のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Published 8/20/2016
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Neuroscience

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Summary

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Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

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Abstract

神経生物学における重要な課題は、適切な動物の行動を導くためにどのように機能するかを神経回路を理解することです。 キイロショウジョウバエは、その複雑な動作、強力な遺伝学的手法、およびコンパクトな神経系に起因する、このような調査のための優れたモデル系です。研究所行動アッセイは、長い自然環境の特性をシミュレートし、対応する行動( 例えば走光性、走化性、感覚学習と記憶)1-3の基礎なる神経機構を研究するためにショウジョウバエで使用されています。特定の神経のサブセットを標識するトランスジェニックショウジョウバエ系統の大規模なコレクションの最近の可用性により、行動アッセイは、行動4-11でニューロンをリンクするために顕著な役割を担ってきました。一緒にデータ分析のための基本となる計算ルーチンと汎用性と再現性のパラダイムは、様々なgenotypと候補フライラインの迅速検査のために不可欠ですエス。特に有用な試験した動物、実験の期間および提示刺激の自然数で柔軟性がある設定がされています。選択肢のアッセイはまた、取得し、分析することが容易である再生可能なデータを生成する必要があります。ここでは、 ショウジョウバエが大きい4フィールドアリーナでハエの行動反応をアッセイするためのシステムおよびプロトコルの詳細な説明を提示します。セットアップは、単一の嗅覚刺激に対するハエの応答をアッセイするためにここで使用されます。しかしながら、同じ設定を複数の嗅覚、視覚的または光遺伝学の刺激、またはこれらの組み合わせを試験するために修飾することができます。嗅覚計の設定は匂いに応答するハエ集団の活動を記録し、計算の分析方法は、フライ行動を定量化するために適用されます。収集されたデータは、効率的なデータ収集および実験条件の最適化に不可欠であるの実験の迅速な読み出しを得るために分析されます。

Introduction

外部環境に適応し、対応する能力は、すべての動物の生存のために重要です。動物は、危険を避けるため、食品を模索し、仲間を見つけ、以前の経験から学ぶ必要があります。感覚系では、そのような視覚的、化学的および機械刺激のような刺激の多様を受信し、解釈し、復号することが中枢神経系にこれらの信号を送信するように機能します。脳はそのような食品用の餌や捕食者から逃げるよう認知された環境に基づいて適切なモータ動作を、指示します。外界を検出し、どのように脳がデコードし、意思決定を指示し、神経生物学における大きな課題であるかの感覚系を理解します。

キイロショウジョウバエは、どのように神経回路ガイド行動を調査するための強力なモデル系です。維持が簡単で安価であることに加え、 ショウジョウバエは多くの多様で複雑 ​​なステレオタイプの行動を示す、まだCOMPACでそう約100,000ニューロンの神経系をtは。強力な遺伝学的技術は、 ショウジョウバエのゲノムを操作するために存在し、トランスジェニック系統の数千人を選択的かつ再現性のニューロン10-13の同じサブセットを標識することが生成されています。これらのトランスジェニック系統を選択的に標識された神経細胞(活性化または阻害する)の活性を操作するために使用することができ、これらの操作は、どのように神経機能ガイド挙動を調査するために使用することができます。

複数の行動アッセイは、様々なショウジョウバエの行動を研究するために開発されてきた。 ショウジョウバエ 、多くの動物のように、このような、食べ物を見つけるの仲間を見つけて、危険を回避するなど、多くの行動の選択肢を、案内する臭いの感覚を使用しています。嗅覚は、したがって、外部刺激が検出され、適切な選択を導くために、動物の神経系によってどのように解釈されるか調査するための良い感覚システムです。このように、多数のアッセイがinvestigaのために開発されていますティンの幼虫と大人の嗅覚行動。伝統的に、 ショウジョウバエの嗅覚行動は、先天性アッセイするために使用され、嗅覚行動3を学習することができる2つの選択肢のT-迷路パラダイムによってアッセイしました。このアッセイでは、約50ハエは、2つの管の間の選択肢を与えている:1のチューブは、問題の臭気が含まれており、他の制御付臭剤(通常、臭気溶剤)が含まれています。ハエは選択をする時間の設定期間を与えられているし、別の部屋にいるハエの数がカウントされます。 T-迷路は、多くの実験のためのシンプルなアッセイであるが、いくつかの制限があります。例えば、嗅覚行動は、ただ1つの時点で測定され、この時点の前に作られた別の選択は破棄されます。同様に、集団内のハエの個々の行動は無視されます。また、T-迷路はエラーをもたらす可能性があるハエの手動カウントを、必要とします。最後に、2つだけの測定の選択肢があるので、この多くの場合、微妙な行動の変化を検出するのに必要な統計的検出力を低下させます。 2択T-迷路の代わりに、4象限(4フィールド)オルファクト14-18です。このアッセイでは、動物はアリーナの四隅が着臭空気の潜在的な供給源が充填された競技場を探ります。アリーナは4実験的に定義された臭気象限の形成を最大化するためにひだ星形状を有しています。臭いがコーナーの1に供給されている場合、それはそれだけで1象限に含まれています。動物の行動は、彼らが入ると臭いの象限を残すとして追跡し、簡単に3つの制御象限におけるそれらの挙動と比較することができます。 4象限嗅覚計アッセイは、このように大規模な実験的な舞台の上に匂い刺激に対する空間的・時間的行動応答を記録します。

4象限嗅覚計は、最初ペターソン 15及び獣医によって開発された。17オールを調査します個々の寄生ハチ目の工場行動反応。フォーシェ 18とSemmelhackと王16は、個々のショウジョウバエの嗅覚応答をモニターするためのセットアップを適応しました。 4象限嗅覚計は、試験臭気物質および条件の広い範囲を可能にする、魅力と反発応答にも同様に敏感です。カスタム書かれたフライ追跡ソフトウェア、アレックスKatsov 19によって開発され、現在ジュリアン・ブラウン(材料で詳述)によって維持されるが、4象限嗅覚計14,20-23のより最近の実装に追加の利点を導入しました。高い空間(27.5ピクセル/ cm)で、そのような任意の時点でのハエの位置、速度、加速度などの各種パラメータを抽出できます一時的な(毎秒30フレーム)の解像度、同時に100ハエまでアッセイすることが可能になりました。これは臭い〜20ハエ」行動反応のダイナミクスの調査を可能にします材料表に詳述する)は、他のビデオキャプチャソフトウェアを組み込むことにより、同様の構成は、柔軟な追跡期間を可能にし、より低いフレームレートで画像を撮影することによって、最大24時間のハエを追跡するために使用することができます。このオプションは、ハエの産卵行動を研究し、産卵選好14で自分の体の位置を比較しました。 4フィールド嗅覚計はまた、( 例えば 、嗅覚と視覚)マルチモーダル刺激に対する応答を研究するために使用することができる、または感覚刺激のプレゼンテーションと光遺伝学9または熱発生を起こす21刺激を組み合わせること。さらに、高い時間分解能がfoの軌跡の抽出を可能にしますアンサンブルデータセット内のrの各個別のフライ。したがって、この方法は、嗅覚ガイド下人口の行動や、個々の社会的相互作用の調査を可能にします。このアッセイによって生成されたデータは、行動画面の4フィールド嗅覚計の使用を可能にする、堅牢かつ再現性の高いです。

我々は、4象限嗅覚計のためにここにセットアップアセンブリを説明します。我々はさらに高度に濃縮されたプロピオン酸エチルに応じて、リンゴ酢と反発力に応じて、嗅覚の魅力をアッセイでの使用を実証します。最後に、我々は説明し、記録されたフライ追跡データの分析のためのサンプル・コードを提供します。

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Protocol

1.セットアップアセンブリ

  1. 提供描画(補足資料、SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf)によれば、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)のうち星形アリーナ(0.7センチメートルにより19.5センチメートル19.5センチ)を製造。アリーナは、商用またはカスタム機能によって製造することができます。
  2. 2枚のガラス板(厚さ2mmの20.25 CMで20.25センチメートル)を取得し、正確にダイヤモンドコーティングされたドリルビットを用いてガラス板の一方の中心に(〜直径0.7センチ)の穴をドリル。
  3. 行動アリーナのための光を通さない行動ボックスを製造しています。また、提供される図面(補足資料、SupplementalSketch_LightTightBox.pdf)によれば、赤外線CCDビデオカメラ用の光を通さないカメラボックスを製造しています。ボックスは、市販またはカスタム機能によって製造することができます。
  4. 後壁と行動ボックスの側壁にLEDアレイ上に空調ユニットをマウントします。温度プローブを配置リアルタイムの温度フィードバック及び調整のための側孔を介して動作ボックスで(詳細は図1及び 2を参照)。
  5. カメラにIRフィルタと円偏光板を取り付け、カメラボックスにアセンブリをマウントします。動作ボックスとカメラボックスは動作ボックス(詳細は図1及び 2を参照)のより良好な温度制御のためのガラス窓によって分離されています。
  6. カメラアダプタに赤外線CCDカメラを接続します。 USBコンバータにカメラアダプターを接続します。データ収集のためのコンピュータのUSBポートにUSBコンバータを接続します。
  7. 製造元の指示に従って、コンピュータ上のビデオコンバータ用のドライバをインストールします。必要に応じて、カメラの設定と取得パラメータの広い範囲にアクセスするためのUSBビデオコンバータの製造業者によって提供される画像処理ソフトウェアをインストールします。
  8. 出力「を通して空調ユニット(接続)温度コントローラの背面にある熱電対 ""温度コントローラの背面にある)と温度プローブ(スルー」温度コントローラへ。行動ボックス内にプローブを配置します。
    注:私たちのレイアウトの温度制御システムは、18°Cと30°Cの間のボックス温度を維持することができます。より高いまたはより低い周囲温度が神経活動を操作したり、シナプス伝達を阻害する実験熱発生を起こす(dTrpA1、TRPM8またはshibire TS)のために有用である可能性があります。ほとんどの実験のために、温度を25℃に維持されます。
  9. (詳細な回路図と接続金具については、 図1Bを参照てください)以下の手順で臭気デリバリーシステムを組み立て:
    1. 中央空気システムからの空気の入力を制御するためのエア圧力調整器を使用してください。中央Aからの空気を浄化するために圧力調整器に(炭を充填した)カーボンエアフィルタを接続IRシステム。
    2. 高解像度の流量計チューブによって規制複数のチャンネルからなる流量制御システムを組み立てます。
    3. 図1Bおよび図2Fに示すように、マニホールドを介して流量計チューブにカーボンエアフィルタからの出力を接続します。流量計を出る清浄な空気が部屋中に排出またはカスタムメイドの匂い室24に入力された場合に調整するために電子制御式3方電磁弁を介して流量計管の出力を指示します。
    4. 製造元のマニュアルに従って電磁弁コントローラをインストールします。
  10. 製造者のマニュアルに従ってデータ収集装置(DAQ)と電源に接続して電子エアフローメータを取り付けます。すべての実験の前に競技場の各象限に同じ流量を確認するために、DAQインタフェースソフトウェアをインストールします。

2.嗅覚刺激の準備

  1. 5臭気を準備プラスチック外容器から構成アリ室24は 、中央部とガラス内側容器、カスタムメイドのPTFE蓋挿入、元の容器の蓋を除去し、2一方向弁。
    注:PTFE蓋の周りにOリングが臭気灌流中臭気室からの空気漏れを防止するために使用することができます。回路図とチャンバーの写真については、 図2図1を参照してください。
  2. 溶媒対照のための4つの付臭剤のチャンバ、およびテストの付臭剤のための1つのチャンバを使用してください。 、(徹底的に実験前にミックス、試験臭気物質+適切な溶剤)溶剤や匂い物質希釈1,000μlのガラス容器を記入し、対応するプラスチック室内のガラス容器を配置(プラスチック容器に液体をこぼさないでください)​​、蓋を締め。常にテストの付臭剤と溶媒対照のためのクリーン室を使用してください。
    注:嗅覚の魅力は、ワットでリンゴ酢(5%酸度)の1/16希釈することによってトリガされてもよいですATER。対照的に、嗅覚反発動作は、鉱油中のエチルプロピオネートの10%希釈液を用いて研究することができます。これらの場合のコントロール刺激は、純粋な鉱物油と匂い室です。

3.フライの準備

  1. リアは、標準的なコーンミール培地上に飛びます。 30男性と標準ボトル内の30女性の親のハエを置き、それらを25℃または室温で5日間卵を産むしましょう​​。
  2. 各実験について、女性は簡単にCO 2麻酔下で飛ぶ新しくeclosed(<1日齢)25の男性と25を収集します。
  3. 2-4日のための標準的なフライ媒体とバイアルにハエをしてください。
  4. 実験前40-42時間、CO 2麻酔なしでハエを転送 約10 ML 1%アガロースゲルでバイアルに。これは彼らの運動活性を増加させることに貢献する食品、なしで加湿ハエを維持します。
    注:ハエの90%以上が飢餓に耐えなければなりません。いくつかの遺伝子型は癒す少ないですあなたは、40時間の飢餓を介して、それをすることができません。これらの例では、このような24から28時間のような短い期間は許容されるが、すべての実験条件と繰り返しのために同じことを保つべきです。

魅力と撥着臭剤4.行動応答

  1. 温度コントローラに切り替え、25℃に設定してください。
  2. 付臭剤室の出口にし、プッシュ・ツー・コネクト行動ボックスのフィッティングにチューブを挿入することにより、付臭剤室(対照および試験臭気物質)を接続します。
  3. 制御付臭剤空気流は100ミリリットル/分に等しいことを確認するために、エアフローメータを使用して、各象限に流量を確認してください。
  4. 70%エタノールで2-3回PTFEフライアリーナとガラス板をきれいにし、それらが完全に空気乾燥(〜3-4分間)することができます。
  5. クランプでアリーナにガラス板を貼り付けます。
  6. 転送は、ガラス板の1の穴から場にCO 2麻酔なしで飛びます。アフトえー転送は、エスケープからハエを防ぐために、穴の円形メッシュを配置します。
    注:CO 2麻酔は、 ショウジョウバエの挙動25に影響与えることが示されており、行動実験の24時間以内に使用すべきではありません。
  7. 光を通さない室にハエでアリーナを置き、プッシュツー接続し、アリーナの隅に行動ボックスのフィッティング室のドアを閉じて待つに取り付けられたチューブを接続することにより、4つの制御空気流を接続10-ハエが新しい環境に順応させるために15分。可能な場合は、バイアス実験結果を得る可能性のある最小の光漏れを回避するために、実験が行われている部屋の照明をオフに切り替えます。
  8. ハエは4制御空気の流れにさらされている5〜10分の対照実験を、実行します。
  9. ハエがアリーナ内に均一に分布していることを確認する(下記データ分析の項を参照)すぐにデータを分析し、インデックスが近くにあり名所それはアリーナ内の好みや回避の制御不能源( 例えば光外から漏れ、不均一な温度分布、不均一アリーナ、臭気汚染など)が存在しないことが確認されたよう0にこのステップは、必須です。ハエが不均等に分布しているか、その運動活性が低い場合は、ハエを破棄し、再び舞台をきれいに(4.4ステップ)と実験を繰り返してハエの新しいバッチを使用します。
  10. 3方弁または再差し込むコネクタチューブに切り替えることにより、セットアップにテスト付臭剤室を接続します。
  11. 5〜10分間のテスト実験を実行し、以下のセクション5で説明したようにデータを分析(も参照14および図3を参照)。 20分以上の記録は、計算処理が困難であり得るデータファイルをもたらすことができます。長い実験の記録が必要な場合は、速やかに停止し、追跡プログラムを再起動してください。これは実験的な記録間〜10秒のギャップが生じます。
  12. DiscarDハエ。
  13. 70%エタノール(ステップ4.4)で清掃アリーナとガラス板と、遮光性のエンクロージャ内のコネクタチューブを交換してください。実験を円滑に行うために、新しいクリーンな競技場を使用することができ、実験ランを行いながら汚れたアリーナは、掃除しました。
  14. 必要に応じて、ハエの新しいバッチと別の実験を実行します。いくつかの実験を同じ日に実行された場合、付臭剤は、前回のテスト実行からシステムに残されていないことを確認するために細心の注意を取ります。これは、通常、臭気物質の濃度が低いまたはCO 2の問題ではありませんが、実験ラン間の24時間のギャップまでの高度に濃縮された刺激のために必要とすることができます。付臭剤汚染が対照実験中に疑われる場合に加えて、フローチューブの後に全てのチューブを交換することができます。常に継続的にシステムをフラッシュするために、実験の間に乾燥空気を残します

5.データ解析

注:提案したフライ追跡取得softwar(材料で詳述)eは、取得時にリアルタイムでハエを追跡し、タイムスタンプと*​​ .datの形式で検出されたすべてのハエの座標を保存します。我々は、Matlabのフォーマットにデータを変換するためのカスタムメイドのMatlabのルーチンを開発し、そしてデータを分析します。コー​​ド例は、補足資料に提供されるが、実装の詳細は、データ収集のために使用されるソフトウェアに依存するであろう。

  1. 生データをロードします。アリーナの輪郭を次の空間マスクを作成し、それらがノイズ( 図4A、 補助コード MaskSpatialFiltering.m、Score.m、DrawCircularMaskを表すように、アリーナの外にあるすべてのデータポイントを削除するには、生データにマスクを適用します。 M)。
  2. このデータがノイズや非移動ハエによって生成された( 図4B、補足コードTemporalFiltering.m)である可能性があるように、3秒より長く0.163センチメートル/秒以下の速度で移動するすべてのデータポイントを削除します。
  3. 残りのデータを視覚化一度にすべてまたは単一の軌跡( 図3、 補足コード SingleTrajectoryViewer.m)としてそれらをプロットすることによってポイント。
    注:4-フィールドの匂い境界の位置は、おそらく、このような各付臭剤の特性などの要因、および使用されている空気流量の数に依存します。例えば、揮発性の高い臭気物質は、おそらくより完全に揮発性の低い臭気物質より臭気の象限を記入します。したがって、各付臭剤は、わずかに異なる臭気境界を示すことができる可能性があります。それは特定の場所から空気をサンプリングするために真空を使用し、その結果、スポットにおける臭気物質の濃度を破壊として臭気境界を測定するための光イオン化検出器を使用することは問題となり得ます。それにもかかわらず、臭気の境界を迅速にその場行動データに基づいて推定することができます。例えば、異なる匂いに応答して累積フライトラックに基づいて、臭気の境界が明確に、図3Cおよび3Dで観察することができます。
  4. カル対照実験は、プリファレンスの応答を生成していないかどうかを判断するために、また、付臭剤(または光遺伝学9)刺激に応答にアクセスするための吸引インデックスをculate。アトラクション指数(AI)を計算するには、コントロールまたはテスト記録の最後の5分を使用します。 1(絶対引力)と-1(絶対反発力)の間にあるアトラクションの測定値を取得するには、以下の式がAIを計算するために使用されます。
    式(1)
    N 試験は、試験象限におけるデータ点の数であり、N個の制御は、3つの対照四分円内のデータポイントの平均数です。プリファレンスは、ゼロに近い値によって示されないであろう、この尺度は、直感的です。しかし、それは正しく、付臭剤象限に位置しているハエの合計数の割合を示すものではありません。この測定値を得るために、割合指数(PI)を使用することができます。
    式(2) N 試験は、試験象限におけるデータ点の数であり、N totalは全4つの象限内のデータポイントの合計数です。この式は、0.25が無い行動嗜好( 図3E4C、 補足コード AttractionIndex.m)に対応して、0と1の間に入る尺度を提供します。
  5. 各繰り返しのためのハエの新しいグループを使用して、各実験条件の5-10繰り返しを実行します。コルモゴロフ-スミルノフノンパラメトリック検定( 図3F、MATLABでkstest2機能)を使用して、コントロールの状態の間、またはに対する吸引インデックスを比較。

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Representative Results

4象限嗅覚計アッセイの記録と大規模な行動空間上に多くのハエの歩行活動を分析します。臭気物質は、1つ、2つ、3つ、または4つのすべての象限に入る空気流に導入することができます。臭いの非存在下では、ハエが自由にすべての4つの象限の間を移動します。この動作は、それが非意図的なバイアスがアッセイに導入されていないことを示しているように観察することが重要です。これらのバイアスは、光、温度変化、空気流の差、又は臭気の汚染物質を含むことができる。 図3Bは、25男性の4象限オルファクトメーターにおける行動応答を示し、25女性は、空気を乾燥させるために飛びます。収集したデータから単一のフライトラックはまた、 図3Bに強調表示され、このハエは全体の行動アリーナを模索していることを実証されています。 5分の試験期間にわたって分析した全てのトラックの魅力インデックススコア(AI)はindicati、0に近いです臭気象限に魅力の欠如をngの。同様に、実験の割合指数(PI)は、ハエが5分間の試験期間中にすべての4つの象限にかなりも分配されたことを示し、0.24です。

魅力的な匂い物質への4-フィールド行動応答は、図3Cに示されています。リンゴ酢は、空気流に導入され、  テスト臭室にリンゴ酢の6.25%の希釈を配置することによって、左上の臭気象限気流。灰色で示した収集フライトラックはほとんどのハエが、この臭気象限に収集することを実証し、もはやすべての4つの象限を探るません。単色フライトラックは、フライはリンゴ酢臭象限に入ると、それは魅力的な匂いの象限に残りやすいことを示しています。実験のための0.94のAIはこの匂い物質に強い興味を示す1に近いです。 0.92のPIは、ハエの92%は、rのことを示しています分析期間中に臭気象限にemained。

撥匂い物質への4-フィールド行動応答は、図3Dに示されています。臭気室に配置された付臭剤プロピオン酸エチルの10%希釈左上空気ストリームの臭気源として使用しました。分析実験のためのまとまったフライトラックは臭気導か反発を示唆する、臭気象限の回避を実証します。単色フライトラックが、それはすぐに、臭気の象限に入ったフライは、匂いの象限を避けるために、顔を背けていることを示しています。 -0.68のAIは強い反発匂い物質応答を示す、反発を示し、-1に近いある、0未満です。実験のための0.06のPIは、追跡フライデータポイントの(中性臭実験における〜25%と比較して)わずか6%は、実験の過程で臭気象限に発見されたことを示唆しています。

図3Eは、AIとPIスコアとの関係を図、およびこれらの数字は魅力的または反発行動にどのように関係しますか。

堅牢かつ再現可能な嗅覚行動の4つのフィールドのアッセイ結果。これは、 図3Fに示すように、対照および実験条件の間の定量的比較を可能にし、また微妙olfactorの同定を可能に中立性から逸脱γ応答。

データは、高い空間及び時間分解能で得られるようにまた、そのような単一のハエの軌跡として行動応答、( 図3に示すように)多数の要因を検討することが可能であるだけでなく、中のハエの異なる活性ダイナミクスを特徴付けます臭気フィールド( 例えば 、方向及び速度19,20の変化)。

多くの場合、アリーナの頻繁なクリーニングが必要とされ、特に以来、各実験のための正確な同じ場所に4フィールドアリーナを配置することは困難です。提供されるスクリプトは、図4Aに示すように、第1のデータをフィッティングすることにより、これらのわずかな変動を補償分析します。この場合には、4つのフィールドアリーナの形状を算出し、この空間の外側にあるデータ点が除去されます。これらの追跡されたオブジェクトは、多くの場合、debファイルを表しますRISまたは誤って追跡された反射。彼らはアリーナ内にあるので、ノイズを表すものではないように、これらのデータ点は誤りのあるデータ分析防ぐために除去されることが重要です。同様に、アリーナ内のノイズまたは非移動ハエを表すことが追跡されたデータポイントを除去することも重要です。これを達成するために、解析スクリプトが( 図4Bに示すように)本質的に移動しないデータポイントを削除し、その利用(及びここで提供されます)。これらのデータポイントは少数派で通常は、まだそれらの保持は、分析中のエラーにつながります。

吸引インデックスと優先指数スコア( 例えば 図3に示すように、5分間の実験の終了時に)設定時間後に計算することができます。ハエが高い空間及び時間分解能で追跡されているので、同様の分析が実験を通して行うことができることに留意すべきです。これは図4Cに示されるジャンルランキングと割合ランキングスコアは、時間にわたって連続10秒ビンで計算されます。このような分析は、そのような匂い物質への慣れなどの実験を通して発生する可能性がある嗅覚の変化、のより良い理解を可能にします。

図1
1: 四象限オルファクトメーターの概略図 (A)の動作設定は、臭気デリバリーシステム、温度制御システム(図解ではない)、画像取得システム(IRは、照明や ​​コンピュータに接続されたIR CCDカメラLED)で構成されています4象限アリーナと光を通さない行動とアリーナボックス。赤い円は、図2(B)に示した対応する構成要素臭気送達システムの詳細な設計を示 ​​します。緑の文字がfの接続/変換サイズを表しますittings。 1/8 IDと1/4 ODのものはピンク色で標識されているのに対し、1月16日IDと1/8 ODのチューブが黄色で標識されています。略語:IR、赤外線; CF、圧縮フィッティング。 BF、ばらフィッティング、MNPT、男性ナショナルパイプスレッドが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2: 嗅覚アッセイのセットアップの写真 (A)カメラボックスと行動ボックスの広視野ビュー。 (B)の動作ボックス内のビュー。温度プローブ、コネクタチューブ、およびIR LEDアレイは、標識されています。 (C)四象限アリーナ。 (D)の動作ボックスに接続された臭気送達システムの広視野図。カメラボックスは、CCDカメラを明らかにするために除去されています。 (E (F)の例。 (G)高分解能流管は空気の流れを調節します。 (H)流管レギュレータの下流臭気デリバリーチューブとコネクタ。清浄な空気が臭気室を通過または部屋に放出される場合、(I)は、ソレノイドバルブを制御します。 (J)臭気室が一方向弁に接続され、付臭剤用の内側ガラス容器を含有しています。 (K)の挙動ボックスは、臭気デリバリーチューブに接続する外部のプッシュ・ツー・コネクトフィッティングが含まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
データの例は、四フィールド嗅覚アッセイを使用して生成された 4フィールドアリーナの(A)の回路図すべての4つの象限は、必ず乾いた空気灌流が含まれている場合(B)ニュートラル応答が観察されます。 (C)左上腹部から灌流リンゴ酢の6.25%希釈の観光名所応答。 (D)10%エチルプロピオネートによってトリガ反発行動。図2B-2Dでは、取得したデータから、単一の軌道がプロットされています。色のグラデーションは、青と赤の色は、それぞれ、記録の開始と終了であると、記録の時間経過を示すために使用されます。 (E)ジャンル指数(AI)とパーセンテージ指数(PI)の比較。 (F)の平均AIの無臭で3〜6の実験(コントロール)のは、リンゴ酢(ACV)と10%プロピオン酸エチル(EP)。エラーバーはSEMを示します。統計的な差は、コルモゴロフ - スミルノフTEによって評価しました。ST。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:データ解析の手順によって生成されるデータ例アリーナの外にあるデータポイントを削除するにはMaskSpatialFiltering.mによるデータの(A)空間フィルタリング、。。赤い丸は、アリーナの境界を定義するために使用される円の初期位置を示しています。黒丸は円を当てはめることによって取得し、最終的な位置は、データ(4-フィールド内部に斜線部分を灰色)に概説されています。レッドドットと黒の矢じりは、このフィルタリングステップの後に、データセットから削除されるデータ点を示しています。 (B)データの時間的フィルタリング、TemporalFiltering.mによって行われます。このフィルタリング工程は、非常にSLO移動データポイントを削除します彼らは非移動ハエによって、またはアリーナから汚れ/反射によって生成される可能性があるとして、すべてではないWLYか。赤い破線のボックスで囲まれた赤い点が、この濾過工程によって除去され、同一の座標を持つ〜6000データ点の位置を示しています。 (C)ジャンル指数(AI)とパーセンテージ指数(PI)、AttractionIndex.mによる実験の最後の5分間かけて10秒ビンで計算されました。これらの指標の時間プロファイルは、行動反応のダイナミクスに関する情報が含まれており、行動の詳細な分析のために使用することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明した4つのフィールドの嗅覚計は、野生型および変異体ショウジョウバエハエの大集団の嗅覚応答を研究するための汎用性の高い行動システムです。各実験は、(セットアップ、実験ラン、および洗浄を含む)〜1時間かかり、4-6実験は、日常的に毎日行うことができます。 5分間40~50ハエを使用する典型的なアッセイは、約45万を分析のためにデータポイントを追跡生成します。上記構成はまた、分から日の範囲の期間にわたって嗅覚に対する応答、または他の感覚刺激で他の昆虫または昆虫の幼虫の動きを監視するために、軽微な変更を加えて使用することができます。 4象限アッセイは、魅力と反発の両方の刺激の効果に敏感です。ほとんどの臭気物質は-0.9と0.9(式1)との間の吸引指数(AI)を生成します。 -1 -0.5の範囲内のAIがあるのに対し、1から0.5の範囲内のAIは、刺激に対するハエの強力な吸引動作を意味します強い忌避剤によってトリガ。一般的に言えば、制御匂いによって中立応答(乾燥空気、加湿空気、鉱物油)は0.1と-0.1の間に入る必要があります。 AIは、多くの場合、ハエは、臭気物質のプルーム、初期の魅力と新たな刺激に向けた自発運動の増加、および刺激に反応して最終的な脱感作に入るために必要な時間を反映して、テスト実験の過程を通して変化します。プレテスト制御の実行が不可欠であり、ハエは、所望の刺激の非存在下でアリーナ中に均一に分布していることを保証するために慎重に行わなければなりません。

アリーナでのハエの空間的なバイアスの最も頻繁な原因は、次のとおりです。私たちの経験では、ハエのように、わずかの気流の違いを検出することができるおそらく切断チューブに不均一な空気の流れ、または星形の競技場の不十分なクランプガラス板( 15 ml /分)。設定することによって改善することができるアリーナ、渡って不均一な温度分布競技場の均一な温度を確保するために弱く、空気流および/またはより長い事前取得期間(〜20分)より拡散生成する空調ユニット。黒いテープで開口部を封止することによって低減することができる温度プローブ用開口部を介して最小の光漏れ。アリーナ内またはセットアップが(アリーナ、流管は、遮光性の筐体などの金具が)完全に洗浄し、乾燥させ、数日間または可能な場合に交換する必要がある場合には、空気供給システム、中の残留臭気。

嗅覚機器のメンテナンスは、信頼性と一貫性のある結果のために重要です。プッシュツー接続挙動ボックスと空気入口とアリーナの内壁に継手は強い臭いが使用されている場合、すべての実験後、エタノールで洗浄し、完全に乾燥させなければなりません。ガラス板は、通常、プレートから残留臭気や汚れを除去するのに十分であり、70%エタノールで3回洗浄されるべきであるが、ヘキサンに有用ですハエ(長い炭化水素鎖からなる、例えば、フェロモン)によって堆積された有機化合物を除去することです。それは通常、嗅覚行動に影響を与える芳香族成分が、含まれているため、石鹸は一般的には推奨されません。動作ボックスは、システムからの残留臭気の除去を容易にするために、実験の間に乾燥空気入口( 例えば一晩)に接続したままにする必要があります。

ハエの運動活性が低い場合、それらは、しばしば騒々しい可変ジャンルランキングもたらす少なすぎるデータ点を生成することができます。長い飢餓記録時間は、この問題を解決するのを助けることができます。ハエが病気の場合は対照的に、飢餓の24-28時間は、一般的であれば、実験全体で一貫しているように運動活性を高めるために十分であろう。ハエの健康な状態を維持し、運動を増やすの間の微妙なバランスがあります。 40時間の飢餓は、出発点として使用され、後のように変更してもよいです実験結果に基づいて必要。観光名所インデックスは多少したがって飢餓時間の交絡の影響を避けるために、同じ期間のためのすべての実験動物を餓死することが不可欠である、飢餓の持続時間によって影響を受けることになります。長い飢餓時間は、通常(0に近い)反発応答が弱く作り、魅力的な応答が強いです。乾燥した空気制御空気流は、ハエを乾燥する傾向があり、より長い40分のために使用すべきではありません。

四象限オルファクトメーターは、単一刺激に16,18、単一または複数のハエの応答を研究するために、または刺激の選択優先度を研究するために使用されてもよいです。例えば、異なった臭いは、四象限のそれぞれに使用することができます。これはまた、臭気象限の境界を調べることにより、臭気の混合物に対する応答を決定するために使用することができます。追跡システムは、個々のトラックは、収集したデータから単離することを可能にするにもかかわらず、それがあることに留意すべきですこれらは単独で試験したときよりも、グループの一部としてアッセイした場合、個々のハエは異なる挙動を示すことが可能。例えば、ハエのグループが原因でハエ26物理的相互作用に臭気導かれた反発力の増加を示します。追跡システム及びレイアウトは、非嗅覚アッセイにおける使用のために適合させることができます。分析フレームワークは簡単に光遺伝学刺激のためのLEDアレイ9、またはthermogeneticsための熱板27を収容することができます。システムはまた、産卵行動14を研究するため 、例えば、多くの時間の時間スケールの行動の選択肢を研究するために適合させることができます。この場合には、取得フレームレートは、大きなデータファイルの生成を回避するように調整する必要があり、湿度および基質の供給源(1%アガロースゲル)産卵基質として提供される必要があります。

このセットアップの制限は、光遺伝学の任意の要素ならばハエがアリーナ - で上下IR反射オブジェクトとして追跡されていることですか熱発生を起こす実験はIRを反映し、無関係なデータポイントは、ポスト処理中に削除する必要があります。現在、異なるハエが連続的に区別可能であることができ、空間分解能でハエを撮影することもできないが、これは、より高度なビデオカメラを使用して、将来的に改善することができます。現在のシステムの別の制限は、ハエの運動が歩行動作を促進するために二次元に制限され、そして嗅覚によって誘発される飛行応答を防止することです。

付加的な自動化されたアッセイはまた、ハエの単一またはグループの嗅覚挙動を調査するために開発されていることに留意すべきです。ここに記載のアッセイに最も類似したデザインがBeshelと忠28によって開発された方法です。このアッセイでは、〜30ハエの応答は、小さな円形闘技場で監視されている臭いがアリーナWAに沿って1〜4の臭い口から配信される(4-フィールドアリーナの約四分の一の領域)LL、円形競技場の中央に穴を介して除去。小さいアリーナに加えて、他の設計の違いは、主に(代わりに4-フィールドアリーナのひだ壁によって指示されるように、付臭剤象限全体での)匂いポートの近くに集中する光の条件下で行われている行動、および臭気物質が含まれます。それにもかかわらず、円形競技場は、ハエの嗅覚応答をスクリーニングするのに適した方法であり、ここに記載のフライ追跡設計に適合させることができます。

別のアプローチは、同時に臭気に応じて多くの単一のハエの活動を監視することです。 Flywalkアッセイでは、個々のハエを小さな試験管に入れ、臭気物質は、チューブ29,30を介して灌流されたとき、その応答が追跡されます。順方向または逆方向の変更、または速度の変化は、付臭剤は、一般的に魅力的または反発ある場合に評価するために利用することができます。このアッセイは、四フィー​​ルドアッセイのような、自動的にフライMを追跡しますovementsなどを速やかに匂いの広範囲の嗅覚応答を測定するために使用することができます。しかし、4-フィールドとは異なり、このような軌道旋回角度や潜在的な社会的相互作用のような複雑な運動力学は、多分Flywalkアッセイ記録で逃しました。

単一の歩行ハエの自動追跡はまた、T-迷路型アッセイ31,32に適応されています。このアッセイでは、ハエは臭いがチャンバの中央にポートを介してのいずれかのチャンバの端部と、出口から灌流された小部屋に置かれています。ハエの位置も自動的に追跡されます。これを模倣し、単一のフライスケール、T-迷路の枠組みに関する。光遺伝学と組み合わせて、このアッセイは、嗅覚学習および記憶を媒介する神経回路をアッセイするために特によく適しており、単一のハエの嗅覚選好を評価するためにも使用することができます。 Flywalkと同様に、それはより大きな空間領域にわたって発生する可能性のある複合体活性の動態を監視することはできません、そのようなハエ集団においてのみ発生する食品を求める14を 、または動作中に発生するものなど。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

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References

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