Untersuchungen über die Ga (III) -Komplexes von EOB-DTPA and Its

Chemistry

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Summary

Ein Verfahren zur Isolierung von EOB-DTPA und anschließende Komplexierung mit natürlichen Ga (III) und 68 Ga hier präsentiert wird, sowie eine gründliche Analyse aller Verbindungen und Untersuchungen zur Kennzeichnung Effizienz, In - vitro - Stabilität und der n- Octanol / Wasser Verteilungskoeffizient des radiomarkierten Komplexes.

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Greiser, J., Niksch, T., Weigand, W., Freesmeyer, M. Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue. J. Vis. Exp. (114), e54334, doi:10.3791/54334 (2016).

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Abstract

Wir zeigen, ein Verfahren zur Isolierung von EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris (carboxymethyl) -4- (Ethoxybenzyl) -undecanedioic Säure) von seinem Gd (III) -Komplex und Protokolle für die Vorbereitung seiner neuartigen nicht-radioaktiv, dh natürliche Ga (III) sowie radioaktive 68 Ga - Komplex. Der Ligand als auch das Ga (III) -Komplexes wurde durch kernmagnetische Resonanz (NMR) Spektroskopie, Massenspektrometrie und Elementaranalyse charakterisiert. 68 Ga durch eine Standard - Elution aus einem 68 Ge / 68 Ga - Generator erhalten. Versuche , die 68 Ga-Markierungseffizienz von EOB-DTPA bei pH zu bewerten 3,8-4,0 durchgeführt wurden. Etablierten Analysetechniken Funk TLC (Dünnschichtchromatographie) und Radio-HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) wurden verwendet, um die radiochemische Reinheit des Tracers zu ermitteln. Als eine erste Untersuchung der Lipophilie '68 Ga Tracern der n- Octanol / Wasser distribution Koeffizienten von 68 Ga - Spezies in einem pH 7,4 - Lösung wurde durch ein Extraktionsverfahren bestimmt werden . In vitro - Stabilitätsmessungen des Tracers in verschiedenen Medien bei physiologischem pH durchgeführt wurden, offenbart unterschiedliche Zersetzungsraten.

Introduction

Gadoxetsäure ein gemeinsamer Name für den Gd (III) -Komplex des Liganden EOB-DTPA 1, ist ein häufig verwendetes Kontrastmittel in hepatobiliären Magnetresonanztomographie (MRI). 2,3 Aufgrund der spezifischen Aufnahme durch Leber Hepatozyten und hoher Prozentsatz von hepatobiliären Exkretion es die Lokalisierung von fokalen Läsionen und Lebertumoren ermöglicht. 2-5 gewisse Einschränkungen der MRI - Technik (zB Toxizität der Kontrastmittel, begrenzte Anwendbarkeit bei Patienten mit Klaustrophobie oder Metallimplantaten) jedoch für eine alternative Diagnosewerkzeug nennen .

Positron - Emissions - Tomographie (PET) ist ein Molekularabbildungsverfahren, bei dem eine kleine Menge einer radioaktiven Substanz (Tracer) verwaltet wird, auf dem ihre Verteilung im Körper durch einen PET - Scanner aufgezeichnet. 6 PET ist ein dynamisches Verfahren , das für Hoch ermöglicht räumliche und zeitliche Auflösung der Bilder sowie die Quantifizierung der Ergebnisse, ohne mitbefassen sich mit den Nebenwirkungen von MRI-Kontrastmittel. Der Aussagewert der erhaltenen metabolischen Informationen kann durch Kombination von weiteren bildgebenden Verfahren, wie es am häufigsten erreicht durch Hybrid-Bildgebung mit Computertomographie (CT) in PET / CT-Scanner erhalten mit anatomischen Daten erhöht werden.

Die chemische Struktur der Tracer für PET müssen ein radioaktives Isotop, das als Positronenemitter umfassen. Positronen haben eine kurze Lebensdauer, da sie fast sofort mit Elektronen der Atomschalen umgebenden Gewebe zu vernichten. Durch Vernichtung zwei 511 keV Gammaphotonen mit entgegengesetzter Bewegungsrichtung emittiert werden , die von der PET - Scanner erfasst werden. 7,8 Um einen Tracer, PET Nuklide bilden können kovalent an ein Molekül gebunden sein, wie es der Fall in 2-Desoxy- 2- [18 F] fluoroglucose (FDG), das am häufigsten verwendete PET - Tracer. 7 kann jedoch ein Nuklid auch koordinative Bindungen an einen oder mehrere Liganden bilden (zB[68 Ga] -DOTATOC 9,10) oder als gelöste anorganische Salze eingesetzt werden (beispielsweise [18 F] Natriumfluorid 11). Insgesamt ist die Struktur des Tracers entscheidend, da es seine Bioverteilung bestimmt, Metabolismus und Ausscheidungsverhalten.

Eine geeignete PET-Nuklid sollten günstige Eigenschaften wie bequeme Positron Energie und Verfügbarkeit sowie eine Halbwertszeit ausreichend für die geplante Untersuchung zu kombinieren. Die 68 Ga Nuklid ist in den letzten zwei Jahrzehnten eine wesentliche Kraft auf dem Gebiet der PET werden. 12,13 Dies ist vor allem vor Ort durch ein Generatorsystem, das unabhängig von der Nähe eines Zyklotrons Kennzeichnung ermöglicht aufgrund seiner Verfügbarkeit ist. In einem Generator Nuklid die Mutter 68 Ge auf einer Säule aus dem absorbiert wird die Tochter - Nuklid 68 Ga eluiert wird und anschließend in einem geeigneten Chelator gekennzeichnet. 6,14 Da das 68 Ga Nuklid als trival bestehtent - Kation wie Gd (III) 10,13, EOB-DTPA mit 68 Ga Chela statt einen Komplex mit dem gleichen Gesamt negative Ladung als Gadoxetsäure ergeben würde. Dementsprechend könnte , dass 68 Ga - Tracer eine ähnliche Charakteristik Leberspezifität mit der Eignung für die PET - Bildgebung zu kombinieren. Obwohl Gadoxetsäure als Dinatriumsalz gekauft und verwaltet werden , in folgendem Zusammenhang werden wir es als Gd [EOB-DTPA] beziehen und auf die nicht-radioaktiven Ga (III) -Komplex als Ga [EOB-DTPA] oder 68 Ga [ EOB-DTPA] im Falle der radiomarkierten Komponente aus Gründen der Bequemlichkeit.

Zur Beurteilung ihrer Eignung als Tracer für PET, radioaktiven Metallkomplexe müssen geprüft werden extensiv in in vitro, in vivo oder ex vivo Experimente zuerst. Zur Bestimmung der Eignung für ein entsprechendes medizinisches Problem, verschiedene Tracer Eigenschaften wie Bioverteilung Verhalten und Lichtraumprofil, Stabilität, Organspezifität und Zelle oder tissue Aufnahme müssen untersucht werden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven Charakter, in vitro - Bestimmungen werden häufig vor der in vivo - Experimente durchgeführt. Es ist allgemein anerkannt , dass DTPA und seine Derivate sind von begrenzter Eignung als Chelatoren für 68 Ga aufgrund dieser Komplexe kinetische Inertheit fehlt, in vergleichsweise schnelle Zersetzung führt , wenn in vivo verabreicht. 14-20 Dies in erster Linie durch apo- Transferrin verursacht wird als wirkende Wettbewerber für 68 Ga im Plasma. Dennoch untersuchten wir diese neue Tracer über ihre mögliche Anwendung in Leber - Gallen - Bildgebung, bei Diagnoseinformationen können innerhalb von Minuten nach der Injektion 3,4,21-23, wodurch nicht unbedingt für die langfristige Stabilität Tracer zur Verfügung gestellt werden. Dazu isolierten wir EOB-DTPA aus Gadoxetsäure und ausgeführt zunächst die Komplexbildung mit natürlichen Ga (III), die als Mischung von zwei stabilen Isotopen besteht, 69 Ga und 71 68 Ga erhalten serviert. Wir verwendeten Methoden ermittelt und bewertet gleichzeitig ihre Eignung für den 68 Galabeling Effizienz der EOB-DTPA für die Bestimmung und die Lipophilie des neuen 68 Ga - Tracer und seine Stabilität in verschiedenen Medien zu untersuchen.

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Protocol

1. Herstellung von EOB-DTPA und Ga [EOB-DTPA]

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) der verwendeten organischen Lösungsmittel, Säuren und Laugen vor dem Gebrauch. Führen Sie alle Schritte in einem Abzug und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel).

  1. Isolierung von EOB-DTPA aus Gadoxetsäure
    1. Setzen Sie 3 ml 0,25 M Gadoxetsäure injizierbare Lösung in einen Kolben. Hinzufügen, 500 mg (5,6 mmol) Oxalsäure zu der gerührten Lösung.
    2. Nach dem Rühren für 1 Stunde, filtern die Suspension über eine Fritte reduziert Druck. Dann den Rückstand dreimal mit 3 ml Wasser auf.
    3. Kombinieren Sie die wässrigen Filtrate und statten die Lösung mit einem pH-Elektrode. Liste 12 M Chlorwasserstoffsäure zu dem Filtrat, bis der pH-Wert beträgt etwa -0,1.
    4. Entferne das Lösungsmittel in vacuo zu einem farblosen Rückstand zu ergeben. Unter Inertgas aufbewahren.
    5. Waschen Sie den Rückstand gut (mindestens dreimal) mit Ethylacetat das überschüssige Oxalsäure zu entfernen. Trocknet den Rückstand im Vakuum.
    6. Abgeblasen, und der Rückstand in 2 ml Wasser bei Raumtemperatur und dann die Lösung in einem Eisbad zu kühlen. Ohne Entfernen des Eisbad mit 0,5 M wässriger Natronlauge tropfenweise bis zur Bildung eines farblosen gluey Feststoff wird beobachtet.
    7. Entfernen Sie das Wasser durch Abgießen. Waschen Sie die solide zwei Mal mit 1 ml kaltem Wasser. Der Feststoff wird im Vakuum die erste Produktfraktion zu ergeben.
    8. Isolieren einer zweiten Produktfraktion aus den vereinigten Fraktionen von abdekantiert Wasser über Säulenchromatographie (Kieselgel, Methanol / Wasser 4/1). 24 das Lösungsmittel im Vakuum entfernen.
    9. Wenn das so erhaltene feste nicht rein weiß ist, wieder in Lösung in 1 ml Wasser, 10 ml Ethanol und anschließend 10 ml Diethylether das Produkt zu fällen. Filter durch eine Fritte mit vermindertem Druck und im Vakuum getrocknet.
    10. Kombinierensowohl feste Fraktionen von EOB-DTPA und NMR - Spektroskopie, 25 massenspektrometrischen 26 und Elementar 27 Analysen durchführen.
  2. Synthese von Ga [EOB-DTPA]
    VORSICHT: Shop feste Ga (III) -chlorid unter einer trockenen, inerten Atmosphäre, da bei Kontakt mit Luft, Feuchtigkeit oder Fett Zersetzung stattfindet, was zu ätzende Dämpfe und die Bildung von gelb, braun oder schwarz Verunreinigungen.
    1. Bereiten Sie eine 0,11 M Stammlösung durch Auflösen von 1,94 g (11,0 mmol) Ga (III) -chlorid in 100 ml Wasser. Verdünne 1 ml 25% iger wässriger Ammoniaklösung mit 4 ml Wasser.
    2. Man löst 80 mg (0,15 mmol) des EOB-DTPA in einen Kolben in 10 ml Wasser. Falls erforderlich, erwärmen das Lösungsmittel eine vollständige Auflösung zu erreichen.
    3. In 1,4 ml (0,15 mmol) des Ga (III) -chlorid-Stammlösung. Anlegen des Kolbens mit einem Rührer und pH-Elektrode. Hinzufügen verdünnte wässrige Ammoniaklösung zugetropft, bis der pH-Wert der Lösung ca. 4,1 beträgt. Rühre bei room Temperatur für 30 min.
    4. Entferne das Lösungsmittel in vacuo. Platzieren Sie den Rückstand in einem Kolben, ausgestattet mit einem Destillationsaufsatz mit einem zentralen und parallelen Seiten Hals. Rüsten Sie den zentralen Hals mit einem Kühlfinger und dem Seitenhals mit einer Vakuumpumpe Auslass
    5. Heizen Sie den Rückstand unter vermindertem Druck (125 ° C, 0,6 mbar). Entfernen Sie regelmäßig sublimierten Ammoniumchlorid (sichtbar als weiße Beschichtung der Glasoberfläche) aus dem Kühlfinger und immer noch den Kopf, als auch von den oberen Teilen des Kolbens mit einem leicht feuchten Tuch. Setzen Sie den Vorgang, bis es keine sichtbare Bildung neuer Sublimat ist.
    6. Zum Entfernen letzten Spuren von Ammoniumchlorid den Rückstand dreimal mit 0,5 ml heißem Methanol, respectively. Trocknen der farblose Rückstand in vacuo. Führen NMR - spektroskopische, 25 massenspektrometrischen 26 und Elementar 27 Analysen.

2. Allgemeine Markierungsverfahren

ACHTUNG: Alle exExperimente mit direkten oder indirekten Kontakt mit radioaktiven Stoffen dürfen nur von geschultem Personal durchgeführt werden. Bitte verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung. Sammeln Sie alle radioaktiven Abfälle getrennt und zu speichern und in Übereinstimmung mit den gültigen Vorschriften zu entsorgen.

  1. Elution des Generators
    Hinweis: Ein 40 mCi 68 Ge / 68 Ga - Generator mit der Mutter - Nuklid als Oxid auf Dodecyl-3,4,5-trihydroxybenzoat Kieselsäure gebunden wurde verwendet. Elution und Reinigung kann manuell oder durchgeführt werden, wie es der Fall in diesem Verfahren war, als kombinierte automatisierten Prozess eine peristaltische Pumpe und Spendereinheit.
    1. Bereiten Sie Lösungen von 5,5 M, 1,0 M und 0,05 M Salzsäure. Eine Lösung aus 5,0 M Natriumchlorid, 25 & mgr; l von 5,5 M Chlorwasserstoffsäure pro ml enthält. Bereiten einer Pufferlösung von pH 4,6 durch die Kombination von 4,1 g Natriumacetat, 1 ml HCl (30%) und 2,5 ml Eisessig und verdünnt das Gemisch mit Wasser auf 50 ml.
    2. Precondition der PS-H + Kartusche durch sie langsam mit 1 ml 1,0 M Salzsäure und anschließend mit 5 ml Wasser gespült.
    3. Eluieren der Silica - Säule des Generators mit 4 ml 0,05 M HCl. 12 Legen Sie das 68 Ga - Eluat auf die PS-H + Patrone.
    4. Spülen Sie die Kartusche mit 5 ml Wasser und anschließend mit 5 ml Luft trocknen. Eluieren der 68 Ga aus der Kartusche mit 1 ml 5,0 M angesäuerten Natriumchloridlösung. 28
  2. Die Markierung von EOB-DTPA mit 68 Ga
    1. Man löst 1 mg (1,9 umol) EOB-DTPA in 1 ml Wasser. Aus dieser Lösung nehmen 100 ul (0,19 umol) und verdünnen sie mit 9,9 ml Wasser ein 19 & mgr; M herzustellen (10 ug / ml) Stammlösung von EOB-DTPA.
    2. Entfernen Sie 50 ul (entspricht 22-29 MBq) der Lösung 68 Ga enthält und in ein Fläschchen. In 50 ul (0,5 ug) einer 19 mM Stammlösung von EOB-DTPA und 300 & mgr; l of Puffer den pH-Wert auf 4,0 zu erhöhen. Schütteln Sie kurz und Inkubation der Lösung bei Raumtemperatur für 5 min. Entfernen eines aliquoten von 1-5 & mgr; l und setzen HPLC oder TLC-Analyse.
    3. Führen Sie Radio - HPLC - Analyse an einer Reversed - Phase (RP) C18 - Säule 29 Verwenden Sie die folgende mobile Phase: a . - Wasser / Trifluoressigsäure (99,9% / 0,1%), B - Acetonitril / Trifluoressigsäure (99,9% / 0,1%), Gradient : 06 min 80% A → 0% A (0,5 ml / min), 610 min 0% A (0,5 ml / min).
    4. Bestimmen Sie die Peak-Intensitäten der Funk HPLC-Signale als Fläche unter der Kurve. Berechnen Sie die Markierungsausbeute als radiochemische Reinheit (RCP) des Tracers wie folgt:
      RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga + A Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
      Ein Ga-EOB-DTPA: Fläche unter der Kurve von 68 Ga [EOB-DTPA]
      A Ga: Fläche unter der Kurve der freien 68 Ga

3. Labelingeffizienz

  1. Führen Sie Markierungsverfahren wie beschreibend in Abschnitt 2. Verwenden Sie ein durchgängiges Programm an Aktivität von 68 Ga - Eluat starten, zB 22-29 MBq (40-140 & mgr; l, abhängig von der Frische des Eluats).
  2. Die erforderliche Menge an Pufferlösung , um den pH auf 3,8-4,0 einzustellen (40-190 & mgr; l, abhängig von dem Volumen von 68 Ga - Eluat). Fügen Sie die erforderliche Menge an Ligand-Stammlösung (10-70 ul einer 19 mM Lösung).
  3. Fügen Sie die erforderlichen Mengen an Wasser, um das Gesamtvolumen jeder Markierungssonde auf 1,75 ml einzustellen. Gut mischen und lassen Sie die Probe stehen für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Eine HPLC-Analyse wie in Abschnitt 2 beschrieben, um die Markierungsausbeute zu bestimmen.
  4. Führen Markierungsverfahren mit Mengen an Liganden zwischen 0,1 & mgr; g und 0,7 & mgr; g in Schritten von 0,1 & mgr; g. Führen Sie Experimente in dreifacher Ausführung für jede Ligandenkonzentration. Berechnen Sie die mittlere Ausbeute und Standardabweichung.

4. In - vitro - Stabilität

  1. Allgemein pERFAHREN und Zubereitungen
    1. Auflösen einer Tablette von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in 200 ml deionisiertem Wasser mit einer PBS-Stammlösung mit einer Phosphatkonzentration von 10 mM herzustellen.
    2. Führen Sie die Kennzeichnung von 22-29 MBq 68 Ga mit 0,5 ul EOB-DTPA - Stammlösung, wie in Kapitel 2. Je nach Volumen des 68 Ga - Eluats, stellen Sie die Menge des Puffers, wie in Kapitel 3. Ziehen Proben Markierungslösung 6-12 MBq Tracer enthält Stabilitätsmessungen durchzuführen.
    3. Führen Radio DC - Analyse auf 80 mm Silicagel-beschichteten Aluminium - Platten unter Verwendung von 0,1 M wässrigem Natriumcitrat als Eluent und zu analysieren , die Platten mit einem Radioaktivität TLC - Scanner. 30 die Intensitäten der TLC - Signale als Fläche unter der Kurve zu bestimmen. Berechnen Sie die RCP des Tracers wie folgt:
      RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga-free + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-kolloidalen) ∙ 100%
      Eine Ga-EOB-DTPA: Fläche unter der Kurve von 68 Ga [EOB-DTPA]
      Ein Ga-frei: Fläche unter der Kurve der freien 68 Ga
      Ein Ga-kolloidale: Fläche unter der Kurve von kolloidalem 68 Ga
    4. Berechnen RCP t / RCP 0 für jeden Zeitpunkt. Zeichnen Sie die so standardisiert RCP vs. Zeitdifferenz seit dem Startpunkt t = 0 min.
      RCP t = RCP von 68 Ga [EOB-DTPA] zum Zeitpunkt t.
      0 RCP = RCP von 68 Ga [EOB-DTPA] bei t = 0 min.
  2. Stabilität in phosphatgepufferter Salzlösung (A)
    1. Zu 65 & mgr; l Markierungslösung mit 150 ul PBS-Stammlösung und 60 & mgr; l Natriumhydroxid-Lösung (0,1 M), um den pH-Wert auf 7,4 zu erhöhen. Gründlich durchmischen.
    2. Entfernen eines aliquoten von 1-5 ul TLC-Analyse durchzuführen ( "Ausgangspunkt"). Sofort speichern, die Lösung in einem Inkubator bei 37 ° C und Aliquots entfernen, um die DC-Analyse an repräsentieren zuführenAtive Zeitpunkten über 3 Stunden.
  3. Stabilität gegenüber mehr als apo -Transferrin in PBS (B)
    1. Zu 120 & mgr; l Markierungslösung 50 ul-Lösung und 430 PBS-Stamm ul Natronlauge hinzu (0,1 M), um den pH-Wert auf 7,4 zu erhöhen. Werden 40 ul einer Lösung von apo -Transferrin (25 mg / ml). Gründlich durchmischen.
    2. Entfernen eines aliquoten von 1-5 ul TLC-Analyse durchzuführen ( "Ausgangspunkt"). Sofort speichern, die Lösung in einem Inkubator bei 37 ° C und Entfernen Aliquots TLC-Analyse bei repräsentativen Zeitpunkten über 3 h durchzuführen.
  4. Stabilität in humanem Serum (C)
    1. Bis 500 & mgr; l humanem Serum 25 ul Markierungslösung hinzufügen und 45 & mgr; l Natriumhydroxid-Lösung (0,1 M), um den pH auf 7,4 zu erhöhen. Gründlich durchmischen.
    2. Entfernen eines aliquoten von 1-5 ul TLC-Analyse durchzuführen ( "Ausgangspunkt"). Unmittelbar speichern Sie die Lösung in einem incubator bei 37 ° C und Entfernen Aliquots TLC-Analyse bei repräsentativen Zeitpunkten über 3 h durchzuführen.

5. Bestimmung des Verteilungskoeffizienten LogD

  1. Führen Sie Markierungsverfahren, wie in Abschnitt 2. 50 ul Markierungslösung werden 20 ul PBS-Stammlösung und 170 & mgr; l Natriumhydroxid-Lösung (0,1 M) beschrieben, um den pH-Wert auf 7,4 zu erhöhen.
  2. Ziehen Sie 200 ul von dieser Lösung und steckte es in eine Plastik V-Fläschchen. In 200 ul n- Octanol. Schließen Sie das Fläschchen und Vortex für 2 min. Zentrifuge Dann die Probe bei 1600 × g für 5 min.
  3. Entfernen Triplikaten von 40 & mgr; l aus der n Octanol - Phase und der wässrigen Phase jeder und sie in separaten V-Fläschchen. Achten Sie darauf, um die Schichten zu vermischen.
  4. Messen Sie die Aktivität jeder Probe in einem Gamma-Zähler gut für 30 Sekunden. Für jede Probe sofort die Messung zweimal wiederholen und davon die mittlere Aktivität Ᾱ t berechnen t, W1, Ᾱ t, W2 und Ᾱ t, W3 (Aktivitäten in wässrigen Proben) und Ᾱ t, O1,t, O2,t, O3 (Aktivitäten in n- Octanol) zusammen mit dem jeweiligen Zeitpunkt t ihrer Bestimmung.
  5. Legen Sie den Zeitpunkt der Messung der letzten Probe als t 0. Bestimmen und in der Liste At in min durch die Berechnung At = tt 0. Führen Sie Zerfallskorrektur von Ᾱ t, mit der folgenden Formel:
    0 = Ᾱ t · 2 (& Dgr; t / 68 min).
  6. Berechnen Ᾱ 0, W als Mittelwert von Ᾱ 0, W1,0, W2 und Ᾱ 0, W3 sowie Ᾱ 0, O als Mittelwert Ᾱ 0, O1,0, O2 und Ᾱ 0, O3. Berechnen logD mit folgender Formel:
    logD = log [(Ᾱ 0, W · 33 ug)].
  7. Führen Sie das gesamte Experiment in dreifacher Ausfertigung und den Mittelwert logD zusammen mit seiner Standardabweichung.

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Representative Results

Der Ligand EOB-DTPA und der nicht-radioaktiven Ga (III) -Komplex wurden mittels 1 H analysiert und 13 C {1 H} -NMR - Spektroskopie, Massenspektrometrie und Elementaranalyse. Die Ergebnisse in Tabelle 1 aufgelistet und dargestellt in Figuren 1-6 , die Reinheit der Substanzen verifizieren.

Die Elution der 68 Ge / 68 Ga - Generator lieferte Lösungen von 400-600 MBq 68 Ga. Die beschriebenen Markierungsverfahren führt zur Bildung des gewünschten Tracers 68 Ga [EOB-DTPA], angegeben als Radio HPLC - Peak mit einer Retentionszeit von 2,8 min (Abbildung 7) aufweist. Vergleich mit der Retentionszeit des Ga [EOB-DTPA] Standard im UV-VIS - Detektor bei 220 nm (2,7 min, 8) bestätigt die erfolgreiche Markierung. Unkoordinierte 68 Ga als Radio - Peak bei 2,1 min detektiert wird (Abbildung7). Die 68 Ga-Markierungseffizienz von EO-BDTPA wurde durch Bestimmung der Markierungsausbeute als eine Funktion der Ligandenkonzentration über HPLC (Abbildung 9) untersucht. Die Ausbeuten wurden in dreifacher Ausfertigung und Standardabweichungen bestimmt wurden berechnet.

In Abhängigkeit von dem pH und der Konzentration der Anionen in der Lösung vorhanden, unkoordinierte oder nicht-markiertes 68 Ga in verschiedenen Arten vorhanden sein können, beispielsweise Gallate oder unlösliches Hydroxid. 31 Der allgemeine Begriff "freie 68 Ga" 32 ist für alle nicht markierten verwendet Spezies in der Lösung mit Ausnahme des Hydroxids, die im allgemeinen als "kolloidales 68 Ga" bezeichnet wird. Unter den beschriebenen Analysebedingungen, bewegt sich frei 68 Ga mit der Lösungsmittelfront (R f = 1,0) auf einer DC - Platte. Kolloidales 68 Ga kann nicht über HPLC nachgewiesen werden, während auf einer DC - Platte als Aktivität erscheintam Ursprung (R f = 0). Ein repräsentatives Chromatogramm einer TLC - Platte mit einem Scanner TLC Radioaktivität analysiert wird in 10 gezeigt. Der Tracer unterschiedliche Retentionsverhalten aufweist, je nachdem , ob eine Probe von Markierungslösung (pH 3,8-4,0, R f = 0,3) oder einer Probe einer physiologischen pH (R f = 0,5) wurde analysiert.

Um zu untersuchen , wurde die Stabilität des Tracers, frisch markiertem 68 Ga [EOB-DTPA] an Proben physiologischer pH zugegeben, mit verdünnter PBS (Phosphat - Konzentration 5,5 mM, A), über apo- Transferrin (1,6 mg / ml in PBS verdünnt mit einer Phosphatkonzentration von 0,8 mM, B) und Humanserum (C), respectively. Im Laufe der Zeit wurde die radiochemische Reinheit (RCP t) des Tracers in den Proben mittels DSC bestimmt. Der Prozentsatz der intakten Tracer wurde als das Verhältnis der RCP t berechnet wird, zuden jeweiligen Zeitpunkten und RCP 0 am Anfangspunkt (Tabelle 2). Dies war notwendig , da die Kennzeichnungslösungen , die Tracer unterschiedlicher RCP 0 (93-96%). Das so standardisierte Prozentsatz von intakten Tracers als Funktion der Zeit in Figur 11 dargestellt.

Für die Bestimmung von logD wässrigen Proben des Tracers in einer Lösung PBS verdünnt, wurden hergestellt. Die Proben wurden mit n- Octanol gemischt, zentrifugiert und anschließend aliquote Teile wurden die Aktivitätskonzentration in beiden Phasen zu bestimmen entfernt. Aktivitätswerte und die anschließende Berechnung der logD davon sind in Tabelle 3 dargestellt. Die mittlere logD Wert ist 3,54 ± 0,08.

Abbildung 1
Figure 1. 1 H-NMR - Spektrum von EOB-DTPA. < / strong> Das Spektrum in D 2 O bei 400,1 MHz aufgenommen wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. 13 C {1 H} -NMR - Spektrum von EOB-DTPA. Das Spektrum in D 2 O bei 100,6 MHz aufgenommen wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. MS von EOB-DTPA (Elektrospray - Ionisation (ESI), Methanol, Negativ - Modus).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. 1 H-NMR - Spektrum von Ga [EOB-DTPA]. Das Spektrum in D 2 O bei 400,1 MHz aufgenommen wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. 13 C {1 H} -NMR - Spektrum von Ga [EOB-DTPA]. Das Spektrum in D 2 O bei 100,6 MHz aufgenommen wurde. Bitte klicken sie e eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. MS von Ga [EOB-DTPA] (ESI, Methanol, Negativ - Modus), zusammen mit einer detaillierten Darstellung des Isotopenmuster der molekularen Spitze. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Figur 7. Repräsentative HPLC - Chromatogramm einer Probe von 68 Ga [EOB-DTPA] enthält , in Teilen unkoordinierten 68 Ga, wie durch den Radioaktivitätsdetektor aufgezeichnet. Uncoordinated 68 Ga weist eine Retentionszeit von 2,1 min, während der Tracer bei 2,8 min detektiert wird .target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8. Repräsentative HPLC - Chromatogramm der Standardsubstanz Ga [EOB-DTPA], wie bei 220 nm im UV-Vis - Kanal erkannt. Die Retentionszeit des kalten Standard ist 2,7 min. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehen Zahl.

9
Abbildung 9. Darstellung von 68 Ga-Markierungseffizienz von EOB-DTPA. Die Markierungsausbeute wie mittels HPLC bestimmt wird in Abhängigkeit von der Konzentration des EOB-DTPA (22-29 MBq Ausgangsaktivität aufgetragen, pH 3,8-40,0, 5 min, RT). Die Standardabweichung von Fehlerbalken dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10
Abbildung 10. Repräsentative TLC Chromatogramm offenbaren verschiedene 68 Ga - Spezies. Eine Probe von 68 Ga [EOB-DTPA] in verdünntem PBS (Phosphat - Konzentration 5,5 mM, pH = 7,4) wurde nach 110 Minuten Inkubation analysiert. Beispielhafte Verteilung von kolloidalem 68 Ga (R f = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (R f = 0,5) und frei 68 Ga (R f = 1,0) auf einer 70 mm DC - Platte , wie durch einen TLC Radioaktivität Scanner detektiert ist vorgeführt. Counts sind Zerfall korrigiert. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößernVersion dieser Figur.

11
11. Stabilität Bestimmungen von 68 Ga [EOB-DTPA] in verschiedenen Medien. Der Zerfall korrigiert, standardisierte Prozentsatz intakter Tracer als über DC bestimmt wird als Funktion der Zeit dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Tabelle 1
Tabelle 1. Ergebnisse der NMR - Spektroskopie, MS und Elementaranalysen durchgeführt , um EOB-DTPA und Ga [EOB-DTPA]. Relative MS Spitzenintensitäten angegeben in%, die Zuordnung zu Spitzen sind in eckigen Klammern angegeben. Elemental CHN-Werte waren calcuumgerechnet für 33 C 23 H N 3 O 11 · H 2 O (EOB-DTPA) und (NH 4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GaN 3 O 11] · 2 H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).

Tabelle 2
Tabelle 2. Stabilität Bestimmung von 68 Ga [EOB-DTPA] in verschiedenen Medien. Der RCP von 68 Ga [EOB-DTPA] in Medien A, B und C wurde durch TLC zu gegebenen Zeitpunkten bestimmt. Die Zusammensetzung der Proben wird als Prozentsätze in% des Tracers / Frei 68 Ga / kolloidalem 68 Ga gegeben. Der Anteil der intakten Tracer wird als Verhältnis von RCP t / RCP 0 standardisiert. 0 RCP ist die jeweilige RCP des Tracers bei t = 0 min.


. Tabelle 3. Bestimmung der logD Decay korrigierten Werte & agr; 0, X von drei Aliquots (x = 1, 2, 3) von jeder Phase entfernt (W: wässrige, O: n Octanol) einer Probe. Alle Aktivitäten werden in cpm angegeben. LogD wird berechnet, wie in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben. Das Experiment wurde zweimal wiederholt.

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Discussion

EOB-DTPA ist über eine mehrstufige Synthese 33 kann aber auch nur aus den verfügbaren Kontrastmittel Gadoxetsäure enthält , isoliert werden. Zu diesem Zweck kann die Zentral Gd (III) -Ion mit einem Überschuß von Oxalsäure ausgefällt werden. Gd (III) Oxalat und Oxalsäure Nach dem Entfernen der Ligand kann durch Ausfällen in kaltem Wasser bei pH 1,5 isoliert werden. Um jedoch die Ausbeuten Säulenchromatographie des Filtrats zu verbessern kann durchgeführt anstelle oder als Follow-up-Verfahren. Jedes Verfahren ergibt die analytisch reine Ligand in Gesamtausbeuten von 70% (Abbildungen 1-3, Tabelle 1).

Wir fanden , dass die Verwendung von Natriumhydroxid vorteilhaft ist , verglichen, um Ga [EOB-DTPA] Einstellen des pH mit Ammoniaklösung zu isolieren, da das Nebenprodukt Ammoniumchlorid aus dem sehr hydrophiler Rest durch Sublimation entfernt werden. Unter den oben genannten Bedingungen erfolgt dieser Prozess langsamly. Da nicht zu vernachlässigende Mengen an Chlorid nach fünf Tagen noch nachweisbar waren, wurde das restliche Salz mit Methanol ausgewaschen. Obwohl diese Arbeit-up - Verfahren führt zu einer teilweisen Verlust von Ga [EOB-DTPA] wurde das Produkt in der analytischen Reinheit mit einer Gesamtausbeute von 46% erhalten (Abbildungen 4-6, Tabelle 1). Zur Isolierung von sowohl EOB-DTPA und seine Ga (III) -Komplexes, die Verwendung von Reversed Phase-Chromatographie sollte als eine alternative Methode der Reinigung in Betracht gezogen werden, insbesondere da die Zersetzung Kieselgel wahrscheinlich ist, wenn hochpolaren Lösungsmitteln.

Der Etikettiervorgang des EOB-DTPA erforderlich , um die Verwendung von hochreinen Lösungsmitteln, Chemikalien und metallfreien Ausrüstung , um die Anwesenheit von konkurrierenden Metallionen zu vermeiden, aufgrund von 68 Ga in nanomolaren Mengen vorhanden sind , (2 MBq von 68 Ga in einer 1,75 ml - Probe gleich einem Nuklid Konzentration von 0,14 nM). Die Markierung von EOB-DTPA zu 68 Ga tritt bei pH 3,8 bis 4,0 innerhalb von fünf Minutennuten bei Raumtemperatur. Untersuchungen über die 68 Ga-Markierungseffizienz erfordern Bestimmung der Markierungsausbeute , wobei die Reaktionsbedingungen pH - Wert, Temperatur und Reaktionszeit sowie Ausgangsaktivität von 68 Ga konstant oder in einem vertretbaren Bereich zu halten. Für jeden Datenpunkt (dh Ligand - Konzentration) das Experiment sollte mindestens dreimal durchgeführt werden , um einen angemessenen Vertrauensniveau zu schaffen, da die Konzentrationen sowohl von Ligand und 68 Ga sind sehr gering und die Markierungsausbeute daher empfindlich auf geringfügige Abweichungen von der Reaktionsbedingungen. Zum Beispiel, wie die 68 Ga Eluat Alter Aliquoten Volumen erhöht benötigen eine konstante Ausgangsaktivität bereitzustellen als zurückgenommen, wodurch es erforderlich Volumina Puffer erhöht wird . Weiterhin Alterung des Eluats Ergebnisse in Konzentrationen des Zerfallsprodukt 68 Zn zu erhöhen, was sich als Konkurrent für 68 Ga handeln könnte, somit negativ beeinflussen Labeling Effizienz. 13,34,35 praktisch quantitative Markierung von 22-29 MBq 68 Ga wird unter den oben erwähnten Bedingungen mit Mengen von EOB-DTPA ≥ 0,7 & mgr; g (9), mit Gehalten an freiem 68 Ga ≤ 2% und etwa 5 erreicht , % kolloidales 68 Ga in Proben vorhanden.

Während HPLC überlegene Basislinientrennung der freien 68 Ga und 68 Ga [EOB-DTPA] vorgesehen ist , ist es nicht kolloide 68 Ga zu erfassen geeignet. Wir wählten daher TLC die RCP während der Stabilitätsmessungen zu bestimmen, wobei die Quantifizierung von Transferrin oder proteingebundenen 68 Ga erforderlich war. Wir fanden Basislinientrennung akzeptabel für diesen Zweck (Abbildung 10); jedoch 15,36 die Verwendung von Grßenausschluß - Chromatographie oder Filtrationsverfahren kolloidalen Fraktionen zu entfernen, durch HPLC - Analyse verfolgt, können als Alternativen betrachtet werden. Die 68 Ga - Komplex zeigt eine stärkere retention auf DC - Platten (R f = 0,3) , wenn die Probe direkt aus Etikettierungslösung abgezogen wird , wie bei einem physiologischen pH - Wert auf Proben gegen (R f = 0,5). Wir schlagen vor, diese Beobachtung könnte durch verschiedene Protonierungszustände des Komplexes erklärt werden.

In - vitro - Stabilität Bestimmungen von 68 Ga - Tracer sind in der Regel in PBS 15,17 oder alternative Puffersysteme imitiert den physiologischen pH - Wert 37, sowie in Lösungen mit apo- Transferrin 37, durchgeführt , die für 68 Ga der Hauptkonkurrent im Blut ist, oder Humanserum 15,17. In unseren Experimenten wurde die Zugabe von 0,1 M Natronlauge auf PBS erforderlich, um den pH-Wert der Proben auf 7,4 einzustellen. Wir konnten nicht behaupten , daß die Phosphatkonzentration die Rate der Verschlechterung, da die Stabilität Experimente in Lösungen mit variierenden Phosphatkonzentrationen (0,8 mM und 5,5 mM (A)) ergab nicht beeinflusst reproduCible Ergebnisse. Wir fanden jedoch, daß eine Lösung B, enthaltend apo -Transferrin (1,6 mg / ml, die im Bereich des normalen Plasmagehalt 38 ist) in der Regel und 0,8 mM Phosphat (menschliches Blut weist einen Phosphatgehalt von 0,8-1,5 mM 39,40 ), bewirkt bei einer Rate Zersetzung zu demjenigen vergleichbar ist , beobachtbar in humanem Serum (C). In Lösungen AC, nach 185 min der Gehalt an kolloidalem 68 Ga war um etwa 24% erhöht, während der Gehalt an freiem 68 Ga um 11% in Lösung A angestiegen war, 17% in Lösung B und 27% in Lösung C (Tabelle 2 ). Die Tatsache , dass 68 Ga durch Tracer Zersetzung gebildet ist überwiegend als freie 68 Ga im Gegensatz zu kolloidaler oder proteingebundenen 68 Ga in B und C könnten aufgrund Transferrin - Sättigung oder vergleichsweise langsame Transferrin - Bindungsraten sein. (Abbildung 11) von 68 Ga [EOB-DTPA] ist vergleichbar mit Tracern mit ähnlichen DTPA abgeleitet Chelatbildnern. 15,16,18 Üblicherweise Informationen über die frühe arterielle und venöse Perfusion Phase der Leber gewonnen , indem Scans innerhalb der ersten 3 Minuten nach Verabreichung von 4,21 Gd [EOB-DTPA] MRI durchgeführt wird , während die Hepatozyten - Präsenz in der verzögerten Phase 20 Minuten 3,4,23 bis zu mehreren Stunden 21,22 nach der Injektion nachgewiesen. Nach 20 Minuten im menschlichen Serum 93% der 68 Ga [EOB-DTPA] intakt bleiben. Expectedly, wäre das Signal-zu-Rausch - Verhältnis zu dieser Zeit verschlechterte sich aufgrund der zunehmenden Mengen von 68 Ga-Transferrin, die im Plasma und Gewebe exprimiert Transferrin - Rezeptoren, sowie kostenlose 68 Ga - Gallat. 41,42

Für eine Tracern Gewebeverteilung n- Octanol / Wasser - Verteilungskoeffizienten log die VorhersageP oder Verteilungskoeffizienten logD kann als Verhältnis der Aktivitätskonzentrationen in den beiden Phasen bestimmt werden. Per Definition ist der logD-Parameter nicht zwischen mehreren Spezies in einem Medium zu unterscheiden, die sie geeignet für unsere Experimente aufgrund der Möglichkeit unterschiedlicher Protonierungszustände des Tracers sowie seine Zersetzung in der wässrigen Phase bildet. Zur Bestimmung logD durch Extraktion das wässrige Medium in der Regel mit PBS gepuffert Blut Bedingungen nachahmen. 17,43-45 Aus vorgenannten Gründen verwendet man PBS verdünnt, eine Phosphatkonzentration von 0,8 mM und physiologischen pH aufweisen. Nach Extraktion mit n Octanol und Zentrifugation, die Entfernung von mehreren Aliquoten von der gleichen Phase ermöglicht Ungenauigkeiten durch Pipettieren verursacht reduziert werden. Aufgrund der sehr geringen Aktivitätskonzentrationen in n- Octanol sollte man vorsichtig sein , eine Kreuzkontamination mit der wässrigen Phase zu vermeiden und quantitative Übertragung in einen separaten Fläschchen zu gewährleisten. Distribution Koeffizienten, die durch dieses Verfahren bestimmt waren reproduzierbar, und während sie für eine grobe Schätzung der Lipophilie ermöglichen, einen direkten Vergleich zu einem logP von Gd [EOB-DTPA] ist nicht möglich. Aufgrund der Spezifität von Gd [EOB-DTPA] nicht in erster Linie von Lipophilie resultierende sondern ihre Leber - Gallen - Aufnahme zusätzliche Experimente in lebenden Personen oder Zellen wäre notwendig , weitergehende Informationen über die biologische Verteilung sowie die Stabilität in vivo von 68 Ga [EOB zur Verfügung zu stellen -DTPA]. Insgesamt ist eine Anwendung als Bildgebungsmittel für die Perfusion und frühen hepatobiliären Phase denkbar.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
primovist Bayer - 0.25 M
gallium(III) chloride Sigma-Aldrich Co. 450898
water (deionized) - - tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH
hydrochloric acid 12 M VWR 20252.29
sodium hydroxide Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. 810925429
oxalic acid Sigma-Aldrich Co. 75688
ethyl acetate Brenntag GmbH 10010447
silica gel Merck KGaA 1.10832.9025 Geduran Si 60 0.063-0.2 mm
TLC silica gel 60 F254 Merck KGaA 1.16834.0001
methanol VWR 20903.55
ethanol Brenntag GmbH 10018366
eiethylether VWR 23807.468 stored over KOH plates
ammonia solution (25%) VWR 1133.1
pH electrode VWR 662-1657
stirring and heating unit Heidolph 505-20000-00
pump Ilmvac GmbH 322002
frit - custom design
NMR spectrometer Bruker Coorporation - Ultra Shield 400
mass spectrometer Thermo Fisher Scientific Inc. -
elemental analyser Hekatech GmbH Analysentechnik - EuroVector EA 3000 CHNS
deuterated water D2O euriso-top D214 99.90% D
Material/Equipment required for labeling procedures
68Ge/68Ga generator ITG Isotope Technologies Garching GmbH A150
pump and dispenser system Scintomics GmbH - Variosystem
hydrochloric acid 30% (suprapur) Merck KGaA 1.00318.1000
water (ultrapur) Merck KGaA 1.01262.1000
sodium chloride (suprapur) Merck KGaA 1.06406.0500
sodium acetate (suprapur) Merck KGaA 1.06264.0050
glacial acetic acid (suprapur) Merck KGaA 1.00066.0250
sodium citrate dihydrate VEB Laborchemie Apolda 10782 >98.5%
PS-H+ Cartridge (S) Macherey-Nagel 731867 Chromafix
apo-Transferrin Sigma-Aldrich Co. T2036
PBS buffer (tablets) Sigma-Aldrich Co. 79382
human serum Sigma-Aldrich Co. H4522 from human male AB plasma
flasks, columns, etc. custom design
pH electrode Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG 765-Set
binary pump (HPLC) Hewlett-Packard G1312A (HP 1100)
UV Vis detector (HPLC) Hewlett-Packard G1315A (HP 1100)
radioactive detector (HPLC) EGRC Berthold
HPLC C-18-PFP column Advanced Chromatography Technologies Ltd. ACE-1110-1503/A100528
HPLC glass vials GTG Glastechnik Graefenroda GmbH 8004-HP-H/i3µ
pipette Eppendorf -
plastic vials Sarstedt AG & Co. 6542.007
plastic vials Greiner Bio-One International GmbH 717201
activimeter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2010
tweezers custom design
incubator Heraeus Instruments GmbH 51008815
vortex mixer Fisons - Whirlimixer
centrifuge Heraeus Instruments GmbH 75003360
gamma well counter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2100
water for chromatography Merck KGaA 1.15333.2500
acetonitrile for chromatography Merck KGaA 1.00030.2500
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707
TLC radioactivity scanner raytest Isotopenmessgeräte GmbH B00003875 equipped with beta plastic detector

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