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1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

Medicine

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Summary

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

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Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

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Abstract

Introduction

Diabetes abarca un conjunto de trastornos que comparten el punto final de la homeostasis de la glucosa alterado común. Aunque los mecanismos patogénicos de los subtipos de diabetes son distintos, comparten la consecuencia de una disminución de la masa de células β, es decir, la pérdida de la capacidad de producción de insulina 1,2. Actualmente, las estrategias de tratamiento de la diabetes dependen de la administración crónica de insulina exógena, la estimulación farmacológica de la producción de insulina o mejora de la sensibilidad a la insulina, y rara vez, el trasplante de islotes pancreáticos o todo el páncreas 3,4. Lamentablemente, el éxito de estas estrategias es de corta duración y / o falla de recapitular suficientemente la función de producción de insulina endógena. A pesar de la utilidad de desarrollar un método para estimular la regeneración de las células β, no existe tal enfoque. En consecuencia, un importante objetivo de la investigación de la diabetes es el desarrollo de métodos para generar nuevas células ß o para ampliar la masa de células β endógena-5 6,7. Es importante destacar que la fuente predominante de nuevas células beta in vivo es preexistentes células beta en lugar de células progenitoras especializados 8,9. Aunque las células beta parecen tener la capacidad de replicación limitado, un pequeño aumento en la masa de células β (~ 30%) puede ser suficiente para restaurar la homeostasis de la glucosa en muchos diabéticos. Además, en la estimulación farmacológica in situ de la masa de células β es una estrategia de tratamiento potencialmente barata y escalable. En este documento se presenta un método de cribado de alto contenido para identificar y caracterizar moléculas pequeñas que estimulan el crecimiento de las células β.

Una variedad de métodos experimentales in vitro se puede utilizar para identificar productos génicos y / o moléculas that Promover la replicación de las células β primaria. Los primeros esfuerzos para medir la inducción de la replicación de las células β utilizan cultura roedor páncreas fetal o cultivos aislados de los islotes intactos para medir [3 H] timidina, incorporación de BrdU o cuerpos mitóticas dentro de la aldehído-tionina o población manchado insulina en respuesta a las condiciones de tratamiento específicas 10, 11. Estos enfoques in vitro y las ligeras variaciones de los mismos tienen varias limitaciones. Deficiencias prominentes incluyen (1) el uso de células fetales que, a diferencia de las células ß maduros, muestran una alta tasa de replicación de células β basal y son el crecimiento regulado de una manera distinta 12; (2) la naturaleza subjetiva de la adjudicación experimentador dependiente de los eventos de replicación de las células β; (3) la mano de obra y la naturaleza intensiva tiempo de conteo experimentador dependiente de los eventos de replicación de las células β retarda rendimiento experimental; (4) el uso de la incorporación / mancha / apariencia nuclear para identificar la replicación inclusots y una mancha citoplasmática que no se superponen para identificar las células beta conduce a la atribución errónea de los eventos de replicación no de células β próximas a las células beta.

Más recientemente, las células beta primarias maduras se han utilizado para evaluar el impacto de los transgenes sobre-expresión, así como el tratamiento de productos de genes o compuesto sobre la replicación de las células β 13-16. Sin embargo, estos estudios también se han basado en el conteo subjetiva de los eventos de replicación, staining- citoplasmática o no específicos métodos para la identificación de células β y / o pasos de trabajo intensivo que limitan el rendimiento, por ejemplo, placas individuales deslizable pocillo de células o islotes intactos inclusión en parafina y procesamiento 17. En particular, una metodología de selección replicación de las células β humano basado en imágenes, similar a la presentada en el presente documento, se ha publicado 18; Sin embargo, el uso con éxito de este ensayo no se ha demostrado y el uso de islotes humanos para el cribado primario puede no ser ampliamente FEAsible.

Una estrategia alternativa para la identificación de sustancias que promueven la replicación es evaluar la inducción de crecimiento de líneas de células β. Los esfuerzos iniciales se utilizan transformadas beta líneas celulares tales como células o MIN6 INS 832/13-células 14,19-21. Sin embargo, estas líneas celulares demuestran un crecimiento incontrolado y se parecen poco a las células ß bien diferenciados 22. En consecuencia, la capacidad de crecimiento de la inducción es mínima, de relevancia claro ya veces difícil de recapitular. Una estrategia mejorada para la detección basada en la línea celular utiliza "reversible transformado" células que son el crecimiento detenido en ausencia de tetraciclina (doxiciclina) la expresión del antígeno SV40 T dependiente de 23,24. Sin embargo, no está claro si estas células vuelven a un estado de células β-como "normal" tras la eliminación de doxiciclina. Desafortunadamente, el uso de estas células ha producido compuestos que promueven el crecimiento generalizadas que no parecen tener utilidad inmediata24. En general, el uso de líneas celulares para estudiar la regulación del crecimiento de un tipo de célula que muestra la actividad de replicación espontánea mínimo puede tener una aplicabilidad limitada.

La replicación de plataforma de cribado de células β presentada en este documento utiliza células beta de rata primaria maduros para retener en la regulación del crecimiento in vivo en la medida posible, los cultivos de células de los islotes de la composición de tipo de células mixtas para permitir la identificación de las actividades promotoras del crecimiento de linaje restringido, multi -bien formato a maximizar el rendimiento y análisis automatizado para eliminar los prejuicios y facilitar el rendimiento. El uso exitoso de esta plataforma ha permitido la identificación de varios compuestos que promueven la replicación de las células β 25,26. Además, el ensayo se ha utilizado para los estudios de relación estructura-actividad y experimentos de epistasis químicos para proporcionar información mecanicistas sobre la regulación molecular de la replicación de las células β. La plataforma presentada fue adaptado con éxito foinvestigación basada en RNAi r lentiviral de replicación de las células β vías 25. Limitaciones de la de ensayo incluyen escalabilidad restringida (uso de células primarias), el uso de roedores en lugar de los islotes células humanos (aunque el ensayo puede ser adaptado para estudios de los islotes humanos), los gastos asociados con la formación de imágenes basada en anticuerpos y la utilización de los islotes primaria, el uso de islotes dispersos (arquitectura islote interrumpido) para facilitar la adquisición de imágenes automatizado y la dependencia de la disponibilidad de un microscopio automatizado con adquisición de la imagen y la capacidad de análisis. Aunque un fácil en metodología de selección in vivo para la identificación de productos génicos o compuestos que estimulan la regeneración de las células β in situ sería ideal, una plataforma de este tipo todavía no está disponible 27. En consecuencia, la plataforma se ha descrito es apropiado para el investigador interesado en la investigación de la mayoría de los aspectos de la replicación de las células β.

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Protocol

Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. El protocolo descrito se escala para el aislamiento de los islotes de seis 250-300 g (8 - 9 semanas de edad) ratas macho Sprague Dawley, que es suficiente para generar 228 pocillos de una placa de 384 pocillos para la evaluación de la replicación de células de los islotes.

1. Preparación de materiales

  1. Preparar los medios de recubrimiento antes de iniciar el aislamiento de islotes mediante la recopilación de los medios condicionados de células de carcinoma de vejiga de rata 804G mantenidas en confluencia durante 3 días (20 ml de RPMI1640) en un 15 cm placa de cultivo tisular 28. Filtro estéril y almacenar (-20 ° C) los medios acondicionados para su uso posterior.
  2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos (de 12 cm tissue forceps dentadas, uno de 11,5 cm tijeras finas, uno de 14,5 cm tijeras quirúrgicas, dos de 16 cm pinzas curvas, uno de 12 cm hemostato curvado, un mango de bisturí 12 cm) y un tamiz de tejido de malla 30 antes de initiating aislamiento de islotes.
  3. Preparar la solución de la digestión pancreática mediante la disolución de un 60%: mezcla de 40% de la clase I purificada: Clase de colagenasas II (actividad colagenasa total de 300.000 - 400.000 unidades) en 60 ml de solución salina equilibrada de 1x Hanks (HBSS), complementado con calcio y magnesio. Cargar 10 ml de tampón de digestión pancreática en jeringas de 10 ml (seis) con un 1 "22 G aguja y el lugar en el hielo.
    Nota: se inyecta 10 ml de solución de digestión por rata. Escalar en consecuencia.
  4. Preparar 4,5 ml de cóctel anestésico en una campana ventilada mediante la mezcla de 1,3 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,2 ml de xilazina (100 mg / ml) y 3 ml de PBS. Preparar el cóctel anestésico dentro de 1 hora de iniciar el aislamiento de islotes.
  5. Preparar el tampón de lavado mediante la adición de 25 ml de suero de ternero recién nacido a 500 ml de HBSS. Coloque tampón de lavado en hielo para su uso posterior.
  6. Preparar 1 botella de medio de islotes que está a 500 ml de glucosa baja de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 50 ml de suero bovino fetal (FBS), 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 g / ml de estreptomicina.
  7. Preparar medio función de los islotes a partir de solución funcionalidad / viabilidad (500 ml) con 2% de FBS, glutamina 2 mM, glucosa 5 mM, 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 g / ml de estreptomicina. Almacenar los medios función de los islotes (4 ° C) para su uso posterior.
  8. Preparar 40 ml de tampón de bloqueo mediante la adición de 2,5 ml de suero de burro y 0,12 ml de Triton X-100 a 37,38 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). memoria intermedia de almacenamiento de bloqueo (4 ° C) para su uso posterior.
  9. Obtener los anticuerpos necesarios antes de iniciar el protocolo.
    Nota: PDX-1 (TRITC) y Ki-67 (FITC) co-tinción se utiliza para el cribado primario replicación de las células β. Para el análisis de la replicación del linaje específico, lleve a cabo la tinción de inmunofluorescencia de marcadores adicionales de identidad celular (insulina, glucagón, somatostatina o vimentina; TRITC), junto con nuclear (DAPI), PDX (Cy5) y Ki-67 (FITC) tinción. representante alternativamarcadores publica-, por ejemplo, PCNA, también se pueden utilizar.
  10. Preparar un plan de tratamiento 228 pocillos con cada condición de tratamiento realizado por cuadruplicado. Incluir (5-iodotubercidin [1 M] o dipiridamol [15 mM]) y el vehículo de control por chispa (DMSO 1: 666 dilución) pozos.

2. La perfusión del páncreas

  1. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de solución cóctel anestésico diluido (0,30 ml / 100 g de peso corporal). Una vez que la rata es totalmente anestesiado y no responde a los estímulos nocivos, realice dislocación cervical.
  2. Coloque la rata sacrificados en la posición (orientación cráneo-caudal) en posición supina sobre una pila de toallas de papel y rociar la zona abdominal con un 70% de etanol.
  3. Abra la cavidad abdominal con una incisión en U (base en la región púbica) y retraer la piel en la dirección rostral sobre el pecho para exponer la cavidad abdominal.
  4. agarrar con cuidado el duodeno mediante dos pares de pinzas curvas, busque la entrada del duodeno b comunesile conducto (esfínter de Oddi) y la abrazadera de la abertura en la papila duodenal con una pinza hemostática curva.
  5. Levante la pinza hemostática curva utilizado para sujetar el conducto biliar común papila y agarrar el conducto biliar cerca de hígado usando un fórceps curvos. Utilice una disección roma con las pinzas curvas para aislar y exponer el conducto biliar.
  6. Cambiar la posición de la rata con los extremos proximal cabeza y los pies distal.
  7. Cannulate el conducto biliar común (CDB) en o justo distal a la unión de los conductos hepáticos y quísticas comunes con una solución de digestión pancreática RESORTE jeringa de 10 ml y se inyecte lentamente 10 ml de la solución de digestión pancreática. Mientras se inyecta, apoyar la CDB con un mango de bisturí. Cambiar la posición de la aguja si el conducto y el páncreas no pueden inflarse.
  8. Retire el páncreas inflados utilizando las pinzas curvas y tijeras finas para separarlo del colon descendente, los intestinos, el estómago y el bazo. Coloque el páncreas inflados en hielo en un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de Nota: Para obtener el máximo rendimiento de los islotes, recoger todos los páncreas a los 30 minutos y el lugar sólo 1 o 2 páncreas en cada tubo de 50 ml digestión.

3. La disociación de la Páncreas

  1. Una vez recogidos todos los páncreas, coloque los tubos de digestión en un baño de agua a 37 ° durante 15 minutos. Hacer girar suavemente los tubos de cada 3 min.
  2. Después de 15 minutos, agitar vigorosamente (verticalmente) los tubos 10 veces y añadir 10 ml de tampón de lavado en frío. Agite vigorosamente los tubos de un adicional de 5 veces y colocar en hielo.
  3. Llenar los tubos de digestión a 50 ml con tampón de lavado frío y mezclar invirtiendo los tubos 5 veces.
  4. Centrifugar los tubos a 97 xga 4 ° C durante 1 min y se vierte el sobrenadante. Tenga cuidado de no desplazar el tejido granulado.
  5. Añadir 25 ml de tampón de lavado y resuspender el tejido mediante agitación suave. Repita los pasos 3.4 y 3.5 dos veces más.
  6. Colocar un tamiz de tejido de malla 30 sobre un sterile 250 ml vaso de precipitados y se vierte la suspensión de tejido en el tamiz. Enjuague el tubo de digestión con un adicional de 20 ml de tampón de lavado y se vierte sobre la malla. Los tejidos pancreáticos y grasa no digerida se eliminan en este paso.
  7. Verter el material filtrado en dos frescos tubos de 50 ml y sedimentar el tejido centrifugando a 97 xg durante 1 min a 4 ° C. sobrenadante e invierta los tubos de decantación para drenar el exceso de tampón.

4. Purificación de islotes

  1. Añadir 20 ml de solución de diatrizoato frío polisucrosa / de sodio (1,119 g / ml de densidad) para el tejido pancreático se sedimentaron. Homogéneamente volver a suspender el contenido de cada tubo pipeteando suavemente arriba y abajo cinco veces.
  2. superponer suavemente la solución de diatrizoato polisucrosa / sodio con 10 ml de HBSS. Mantener una interfaz líquida aguda añadiendo poco a poco el HBSS a lo largo de la pared del tubo.
  3. Centrifugar los páncreas digeridos en 560 xg durante 15 min (4 ° C) con una aceleración lenta y no freno.
  4. Collect la capa islote de la interfaz mediante una pipeta 10 ml islotes y en lugar fresco tubos de 50 ml. No aunar islotes en esta etapa.
  5. Añadir 40 ml de tampón de lavado a cada tubo de 50 ml y centrifugado durante 1 min a 140 xga 4 ° C.
  6. Verter el sobrenadante y volver a suspender los islotes agrupados en 50 ml de tampón de lavado por inversión de los tubos varias veces. Centrifugar los tubos durante 1 min a 97 xg a 4 ° C para recoger islotes en un pellet.
  7. Retirar el tampón de lavado y repetir el lavado. Llevar islotes en la campana de cultivo de tejido y aspirar el sobrenadante.
  8. Vuelva a suspender cada tubo de islotes en 6 ml de medio de los islotes.
  9. La transferencia de los islotes de cada tubo de 50 ml en un pozo de seis pocillos placa de cultivo tisular. Agitar el plato de 6 pocillos para recolectar los islotes en el medio de la así y observar la calidad de los islotes y la pureza bajo un microscopio.
  10. recolectar manualmente islotes utilizando una pipeta de 1 ml y transferir los islotes recogidos en el adyacenteasí que contiene 6 ml de medio de los islotes. se consigue Repita remolino islote y recoger hasta> 90% de pureza.
  11. La transferencia de los islotes purificados a un 10 cm placa de cultivo tisular que contiene 20 ml de medio de los islotes.
  12. Coloque los islotes en un incubador de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% de CO 2) durante la noche (Figura 1A).
  13. En la preparación de placas células de los islotes, capa los pocillos de una placa de 384 pocillos con 40 l de 804G medio acondicionado por pocillo. Incubar toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos.

5. Dispersión y Chapado de células de los islotes

  1. El día siguiente, separar suavemente islotes de la placa de 10 cm con un rascador de células y la transferencia de los islotes en un tubo de 50 ml.
  2. Se precipitan los islotes por centrifugación durante 1 min a 22 xg a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante.
  3. Lavar los islotes con 20 ml de PBS caliente y decantar como anteriormente.
  4. Vuelva a suspender los islotes en tripsina al 0,25% (150 l por páncreas de rata) Y se incuba a 37 ° C durante 10 min. Pipeta islotes arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta 1 ml al cabo de 5 y 10 minutos de incubación.
  5. Después de 10 min, evaluar una muestra de 20 l de los islotes tratadas con tripsina bajo el microscopio para asegurar la digestión completa y para contar las células de los islotes usando un hemocitómetro. Si no digeridos permanecen islotes, continuar la incubación durante otros 3 - 5 min y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces más. Repetir si es necesario.
    Nota: El rendimiento típico es de ~ 125.000 - 150.000 islotes células por rata.
  6. Retire 804G acondicionado placa de 384 pocillos recubiertas de los medios de comunicación de la incubadora y retirar el medio utilizando un aspirador de 12 pocillos múltiples.
  7. Suspender las células de los islotes a una densidad de 45.000 células por ml en medio de función de los islotes y la placa 70 l (3.150 células) por pocillo con una pipeta multicanal (Figura 1B).
    Nota: Puesto que las células ß, situados en los pocillos exteriores tienden a migrar hacia el perímetro de la placa de uso de filas C a N y columnas 4a 21 a la placa 228 pocillos con las células de los islotes aislados de 6 ratas.
  8. Colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas para permitir la adhesión celular.

6. Cultura-El tratamiento de células insulares, fijación y la tinción

  1. Preparar 200 l de vehículo y compuestos (condiciones de tratamiento se realizan por cuadruplicado) a una concentración 2x en medio función de los islotes. Organizar compuestos en una placa de 96 pocillos estéril para facilitar el pipeteado de múltiples pocillos.
  2. Retirar con cuidado medio islote con un aspirador de 12 pocillos múltiples y reemplazar con medio función de los islotes (35 l / pocillo) usando una pipeta de 12 pocillos. Quitar y reemplazar los medios de comunicación de una fila a la hora de limitar el riesgo de secado (Figura 1C).
  3. Iniciar el tratamiento mediante la transferencia de 35 l / pocillo de las soluciones de compuesto 2X. Volver placa a la incubadora durante la duración del tratamiento 48 hr.
  4. Después de 48 horas de tratamiento, se decanta el medio de tratamiento invirtiendo la placa. </ Li>
  5. Lave suavemente las células de los islotes con 50 l por pocillo de PBS 1x (1 min). Añadir la PBS usando una pipeta multicanal.
  6. Decantar el PBS y fijar las células mediante la adición de 50 l por pocillo de frío 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS 1x. Se incuban las células durante 15 min a 4 ° C.
  7. Se lavan las células tres veces (5 minutos cada uno) invirtiendo la placa para quitar el PFA y añadiendo con cuidado 60 l de PBS por pocillo como anteriormente.
  8. Preparar la solución de recuperación de 15 ml de antígeno mediante la mezcla de 14,25 ml de formamida y 0,75 ml 0,15 M de citrato de sodio (pH 6). Hacer que la solución de recuperación de antígeno inmediatamente antes de su uso.
  9. Retirar PBS de los pozos invirtiendo la placa y añadir solución de recuperación de antígeno 60 l a cada pocillo. Calentar la placa de 70 ° C baño de agua durante 45 minutos. Colocar un bloque de calentamiento en la parte superior de la placa durante la incubación para evitar deformaciones de la placa de múltiples pocillos.
    Nota: El agua debe estar a media altura del faldón placa; la placa no debe ser sumergido.
  10. Se lavan las células con 60 l por pocillo de PBS 1x tres veces (5 minutos cada uno). Añadir PBS con una pipeta multicanal y decantar PBS invirtiendo la placa.
  11. Utilizar una pipeta multicanal para añadir 40 l por pocillo de tampón de bloqueo y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Retire el tampón de bloqueo por inversión de la placa y decantación.
  12. Añadir 40 l de ratón anti-humano Ki-67 (1: 200) y de cabra anti-humano PDX-1 (1: 100) anticuerpos diluidos en tampón de bloqueo a cada pocillo y se incuba a 4 ° C durante la noche.
  13. El día siguiente, se decanta la solución anti-cuerpo y lavar las células con PBS 1x tres veces (5 minutos cada uno) como se describe anteriormente. Decantar el PBS.
  14. Añadir 40 l por pocillo de diluido (1: 200) burro biotinilado anti-IgG de ratón y de burro conjugado con rodamina IgG anti-cabra en tampón de bloqueo. Incubar durante 1 horaa temperatura ambiente.
  15. Se lavan las células con PBS 1x tres veces, 5 minutos cada uno. Añadir 40 l de diluido (1: 400 en tampón de bloqueo) conjugado con fluoresceína estreptavidina a cada pocillo. Incubar 30 min a temperatura ambiente.
  16. Se lavan las células con PBS 1x tres veces, 5 minutos cada uno. Añadir 40 l por pocillo de DAPI (300 nM en tampón de bloqueo) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
  17. Lavar las células con PBS 1x dos veces y dejar las células en 40 l de 1x PBS. La placa es ahora listo para ser analizado.

Análisis de replicación 7. β-Cell

Nota: Debe establecerse un protocolo de ensayo para el cribado de alto contenido de microscopio utilizado para medir la replicación de las células β. En su composición simple, este protocolo es un ensayo de dos colores, donde se utiliza un marcador de identidad para definir las células ß (PDX-1 + -Cells) y un marcador de la replicación (Ki-67) se utiliza para definir los eventos de división celular.

  1. Identificar objetos (células beta) en base a la average intensidad de fluorescencia de PDX-1 tinción (549 nm filtro) dentro de un círculo aproximado (longitud: anchura <1.6) dentro del área de píxeles esperado de un núcleo de células β (Figura 2A).
  2. A continuación, establezca la configuración para identificar los eventos de replicación (Ki-67-positividad) con base en la intensidad media de fluorescencia (485 nm filtro) dentro de la PDX-1 + área (Figura 2B).
    Nota: Los tiempos de exposición deben fijarse para permitir comparaciones de intensidad de pixel a través de imágenes. parámetros del protocolo de ensayo se ajustan de tal manera que las llamadas máquinas excluyen sistemáticamente las manchas, los desechos celulares y agregados no específicos que podrían afectar negativamente a la calidad de los datos.
  3. Analizar un mínimo de 500 células beta por pocillo para maximizar la precisión y el límite de variabilidad.
    Nota: Se espera que el índice de replicación de las células β basal en las culturas de los islotes de rata a ser de 0,5 - El 3%. Por lo general, 40 imágenes por así es más que suficiente para identificar a 500 células ß.
  4. Antes de analizar latoda la placa, analizar negativo- seleccionado (tratado con DMSO) y control positivo (5-iodotubercidin [1 M] o dipiridamol [15 mM]) tratados con pozos para evaluar la validez del protocolo de ensayo. Cuando el ensayo se establece correctamente, los compuestos de control positivo inducen al menos un aumento de dos veces en el porcentaje de la replicación de las células ß.
  5. Leer toda la placa una vez que el protocolo de ensayo se valida.

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Representative Results

Para evaluar las células β o la replicación de células α, se requiere un protocolo de ensayo de cuatro colores. En primer lugar, los objetos se identifican mediante tinción DAPI (Canal 1, 386 nm). A continuación, se cuentan las células beta (evento 1): objetos que co-expresar PDX-1 + (canal 2, 650 nm) y la insulina peri-nuclear (canal 3, 549 nm). Posteriormente, se cuentan replican las células beta (evento 2): (1 eventos) que co-expresan Ki-67 (canal 4, 485 nm) (Figura 3) de las células ß. El porcentaje de replicación de las células ß se calcula: (caso 2 / evento 1) x 100. Para cuantificar la replicación de las células α, objetos totales se identifican mediante tinción con DAPI (canal 1) y luego las células alfa (evento 1) se enumeran por la ausencia de PDX-1 tinción (canal 2) y la presencia de tinción perinuclear glucagón (canal 3). Replicación de alfa-células (2 eventos) son la cantidad de alfa-células que co-expresan Ki-67 (canal 4) (Figura 4).El porcentaje de células que se replican alfa se calcula: (caso 2 / evento 1) x 100.

Antes de iniciar el experimento, un plan de tratamiento con el compuesto está hecho (Tabla 1A). Aquí, un ensayo a pequeña escala se ha ejecutado mediante el control negativo (tratado con DMSO) y el control positivo ([15 micras] dipiridamol tratados) condiciones para evaluar PDX-1, las células β y la replicación de las células α en un formato de 384 pocillos ( 49 imágenes por pocillo). Los datos experimentales demuestran dipiridamol para promover selectivamente PDX-1 + células beta y la replicación de las células β, pero no la replicación de las células α. El número medio de identificadas PDX-1-células por pocillo fue 5,541 ± 555 para DMSO-tratada y 6439 ± 363 para condiciones dipiridamol tratados (p <0,01); demostrando un aumento dependiente de dipiridamol en PDX-1 el número de células (Tabla 1B, arriba). El porcentaje medio de PDX-1 + células beta de replicación (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) es de 3,35 ± 0,50% para los tratados con DMSO y 10.10 ± 0.98% para las condiciones de dipiridamol tratados (p <0,01) (Tabla 1B, parte inferior). Es importante destacar que existen similares PDX-1 + células beta tasas de replicación en pozos posteriormente analizadas con respecto a β-celular (filas CF) y la replicación de las células α (filas GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (filas CF) y 3,4 ± 0,23 (filas GJ) (p = 0,80); dipiridamol = 9,8 ± 0,86 (filas CF) y de 10,4 ± 0.1.1 (filas GJ) (p = 0,43). Por lo tanto, estos pozos, aunque de colores para los diferentes marcadores de células de linaje (insulina y glucagón), respondieron de manera similar al tratamiento farmacológico.

A continuación, las tasas de replicación de las células beta y las células alfa se calcularon a partir de los datos sin procesar (Tabla 2). El número medio de células beta (evento 1) se incrementó en respuesta al tratamiento con dipiridamol: DMSO 3.930 ± 488 vs. dipiridamol 4.589 ± 218 (p <0,05). En particular, hay una reducción significativa en el número de células beta (3930 ± 488) en comparación con PDX-1 en las células (5.541 ± 555) (p <0,01). Este es un resultado de la exclusión de -Cells PDX-1 + que son la insulina - a partir del recuento de células β, por ejemplo, δ-células o células progenitoras de células β, y la rigurosidad adicional de requerir células ß ser insulina +. Cabe destacar que el número de células alfa (1 caso) no aumentó con el tratamiento con dipiridamol (DMSO 1.465 ± 123 vs dipiridamol 1.467 ± 74,7; p = 0,93). Por lo tanto, dipiridamol aumenta selectivamente el número de células β. El número de la replicación de las células ß (evento 2) se incrementa en respuesta al tratamiento dipiridamol (DMSO 131 ± 31 vs. dipiridamol 476,5 ± 39,6; p <0,01) pero el número de la replicación de las células alfa (evento 2) no es (DMSO 10,25 ± 3 vs dipiridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Finalmente, el porcentaje de replicación de β-ceLLS y las células alfa se calcula ((caso 2 / evento 1) x 100). De hecho, dipiridamol aumenta el porcentaje de la replicación de las células beta pero no células-alfa (que se resumen en la Figura 5). Es importante destacar que la tasa de replicación de células β basal de un cultivo sano varía entre los experimentos (0,5 a 3%), pero debe ser muy consistente a través de los pozos dentro de un experimento. Debido a que la replicación basal es variable, la tasa de replicación de células β inducida por el compuesto también es variable a través de experimentos; Sin embargo, el pliegue de la inducción de la replicación de las células β es consistente a través de experimentos y permite la eficacia del compuesto a ser comparado de forma fiable a través de experimentos. En particular, la tasa de replicación de células α es ~ 5 veces menor que la tasa de replicación de células β y culturas contiene ~ 1/3 tantas alfa-células como las células beta; Así, el índice muestra la replicación de las células α aumento de la variabilidad en comparación con el índice de replicación de las células β. Para limitar la variabilidad, las imágenes por pocillose aumenta de 49 (utilizado aquí) a un máximo de 81.

Figura 1
Figura 1: aislado e islotes dispersos rata. (A) Una micrografía de islotes de rata aislados sanos; barra de 100 micras escala que se muestra. (B) Micrografías (5X y 10X objetivos) de islotes de rata dispersas 1 hora después de la siembra; 100 micras (izquierda) y 200 m (derecha) escalar barras que se muestran. (C) Las micrografías (5X y 10X objetivos) de rata dispersa islotes de 48 horas después de la siembra; 100 micras (izquierda) y 200 m (derecha) escalar barras que se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Identificación automática de PDX-1 + + células de los islotes. Células de los islotes (A) tratadas con el compuesto de rata dispersa teñidas para PDX-1. PDX-1 + objetos tienen un círculo azul; objetos excluidos tienen un círculo de color naranja. Barra de escala de 150 micras muestra. (B) El mismo campo de células de los islotes teñidas para Ki-67. PDX-1 + ki-67 + células doble positivas tienen un círculo verde. Barra de escala de 150 micras que se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Automatizado de Identificación de replicar las células ß La replicación de las células ß se identifican con DAPI (esquina izquierda superior, círculos azules), PDX-1 (esquina derecha superior, círculos verdes), insulina (izquierda inferior esquina, magenta círculos) y Ki-67 (esquina derecha inferior, círculos rojos) co-eXpression. La imagen combinada (derecha) muestra varias células ß replicantes. Barra de escala de 150 micras que se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. Automatizado de Identificación de replicar las células alfa Replicar las células alfa se identifican con DAPI (esquina izquierda superior, círculos azules), la ausencia de PDX-1 (esquina derecha superior, círculos verdes), el glucagón (inferior izquierdo esquina, círculos magenta) y (esquina derecha inferior, círculo rojo) co-expresión de Ki-67. La imagen combinada (derecha) muestra un doblete replicante rara de células alfa (flecha amarilla). Barra de escala de 150 micras que se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 5:. El dipiridamol Induce PDX-1 + - y la replicación de las células β, pero no con la replicación de las células α Representación gráfica de-1 de células PDX (arriba a la izquierda), β-celular (arriba a la derecha) y de células α (parte inferior izquierda) replicación en DMSO y pozos tratados con dipiridamol se muestran. Las barras representan la media de los pocillos tratados de forma independiente (PDX-1 replicación, n = 8; β-celular y la replicación de células α, n = 4). Las barras de error indican la desviación estándar (* p <0,01). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<td> 3,77
A. Tratamiento: tinción:
4 5
do DMSO DIPIRIDAMOL La insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
re DMSO DIPIRIDAMOL La insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
mi DMSO DIPIRIDAMOL La insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
F DMSO DIPIRIDAMOL La insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
GRAMO DMSO DIPIRIDAMOL Glucagón, DAPI, PDX-1, Ki-67
MARIDO DMSO DIPIRIDAMOL Glucagón, DAPI, PDX-1, Ki-67
yo DMSO DIPIRIDAMOL Glucagón, DAPI, PDX-1, Ki-67
J DMSO DIPIRIDAMOL Glucagón, DAPI, PDX-1, Ki-67
SEGUNDO. Número de PDX-1 + células
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
do 5158 6249
re 6365 6795
mi 4830 6974
F 5988 6408
GRAMO 5574 6532
MARIDO 5939 6411
yo 5612 6387
J 4862 5759
Porcentaje de PDX-1 + Ki-67 + células
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
do 3.04 9.99
re 3.91 10,57
mi 2.51 8.58
F 10.14
GRAMO 3.44 10.1
MARIDO 3.06 10.69
yo 3.58 9.07
J 3.52 11,74

Tabla 1: Plan experimental Representante y PDX-1 + -Cell replicación de datos. Se muestra (a) una descripción del plan de tratamiento. Los pocillos se trataron con DMSO (columna 4) o dipiridamol (columna 5). Se realizó la tinción con DAPI, anti-PDX-1, anti-insulina (las letras normales) o anti-glucagón (las letras en cursiva) y Ki-67 (B) Número total de PDX-1 + (arriba, DAPI +Se muestran PDX-1 +) por pocillo y el porcentaje de reproducción de las células PDX-1 (abajo, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / + DAPI PDX-1 + x 100) por pocillo.

Evento 1:
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
do 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
re 4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
mi 3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
F 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
GRAMO 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+)
MARIDO 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+)
yo 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+)
J 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+)
Evento 2:
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
do 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
re 152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
mi 97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
F 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
GRAMO 13 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+) Ki-67 (+)
MARIDO 10 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+) Ki-67 (+)
yo 6 11 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+) Ki-67 (+)
J 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagón (+) Ki-67 (+)
% De replicación:
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
do 3.18 9.77
re 3.47 11.25
mi 2.8 9.55
F 3.78 10.99
GRAMO 0.82 0.57
MARIDO 0.68 0.63
yo 0,4 0,79
J 0.92 0.48

Tabla 2: Representante de células β y de células α de replicación de datos, el número total de células ß (Evento 1: DAPI + PDX-1 + insulina +; la parte superior filas de la tabla CF, letras normales).), Α-células (Evento 1 : DAPI + PDX-1 + glucagón +; la parte superior filas de la tabla de GH, las letras en cursiva), la replicación de las células ß (Evento 2: DAPI + PDX-1 + insulina + Ki 67-+; filas de la tabla media CF, letras normal) y α -Cells (Evento 2: DAPI + PDX-1 + glucagón + Ki-67 +; filas de la tabla media de GH, las letras en cursiva)por pozo se muestran. Además, el porcentaje de la replicación de las células beta (DAPI + PDX-1 + insulina + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insulina + x 100; parte inferior filas de la tabla CF, letras normal) y células alfa (DAPI + PDX -1 + glucagón + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x + glucagón 100; se muestran filas de la tabla inferior GJ, de letras en cursiva) por pocillo.

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Discussion

Los métodos experimentales para el estudio de las vías moleculares que controlan el crecimiento de las células β y la regeneración son herramientas importantes para investigadores de la diabetes. En este documento, una plataforma de cribado basado en la rata de los islotes para identificar y caracterizar los estimuladores de molécula pequeña de la replicación de las células β se presenta.

Aunque la mayoría de los aspectos de este protocolo son fácilmente realizadas por los investigadores experimentados, a pocos pasos requieren técnica particular. En primer lugar, durante el aislamiento de los islotes, la canulación del conducto biliar sin alterar su integridad requiere práctica. Una estrategia útil es para inflar mínimamente el conducto biliar para asegurar la colocación apropiada de la aguja antes de dispensar totalmente la solución de digestión pancreática. En segundo lugar, eficiente aislamiento de islotes del tejido exocrino requiere mucha atención a la duración de la digestión y la agitación adecuada. Se debe tener cuidado para asegurar un calentamiento uniforme en todo el digesto de remolino a través intermitente. En tercer lugar, el éxito experimental dependes en la discriminación entre los islotes competentes y escombros exocrina durante la recolección manual de los islotes; esta habilidad mejora con la práctica. En cuarto lugar, la dispersión de los islotes y de las planchas se realiza de tal manera que todos los islotes se dispersan en una mezcla de células individuales y pequeños grupos de dos o tres células. Superiores e inferiores a la digestión de los islotes antes de chapado interfiere con el rendimiento experimental. Las células de los islotes recién chapados deben ser aproximadamente 50% confluentes antes de extenderse y dejó que se unieran durante la 48 horas sin ser molestado. La Figura 1 muestra la apariencia de los cultivos de células de los islotes con éxito en diversos momentos después de la siembra. En quinto lugar, cambios en los medios de cultivos de células de los islotes se hacen con cuidado para evitar la interrupción de las células débilmente adherentes. En sexto lugar, la recuperación de antígeno debe hacerse cuidadosamente para evitar la deformación de la placa de múltiples pocillos, pero suficiente como para permitir el éxito tinción Ki-67, que es sensible tanto a la comprensión y la sobreexposición a elevación de la temperatura; placas deformados no se pueden utilizar paraadquisición de imágenes automatizado. Nota, la digestión excesiva páncreas, la exposición a los residuos de tejido exocrino y / o tratamiento con tripsina son causas comunes del fracaso de cultivo de células de los islotes.

Una limitación de este protocolo es la dependencia de los marcadores de expresión específica para la identidad de las células β y los eventos de replicación. El uso de marcadores individuales tiene el potencial de ser engañosa. Por ejemplo, PDX-1 se expresa por las células beta, un subconjunto de células que expresan delta somatostatina y progenitores de células β 29,30; por lo tanto, los compuestos que aumentan la replicación celular-1-PDX podría estar actuando específicamente en una población no-células β. En consecuencia, los estudios de confirmación que utilizan marcadores de células β alternativos son necesarios. Del mismo modo, Ki-67 expresión no es un marcador ideal para la replicación y los indicadores adicionales tales como BrdU y fosfo-histona 3 se debe utilizar 31. Una segunda limitación de este ensayo es que los compuestos que inducen la replicación de las células β pueden simultanéormente aumentar la apoptosis de las células β o des-diferenciación. Por lo tanto, es importante para evaluar si un compuesto induce un aumento absoluto del número de células β, y / o induce la apoptosis de las células β y si las células beta tratadas con el compuesto conservan la función normal (la secreción de insulina estimulada por glucosa) 32. Una tercera limitación de este ensayo es el rendimiento modesto asociado con el uso de las células de los islotes primarios; islotes de seis ratas genera 228 pocillos experimentales que permite ~ 55 compuestos a cribar por cuadruplicado (más controles positivos y negativos). Una limitación adicional de la plataforma de cribado replicación de las células β se describe es el uso de islotes de rata en lugar de islotes humanos. Las diferencias entre los islotes humanos y de rata son suficientes para exigir que todos los compuestos que promueven la replicación identificaron utilizando cultivos de islotes de rata se confirman utilizando cultivos de islotes humanos. Sin embargo, dada la limitada disponibilidad y alto costo de los islotes humanos, el cribado primario con I humanaslets es poco práctico para la mayoría de los investigadores.

Las principales ventajas de este protocolo son: 1) el uso de islotes primarios recién aislados para mantener las restricciones de crecimiento normales en la mayor medida posible, 2) el uso de un formato de 384 pocillos para permitir el cribado de rendimiento moderado (típicamente islotes aislados de seis ratas son suficientes para 228 pozos) y 3) el uso de la adquisición de imágenes y análisis automatizado para acelerar el ritmo de experimentación y para limitar el sesgo. Por el contrario, los enfoques alternativos utilizados comúnmente se basan en la adquisición de imágenes manual y la evaluación subjetiva de los eventos de replicación de las células β o toda incorporación de timidina radiactiva de los islotes que no discriminan entre celulares de fibroblastos linajes, ejemplo frente a la replicación de las células β 15,17. Por lo tanto, el protocolo presentado representa una herramienta importante y mejorado para investigar el crecimiento de regulación de las células ß.

Tenemos la visión de una variedad de adaptarseAplicaciones de este plataforma de cribado. En primer lugar, un aumento absoluto del número de células β se puede medir contando el número de PDX-1 + - + o insulina -Cells. Para tener en cuenta la variabilidad en el número de células sembradas por pocillo un mayor número de repeticiones por condición puede ser incluido (típicamente n = 8). En segundo lugar, la plataforma se puede adaptar para la sobreexpresión basada en lentivirus o knock-out / abajo experimentos para identificar las vías implicadas en la replicación de las células β. En resumen, la técnica experimental descrito es ampliamente útil para la identificación de compuestos y las vías moleculares que regulan la replicación de las células β.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

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