ingrandimento sono in genere di qualità ottica inferiore (a causa di vignettatura, aberrazioni, etc.) e la risoluzione non è sufficiente a descrivere i dettagli cellulariS. Il protocollo panoramica cuciture qui proposta, mentre leggermente più tempo, è vantaggioso, in quanto fornisce una panoramica della membrana integrale, così come la capacità di ingrandire particolari nucleari, tutto in una sola immagine. Metriche quantitative, come il conteggio delle cellule, nucleare-citoplasmatica (NC) il rapporto 16 e le distanze possono essere calcolate qui.

Ci sono tre fasi critiche all'interno del protocollo che richiedono particolare attenzione: la corretta applicazione della membrana sulla congiuntiva (sezione 2.4), i tempi tra fasi di lavorazione del campione (sezioni 2,6 e 3 a 5) e parametri di imaging coerenti per cuciture panoramica ottimale (paragrafo 5.2 .6 - 5.2.8). A differenza della congiuntiva bulbare relativamente piatto, il coperchio tergicristallo regione ha una curvatura pronunciata, che coprono una larghezza ridotta di soli 1-2 mm tra epidermide e solco tarsale. È essenziale che la membrana applicata la giusta angolazione, come questo può influenzare notevolmente il tipo di cellule raccolte. In secondo luogo, mempressione membrana deve essere coerente tra le applicazioni. L'investigatore deve quindi sviluppare la manualità necessaria per garantire collezioni ripetibili. Una volta che i campioni sono raccolti con la tecnica citologia impressione, i tempi di lavorazione diventa cruciale. I campioni non devono mai essere permesso di asciugare, vale a dire, la membrana non deve diventare opachi (sezioni 2.6, da 3 a 5). Mentre il campione di sottoporsi colorazione citologica può essere lasciato nel fissativo per un tempo prolungato (20 min - 2 ore), devono essere aggiunte le macchie di immunocitochimica e ripreso immediatamente, per valutare la vitalità cellulare con la massima precisione possibile. La coerenza dei tempi è anche essenziale per ottenere risultati comparabili tra i campioni; si dovrebbe mirare a mantenere i tempi di fissaggio e di colorazione uguale per tutti i campioni da confrontare. Infine, al fine di ottenere immagini panoramiche qualitative del campione citologico, tutti i parametri di imaging (microscopio intensità luminosa, esposizione fotocamera, contrasto, bilanciamento del bianco, ecc)dovrebbe essere tarato per una regione rappresentativa del campione, con la più alta diversità delle caratteristiche di interesse (ad esempio, tipi di cellule), e tutta la misurazione automatizzata essere disabilitata per gli scatti successivi (sezione 5.2.6). Lo sperimentatore deve anche mirare a orientare la raccolta delle cellule, in linea sia con l'asse X o Y del palco microscopio. Ciò faciliterà l'acquisizione delle immagini e processo di cucitura. Lo scopo di individuare e utilizzare caratteristiche distintive sul campione (ad esempio, cerotti cellulari, meibum, detriti, etc.) nelle regioni di sovrapposizione tra immagini adiacenti. La messa a fuoco del microscopio dovrebbe essere l'unica regolazione da correggere tra gli scatti.

Il limite di questa tecnica risiede nella variabilità delle raccolte di cellule, come originariamente osservato da Jalbert 8, che ha riportato un tasso di successo del 67% nell'ottenere chiazze confluenti di cellule coperchio tergicristallo. L'angolo di applicazione determina il numero e il tipo di cellule raccolte. In questa fase è incerto wqualità della captazione he (ad esempio, numero di cellule sul campione) è correlata con la salute oculare. Gli studi clinici con campioni di dimensioni più grandi sono necessari per dimostrare la validità di questa tecnica. Un ulteriore inconveniente risiede nel invasività intrinseca della tecnica IC stesso. Gli strati di cellule superiori sono forzatamente rimossi dalla congiuntiva e questo può indurre danni. Mentre le macchie immunocitochimiche sono destinati a riflettere vitalità cellulare (e l'attività esterasi è presente in tutte le collezioni), non è chiaro quale la fluorescenza rossa dei nuclei cellulari nelle nostre collezioni indicare. Occasionalmente, meibum (cioè, lipidi secreti al margine palpebrale) e altri componenti dalla superficie oculare o film lacrimale tenderanno a coprire funzioni cellulari e rendere analisi difficile o impossibile. Il protocollo può essere modificato con un risciacquo supplementare in xilene per rimuovere i lipidi meibum. Infine, l'effetto di gocce anestetiche sulle cellule congiuntivali è sconosciuto.

Ottenere dati della struttura cellulare della regione coperchio tergicristallo facilitare la verifica della correlazione tra l'attrito che si verifica tra queste cellule e la superficie oculare, e comfort personale. Ciò fornirà preziose conoscenze e permettere futuri studi clinici per esplorare le particolarità cellulari di portatori di lenti a contatto, i soggetti con coperchio tergicristallo epiteliopatia, degli occhi o secchezza sintomi secco, a differenza di soggetti asintomatici, di gettare spera luce sul tema del disagio oculare.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid Sigma B8438-250ML
Hematoxylin, Gill 1 Sigma GHS116-500ML
Papanicolaou stain, OG-6 Sigma HT40116-500 ml
Papanicolaou stain, Modified EA Sigma HT40232-1L
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Life Technologies L-3224 contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes
Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) Alcon
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm EMD Millipore PICM01250 
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-0-20-C

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References

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