親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

Bioengineering

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Summary

親油性のドキソルビシンプロドラッグの調製および特徴付けのためのプロトコルは、1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- Nロード- [アミノ(ポリエチレングリコール)-2000]の(DSPE-PEG)ミセルが記載されています。

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Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

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Abstract

Introduction

化学療法は一般に、癌の種々の形態を治療するために使用されます。すべてではないが、ほとんどは、化学療法薬は、より多くの生命を脅かす条件に、このような吐き気や下痢などの管理がマイナー条件と異なる場合があり毒性の副作用を持っています。ほとんどの抗がん剤は毒性があるので、正常組織へのこれらの薬剤の非選択的露光は、必然的に毒性を引き起こします。したがって、選択的に癌細胞に薬物を送達することができる治療的アプローチのための大きい必要性があります。抗がん剤の投与と別の課題は、それらの難水溶性です。通常、可溶化剤は、これらの難溶性薬物を処方するために必要とされます。しかし、ほとんどの可溶化ジメチルスルホキシド(DMSO)、クレモフォールELなどの薬剤、およびポリソルベート80(ツイーン80)は、肝臓と腎臓毒性、溶血、急性過敏性反応や末梢神経障害を引き起こす可能性があります。1ので、安全で、生体適合性の製剤は、のために必要とされています貧しい人々の臨床使用LY可溶性抗癌剤。ナノキャリアは、上記の課題に対処するための薬物送達システムが期待されています。これらのナノキャリアは、リポソーム、2ナノ粒子、3ミセル、4-7ポリマー-薬物コンジュゲート、8および無機材料が挙げられる。9、いくつかのナノ医療製品は、( 例えば 、ドキシル、アブラキサン、およびGenexol)は癌患者を治療するための規制当局によって承認されています。 10

高分子ミセルは、正常抗癌剤を送達するために使用されているナノスケール薬物送達キャリアを、期待されている。4-7,11,12典型的な高分子ミセルは、自己組織化プロセスを介して両親媒性ポリマーから調製されます。コア - シェル構造化された高分子ミセルは、親水性シェルと疎水性コアを含みます。親水性シェルは、立体的にミセルを安定化し、血流での循環を延長することができます。疎水性コアは、効果的に疎水性Dをカプセル化することができますラグ。そのため、小さなミセルのサイズ(一般的には200nm未満)および長期循環特性により、高分子ミセルは、強化された透過性および保持(EPR)効果(受動的腫瘍標的)を介して腫瘍ターゲッティングを達成すると考えられています。

薬物負荷の安定性は、ミセルの能力を腫瘍ターゲティングのために重要です。最適な腫瘍標的化を達成するために、ミセルは、腫瘍部位に到達する前に、最小限の薬物の漏出を有し、まだすぐにがん細胞を入力した後に薬物を放出すべきです。製剤の安定性は、製品開発の実現可能性、ならびに開発された製品の貯蔵寿命を決定するために加えて、製剤の安定性は、製品開発のための必須要件です。最近、多くの努力は、送達担体への薬物の負荷を改善するためになされています。親油性プロドラッグアプローチは、脂質ナノ粒子及び乳剤に薬物負荷を改善するために検討されている戦略である。13,14 CONJ薬物と脂質のugationは大幅に親油性を向上させ、ナノキャリアの親油性成分でロードと保持を高めることができます。

ここでは、親油性のドキソルビシンプロドラッグロードミセルを調製するためのプロトコルについて説明します。まず、親油性プロドラッグをドキソルビシンの合成手順を説明します。その後、膜分散法を用いてミセルを生成するためのプロトコルが導入されます。この方法は、正常に我々の以前の研究で使用されてきた。それは、正常ミセル薬物送達のために使用されているため、5 DSPE-PEGは、ミセルを調製するための担体材料として選択した。15,16最後に、我々は、ミセルを特徴付けるために使用されるいくつかのインビトロアッセイを記載抗癌活性を評価するための製剤および。

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Protocol

DOX-PAの1の合成

  1. ドキソルビシン390mgのパルミチン酸ヒドラジドの243ミリグラムを秤量し、丸底フラスコに移します。
  2. ガラスシリンジでフラスコに無水メタノール150mlを追加します。ピペットでトリフルオロ酢酸(TFA)の39μLを加えます。マグネチックスターラーを用いて、暗所で室温で18時間、反応混合物を攪拌します。
    注:反応物質の量をスケールアップすることができ、またはダウンDOX-PAの異なる量を得ました。反応体の比率が同じ比率で維持されるべきです。 78 mgの1170ミリグラムの範囲でDOXの量を使用する反応は、通常の化学実験室で行うことができます。
  3. シリカゲルカラムを用いてDOX-PAの精製。17
    1. ロータリーエバポレーターで反応混合物中の溶媒を除去します。混合物の体積を約20 mlまで低下した後、シリカゲルを3gを加えます。乾燥粉末を得るために回転蒸発を続行し、トンを可能にするために、シリカゲルへの製品の吸着彼。乾燥粉末が形成された後、さらに30分間真空下でサンプルを保管してください。
    2. 溶媒としてジクロロメタンを用いてカラムにシリカゲル50gのパック。慎重にカラムに吸着した生成物を含有するシリカゲルのサンプルを追加します。
    3. 徐々にそれによって溶媒極性( 表1)を増加させる、メタノールの割合を増加させながら、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物でカラムを溶出します。
    4. 試験管(25ミリリットル/チューブ)における溶離液の画分を収集し、薄層クロマトグラフィー(TLC)によって進行状況を監視します。
    5. 純粋なDOX-PAを含む全ての画分を合わせ、乾燥粉末が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。さらに真空O / Nの下で生成物を乾燥。
  4. TLCによるDOX-PAの分析。
    1. TLCプレートの4センチメートル×8センチセクションをカット。スポット試料溶液TLCがMETを使用して毛細血管をスポッティングとプレートの底から0.5センチメートル溶媒としてhanol。
    2. ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を含有する現像室にTLCプレートを置き(3/1、v / v)でした。溶剤の深さはわずか0.5未満cmでなければなりません。
    3. 溶媒先端がプレートの上部に到達したときに現像室からプレートを取り外します。鉛筆で溶媒先端の​​位置をマークし、プレートを乾燥させます。サンプルを可視化するために、飽和ヨウ素蒸気を含む染色室にTLCプレートを置きます。
  5. 1 H核磁気共鳴分光法(1 H-NMR)によるDOX-PAの分析。18
    1. メチルスルホキシド-D6(DMSO)の1ミリリットル中にDOX-PAの15ミリグラムを溶解し、NMRチューブにサンプルを移します。
    2. NMR装置の磁石にNMR管を挿入します。溶媒としてDMSOを選択し、プロトンスペクトルを測定します。磁石からのNMRチューブを外します。 NMRの結果18を分析ます。

2。フィルム分散法によるDOX-PAミセルの調製

  1. DSPE-PEG(40 mg)をDOX-PA(4 mg)を10mlのガラスバイアル中の2mlのメタノールで溶解します。
  2. バイアル中の薄膜が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で有機溶媒を除去。
    注:また、膜を形成し、さらに、残留溶媒を除去し、真空デシケーター中でバイアルを維持するために、不活性ガス( 例えば 、アルゴンまたは窒素)下で有機溶媒を蒸発させます。
  3. 転写ガラスバイアルにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4の、DPBS)2 mlです。
  4. ミセルを生成するために、室温で3分間、超音波浴中でバイアルを置きます。
    注:超音波パワーは超音波風呂の異なるモデル間で変化します。薄いポリマー/薬物フィルムを分散させるのに十分な超音波パワーを発生させることができるユニットを選択します。このプロトコルで使用される超音波浴の出力電力は110 Wです。
  5. 短期記憶のために4℃でミセルを維持し、-20長いため℃〜-termストレージ。
    注:また、ミセルはまた、凍結乾燥し、使用前に水で再構成することができます。通常、何の凍結保護剤または凍結保護剤は、この製剤のために必要とされていません。

DOX-PAミセルの3キャラクタリゼーション

  1. ミセルおよび薬物封入効率のDOX-PA濃度の決意
    1. 1μg/ mlで、5μgの/ mlで、20μgの/ mlで、50μgの/ mlの、および100μg/ mlの:DOX-PAは、5つの異なる濃度のDOX-PA溶液を調製するため、DMSO中に前の手順で合成し溶解します。 490nmでのUV-VIS分光計でDOX-PAソリューションの吸収を測定します。 DOX-PAの薬物濃度と490nmのそれらに対応する吸収に基づいて標準曲線を生成します。
    2. DMSOの500μlの薬物負荷ミセル25μlの希釈します。 UV-VIS分光光度計で490nmの吸収を測定します。 3.1.1で作成した標準曲線を用いて薬物濃度を計算します。
    3. 以下の式を用いて封入効率を計算します。
      薬物封入効率(%)=(ミセル中の薬物の量)/(添加薬剤の量)×100%
  2. 動的光散乱と粒子サイズの特性(DLS)
    1. 1mg / mlの最終DSPE-PEG濃度にDPBS(pH7.4)中でミセルを希釈します。 Z平均寸法及び多分散性指数(PDI)を得るために、粒子サイズ分析器で2mLのサンプルを分析します。
  3. インビトロでの抗癌活性の評価
    注:適切な滅菌技術を使用し、バイオセーフティキャビネット内で動作します。
    1. DU-145ヒト前立腺癌細胞を含む細胞培養フラスコ( 例えば、T25)から細胞培養培地を除去し、DPBS 2mlの液(pH7.4)で細胞を洗浄します。
    2. 吸引DPBSを、トリプシン溶液1ml(0.25%)を添加し、細胞を剥離するために、37℃で2分間インキュベートします。
    3. 10メートルを追加ほとんどの細胞をフラスコから剥離された細胞培養培地のリットル(RPMI1640培地+ 10%ウシ胎児血清+ 1%抗生物質 - 抗真菌)。 15-ml遠心チューブと遠心分離機5分間千×gで細胞に細胞を移します。
    4. 細胞培養培地5mlで細胞ペレットを再懸濁し、血球計で細胞数をカウントするサンプルを除去します。 50,000細胞/ mlの濃度に細胞培養培地で細胞を希釈します。 96ウェル細胞培養プレート中に希釈された細胞懸濁液を加える(100μl/ウェル)。細胞接着を可能にするために18時間細胞培養インキュベーター(37℃、5%CO 2)で細胞をインキュベートします。
    5. 希釈DOXのジメチルスルホキシド、それぞれ0.1μM、0.5μMの最終薬物濃度を得るための(DMSO)溶液と細胞培養培地とDOX-PA DMSO溶液を、2μM、5μM、及び10μM、。 0.5%に上記のすべてのサンプルで最終DMSO濃度を保ちます。最終薬物COを得るために、細胞培養培地を用いてDOX-PAミセルを希釈それぞれ0.1μM、0.5μMのncentrations、2μM、5μM、及び10μM、。ブランクの細胞培養培地にコントロールを使用してください。
    6. インキュベーターから96ウェル細胞培養プレートを取り外して、ステップ3.3.5で調製した異なる治療剤を含む培地100μlの細胞培養培地を交換し(各群n = 4)。さらに72時間細胞培養インキュベーター(37℃、5%CO 2)で細胞をインキュベートします。
    7. 吸引培地、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)の0.5ミリグラム/ mlを含む培地100μlを加えます。
    8. さらに2時間、細胞培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。慎重に培地を除去し、ホルマザン結晶を溶解させるために100μlのDMSOを追加します。
    9. 波長570nmと670nmでの参照波長でマイクロプレート分光光度計で吸光度を測定します。
    10. 以下の式を用いて細胞生存率を計算します。
      試験 / 対照 )×100%
      注:一元配置分散分析(ANOVA)統計的検定を用いて異なるグループ間での細胞生存率を比較します。薬物濃度データ細胞生存率に基づいて、IC 50を計算ます。

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Representative Results

図1は、DOX-PAの合成スキームを示します。 DOX-PAは、pH感受性ヒドラゾン結合を通してドキソルビシンとパルミチン酸の結合により合成しました。パルミチン酸ヒドラジドのわずかに過剰に反応の完了を促進するために使用されました。この反応方法は、非常に高い効率およびドキソルビシンの少量は18時間の反応( 図2)の後に残っています。収率は約88%でした。反応の終わりに、DOX-PAは、シリカゲルカラムを用いて精製し、純粋な赤色の固体生成物を得ました。 DOX-PAは、精製されたDOX-PA( 図2)のための単一のスポットを示したTLCで分析した。 図3は、DOX-PA1 H-NMRスペクトルを示す 。ドキソルビシンおよびパルミチン酸の両方の特性NMRピークは、さらに結合反応の成功が確認され、観察されました。

図4に示されている。薬のない空白DSPE-PEGミセルは、透明な液体として表示されます。 DOX-PA DSPE-PEGミセルは、赤色の液体として表示されます。赤い色は、ミセルにロードされたDOX-PAによるものです。粒径分析の代表的結果を図5に示す。ブランクDSPE-PEGミセルためのZ平均平均粒径は17.0±0.5nmで(PDI = 0.034±0.019)でした。 DOX-PAの負荷がわずかにミセルの粒子サイズを増加しました。 DOX-PA DSPE-PEGミセルのためのZ平均平均粒径は25.7±1.6nmで(PDI = 0.407±0.035)でした。

ミセル製剤中のDOX-PAの濃度を490nmでの吸収に基づいて決定しました。 DSPE-PEGは、DOX-PA濃度の分析に干渉しないため、この波長で無視できる吸収を有します。ミセル製剤中のDOX-PAの濃度は、1.99±0.11ミリリットルミリグラム/および薬物負荷効​​率は99.3±5.7%でした。高い封入効率は、ミセルの疎水性コアにその保持を高めるDOX-PAの親油性の特徴によるものです。製剤は、優れた安定性を示しました。 3週間、4℃ - で保存した場合、目に見える沈殿はありませんでした。薬物濃度の有意な変化は、貯蔵中に観察されませんでした。

DU-145ヒト前立腺癌細胞は遊離ドキソルビシンの異なる濃度の遊離DOX-PA、及びDOX-PA DSPE-PEGミセルで処理しました。細胞生存率はMTTアッセイ( 図6)を使用して、72時間の処理の終了時に測定しました。細胞生存率の濃度依存性の減少が遊離ドキソルビシン(IC 50 = 0.10μM)、無料のDOX-PA(IC 50 = 0.33μM)、またはDOX-PAミセル(IC 50 = 0.25μM)でDU145細胞を処理することによって達成されました。遊離ドキソルビシンはあるが無料のDOX-PAまたは低濃度でDOX-PAミセル(0.1μMおよび0.5μM)よりも効果的で、DOX-PA群ではより高濃度(2-10μM)で遊離のドキソルビシンよりも細胞生存率の大きな減少を示しました。また、両方高く、低濃度でDOX-PAおよびDOX-PAミセルの間に有意な差はないように思われました。ブランクDSPE-PEGミセルは、薬物送達の担体材料として良好な生体適合性及びDSPE-PEGの安全性を示す(データは示していない)毒性を示しませんでした。

図1
図1ドキソルビシンの親油性プロドラッグの合成(DOX-PA)試薬および条件メタノールに溶解し、ドキソルビシン(DOX)、パルミチン酸ヒドラジド(PA)及びトリフルオロ酢酸(TFA)をRTで18時間攪拌しました。ダーク。トン= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2薄層クロマトグラフィー(TLC)(1)ドキソルビシンのTLC、(2)生の反応混合物、(3)パルミチン酸ヒドラジド、及び(4)DOX-PAの結合体。サンプルは(3/1、v / v)のジクロロメタンとメタノールの混合物で開発され、ヨウ素で染色した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
重水素化DMSO中のDOX-PAの 図3. 1 H-NMR。DOXとPAの両方からの特徴的なピークの存在は、結合反応の成功を示しています。://www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
ミセルの 図4. 外観。(A)DSPE-PEGミセルおよび(B)DOX-PA DSPE-PEGミセル。代表的な数値は空白のDSPE-PEGミセルとDOX-PA DSPE-PEGミセルの外観を示すために提示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5 粒径およびミセルのサイズ分布を示す。(A)DSPE-PEGミセル及び(B)DOX -PA DSPE-PEGミセル。ミセルのサイズは、動的光散乱によって決定されます。代表的な数値は、粒子サイズ及びサイズ分布を示すために提示されています。提示されたデータは、平均±SD(n = 3)である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
ミセル製剤の 図6. 抗癌活性は、DU145細胞を、MTTアッセイを用いて測定した72時間および細胞生存率のために処理しました。図に示されるデータは平均±SD(N = 4)です。 *、DOX処理した群と比較してP <0.01、。処置群DOX-PAおよびDOX-PAミセルとの間に統計的な差はありません。 IC 50は、薬物濃度データ細胞生存率を算出しました。p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1

DOX-PAの精製に使用される溶媒を溶離 表1 CH 2 Cl 2 / CH 3 OH。

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Discussion

本研究では、ミセルの調製のための単純、迅速なフィルム分散法を説明します。この方法は、水性環境中でコアシェル構造のミセルを形成する両親媒性ポリマー( 例えば 、DSPE-PEG)の自己集合特性を利用します。このミセルの調製方法は、いくつかの利点を有します。 1.これは、一般的に、リポソーム、ナノ粒子、およびナノエマルジ ​​ョンの調製に使用される(例えば、押出しまたは均質化のような)複雑なサイズ縮小工程の使用を回避する単純な処方プロセスを伴う。19 2。これは、良好な再現性を持っています。製剤を最適化し、確立された後、優れたバッチ間の一貫性を達成することができます。プロトコルは、超音波処理の強度及び時間のような製造プロセス変数の変動に耐性があります。 (このような透析アプローチまたはエマルジョン溶媒蒸発法など)他の方法は、フィルムの分散ミセルを調製するために利用可能であるが、この方法は、より便利で効率的です。従って、製薬産業におけるミセルの大規模製造における使用のために適合させる大きな可能性を秘めています。この方法の制限は、担体材料の自己組織化特性に依存するので、このような特性を有する材料に限定されることです。ポリマー材料の不適切な選択は、良好なミセル製剤を生成する際に障害をもたらし得ます。また、製造方法は、ポリマー/薬物フィルムを分散させ、ミセルの形成を促進するために超音波処理に依存しています。唯一の弱い超音波パワーがミセルを形成するために必要とされるため、ほとんどの市販の超音波浴が適当です。非常に弱い力を持つ超音波浴を使用している場合しかし、それは問題である可能性があります。

悪い薬物負荷と早期の薬物放出は、ミセル薬物送達のための主要な関心事です。このプロトコルでは、負荷を高めるために、親油性プロドラッグ戦略を開発しましたDSPE-PEGミセルにドキソルビシンる。脂質とドキソルビシンの結合が有意DSPE-PEGミセルの脂質コアを有する薬剤の互換性と相互作用を改善しました。プロドラッグ、DOX-PAは、酸性のpH応答性ヒドラゾンリンカーを介して脂質とドキソルビシンを結合させることにより合成しました。このリンカーは。したがって、DOXを安定的に中性pHでのプロドラッグとしてDSPE-PEGミセルにロードされている20,21酸性pHで中性のpHで安定して切断可能で、保存時に血液中の循環の中に最小限の薬物漏出を持っています。 DOX-PAミセルは、エンドサイトーシスを介して腫瘍細胞を入力すると、DOX-PAプロドラッグは、切断し、酸性のエンドソーム環境(pHは5-6)に応じて自由にDOXに変換されます。 DOXは、DOX-PAよりも親水性であるため、この変換は、DOXおよびミセルの疎水性コアとの間の相互作用を破壊し、したがってミセルからのDOXの迅速な放出を促進します。この革新的な設計上の特徴は、不完全な薬物放出を避けることができます非切断または遅い切断リンカーを用いて薬物複合体に関連する主要な問題である。22このアプローチは、他の薬物の送達に適用することができます。適切なリンカーの選択は、このアプローチの成功のために重要です。リンカーは、製剤の安定性を最大にするために、生理的環境下で安定であるべきです。リンカーはまた、効率的に親薬物を放出するために、腫瘍の微小環境( 例えば、pH、酵素など )でのトリガに応じて切断されるべきです。

このプロトコルでは、DOX-PAは、効率的に高い封入効率(〜100%)とミセルに装填しました。ミセル製剤は、優れた安定性を示し、薬物の沈殿又は薬物濃度を低下させることなく、少なくとも3週間無傷のままでした。これは、プロドラッグおよびDSPE-PEGミセルの脂質コア中の脂質部分との間の相互作用の増強によるものです。 compatibiエンジニアそれらの相互作用を増強する薬剤と担体分子のリティは、ミセルおよび他のナノキャリアのパフォーマンスを改善するための有望な戦略です。このアプローチは、薬物負荷を強化し、これらのナノキャリアのための前の成熟薬物放出を最小限に抑えることができます。適切な薬物/ポリマーペアの23の選択は、ミセル製剤を設計する上で重要なステップです。薬物分子の構造を変更することができる(プロドラッグアプローチ)、または担体材料の設計は、互換性を改善し、薬物/担体の相互作用を高めるために最適化することができる。また23 24、計算モデルが支援する有用なツールであることができますナノキャリアの最適化において、特定の特定の薬物のためにオーダーメイドに設計されたナノキャリアを準備することを可能にします。

要約すると、我々はここでドキソルビシンの親油性プロドラッグを合成する方法について説明します。薬物担持ミセルの調製および特徴付けのためのプロトコルもDESCRありますibed。膜分散法は、ナノスケール自己集合送達システムの多様を製造するための簡単​​かつ有望な方法です。ここで説明する特徴付け方法は、製剤及び製品開発プロセスの最適化を容易にすることができるため、nanomedicinesの特性を決定するためのインビトロアッセイにおいて標準として使用することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

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References

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