مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

القامع الجينات السرطانية، البروتين p53، هو المنظم الأساسي لعدد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج والشيخوخة 1. وهو مسؤول عن الحفاظ على الاستقرار الجيني، وبالتالي من الأهمية بمكان للحفاظ على التوازن من موت الخلايا ونمو الخلايا. الطفرات في البروتين p53 شائعة في حالات السرطان وهي السبب الرئيسي لتعطيل البروتين p53 مما يؤدي إلى الخلايا السرطانية غير المنضبط انتشار 2. ومن المثير للاهتمام، والطفرات في البروتين p53 فقط لحساب ما يقرب من 25٪ من سرطانات الثدي مما يوحي بأن آليات أخرى مسؤولة عن فقدان وظيفة البروتين p53. وقد أظهرت الإسوية البروتين p53 اكتشفت مؤخرا أن overexpressed في عدد من السرطانات البشرية، ويمكن أن تعدل وظيفة البروتين p53 4،5. لقد أظهرنا سابقا أن الإسوي البروتين p53، Δ40p53، هو الإسوي أكثر أعرب غاية في سرطان الثدي، وupregulated بشكل كبير في خلايا سرطان الثدي، بالمقارنة مع TISS المجاور الطبيعيرق 6. وفي أعقاب ذلك، نحن transduced ستابلي خط خلايا سرطان الثدي البشرية MCF-7 إلى بإفراط Δ40p53 باستخدام ليغو-iG2-بورو + ناقلات (GFP +) 7. وقد استخدمت هذه الخلايا للتحقيق إذا عالية التعبير Δ40p53 يزيد معدلات تكاثر الخلايا في خلايا سرطان الثدي.

هناك العديد من الأساليب المباشرة وغير المباشرة لقياس انتشار الخلايا من الخلايا المستزرعة في المختبر 8،9. هذه لا يمكن أن يؤديها إما القياسات المستمرة مع مرور الوقت، أو المقايسات كما نقطة النهاية 10. الأساليب التقليدية لا تزال مفيدة، مثل عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. هذا الاختبار هو التكلفة المنخفضة ومقياسا مباشرا لعدد الخلايا، ولكنها لا تعتمد على عدد الخلايا الكبيرة وتدريب ذوي المهارات العالية لتقليل الخطأ ومستوى كبير الانحرافات من التهم الموجهة إليه. وقد أدت الحاجة إلى إجراء قياسات متوافقة مع صيغ الإنتاجية العالية لتطوير المقايسات multiwell لوحة. هذه المقايسات القائم على التألق قنينةإعادة أعداد الخلايا بناء على إشارة الانارة التي تتناسب مع النشاط الأيضي للخلية 11،12. وفي الآونة الأخيرة، سمحت بإدخال منصات التصوير نسبة عالية فيما يخص الأدوات الجديدة التي تراقب انتشار الخلايا في الوقت الذي توفر جمع البيانات المظهرية الكمي والنوعي، ويتضمن مجموعة متنوعة من أنظمة 13. كل من هذه الأساليب توفير السبل لقياس نمو الخلايا، إما عن طريق قياس أو نقطة النهاية فحوصات مستمرة، وتملك كل مجموعة من المزايا والعيوب فيما يتعلق حساسية، مرت من أعداد العينات، والمعلومات الخلية، والتي يمكن أن يكون وزنه وفقا لذلك اعتمادا على سؤال البحث.

يصف هذا البروتوكول ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في المختبر، مع كل طريقة استخدام نطاقات مختلفة من الحساسية، واستنساخ وصيغ لوحة متعددة أيضا. هذا البروتوكول يهدف إلى المقارنة بين استخدام تشا العد عدادة الكرياتmber، وبقاء الخلية فحص القائم على التألق، وتصوير الخلية، في قياس انتشار الخلايا على دوام 96 ساعة. للقيام بذلك، وتمت مقارنة نمو الخلايا transduced متجه (قدم مكعبة-7-ليغو) إلى خلايا transduced إلى بإفراط Δ40p53 (قدم مكعبة-7-Δ40p53)، وذلك باستخدام ثلاث كثافات مختلفة من الخلايا. وقد تم قياس انتشار الخلايا كل 24 ساعة لمدة تصل إلى 96 ساعة. تم العثور على كل أسلوب لديها مزايا وعيوبه، وهذا يتوقف على الهدف من التجربة، كل ما زالت هي طريقة قيمة لتوفير المعلومات عن معدل انتشار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلايا التحضير لانتشار فحوصات

ملاحظة: إعداد خطوط الخلايا اثنين بنفس الطريقة والبذور في نفس الشكل لكل منها طريقة لتحليلها.

  1. تنمو قدم مكعبة-7-ليغو وقدم مكعبة-7-Δ40p53 7 الخلايا 75-80٪ التقاء في تي 75 سم قوارير ثقافة 2 النسيج باستخدام الفينول الأحمر مجانا Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 200 مم L-الجلوتامين، 2 ميكروغرام / مل الانسولين و 1 ميكروغرام / مل بوروميسين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. التعامل مع الخلايا في السلامة الأحيائية العقيمة الطبقة مجلس الوزراء الثاني.
    ملاحظة: مقدار الوقت الذي يستغرقه لتنمو الخلايا لالتقاء يختلف تبعا لتخفيف البذر. استعدادا لطلاء الخلايا لفحوصات انتشار البذور، والخلايا في التخفيف 1: 3 في DMEM تستكمل والحفاظ في ظروف النمو الطبيعي لمدة 3 أيام حتى 75-80٪ confluency.
  2. لإزالة الخلايا من القارورة، تخلصي من وسائل الاعلام الىحاوية النفايات. يغسل فورا طبقة الخلايا مع 2 مل من قبل تحسنت التربسين 2X. نضح التربسين. إضافة مزيد من 2 مل من التربسين قبل تحسنت إلى طبقة الخلايا ومكان في حاضنة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    1. مرة واحدة فصل الخلايا، وغسل الخلايا مع حرارة تستكمل الطازجة DMEM 10 مل. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 491 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح بعناية والتخلص من طاف.
  3. resuspend الكرية خلية في 5 مل من DMEM تستكمل جديدة. إجراء تعداد خلايا لتحديد الكثافة الصحيحة البذور الخلايا في لوحات 96-جيدا.
    1. تمييع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 900 ميكرولتر 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS). وضع جهاز استشعار 60 ميكرون الجديد على مكافحة الخلايا الآلي. باستمرار المكبس وغمر استشعار في تعليق خلية المخفف. ببطء الافراج عن الغطاس على العداد الخلية. إزالة الاستشعار من فصول التوجيه الجامعي خليةnter عند اكتماله.
      ملاحظة: سيتم عرض عدد الخلايا على مكافحة الخلايا في خلية / مل.
  4. خلايا البذور في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر (في DMEM) في لوحة 96-جيدا في ~ 20٪ confluency للسماح للغرفة لنمو الخلايا وقياس انتشار أكثر من 3-5 أيام (انظر الجدول 1). البذور جميع خطوط الخلايا في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: للحصول على هذه التجربة، تم تقييم ثلاثة كثافات مختلفة من الخلايا لتحديد كثافة الخلية المثلى. وتتلخص أعداد الخلايا المطلوبة في الجدول 1. خلايا البذور في مناطق ذات كثافة أقل إذا كان مطلوبا قياس مزيد من النمو على المدى الطويل.
    1. لعدادة الكريات والمقايسات القائم على التألق، وإعداد لوحة واحدة في نقطة زمنية (أي 4 لوحات في الفحص). لفحص الخلايا تصوير، وإعداد لوحة واحدة فقط خلال مدة التجربة.
  5. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.

2. عدد تحديد خلية بناجي عدادة الكريات

  1. قبل دافئة التربسين على حد سواء المتوسطة وإلى 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية، فرن أو حمام مائي. وسائل الإعلام نضح من الخلايا في حاوية النفايات، وغسل مرة واحدة مع 30 ميكرولتر من التربسين 2X، ونضح التربسين.
  2. غسل الخلايا مرة أخرى مع 30 ميكرولتر من التربسين 2X، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق حافة لوحة لإزاحة الخلايا من لوحة. إضافة 50 ميكرولتر من DMEM تستكمل ومزيج خلايا قبل pipetting حتى تشكل خلايا تعليق خلية واحدة.
  3. إعداد عدادة الكريات عن طريق تنظيف السطح والغطاء الزجاجي مع 70٪ من الإيثانول.
  4. وضع غطاء زجاجي الانزلاق على غرف عد ويضعوا حتى يمكن رؤية "حلقات الانكسار نيوتن" بين حواف غطاء الانزلاق وعدادة الكريات.
    ملاحظة: هذه إشارة إلى أن تغطية الانزلاق التزمت بشكل صحيح إلى عدادة الكريات.
  5. ماصة بلطف 20 ميكرولتر من تعليق خلية تحت غطاء قابل للانزلاق، وملء غرفة الفرز من قبل الحركة الشعرية.وضع عدادة الكريات تحت التكبير 10x المجهر ووضع تصور لغرف العد والفرز في تخطيط الشبكة.
  6. عدد الخلايا في الساحات الخارجية 4 من تخطيط الشبكة. لتحسين دقة، كرر اتهامات الساحات الخارجية إضافية إذا لزم الأمر، أو حتى العد وصلت 70-100 الخلايا 14،15.
    1. حساب تركيز خلية لكل مليلتر على النحو التالي: متوسط ​​عدد الخلايا في عامل مربع س التخفيف (في حال استخدامها) × 10 4
  7. كرر الخطوات من 2،1-2،8 كل 24 ساعة لمدة 96 ساعة بعد البذر.

3. تحديد انتشار خلية باستخدام الفحص على أساس التلألؤ

ملاحظة: هذا قياس نقطة النهاية. حالما يتم إضافة كاشف للخلايا، لا يمكن إلا أن يكون كميا لوحة واحدة.

  1. كاشف التلألؤ ذوبان في 22 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
  2. المزيج بلطف كاشف كتبها قلب الزجاجة للحصول على مزيج متجانس.
  3. تتوازن لوحة واحدة من خلايا المصنف (من الخطوة1.5) في RT لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف التلألؤ على كل جانب. خلط محتويات على شاكر المداري لمدة 2 دقيقة. تسمح لوحة لاحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. إعداد تجربة التلألؤ باستخدام متعددة وضع برنامج لوحة القارئ.
    1. تشغيل متعدد الأوضاع قارئ لوحة وفتح البرنامج. في "إدارة المهام"، حدد "تجارب" و "إنشاء new'.Select 'الملف' من شريط الأدوات الجانبي، وتحت عنوان" بروتوكول "علامة التبويب، حدد" الإجراء ".
    2. اختر 'جرينير 96 مسطحة القاع "نوع لوحة، والتحقق من مربع" استخدام غطاء ". تحديد العمل 'قراءة' تحت خانة "طريقة قراءة '. اختر 'التلألؤ "طريقة الكشف. انقر فوق "موافق".
    3. في مربع خطوة قراءة، تحديد الآبار التي يتم مسحها ضوئيا ضمن علامة التبويب "لوحة كاملة، وتحديد الآبار للعمل الآبار كما فارغة.
    4. تعيين عامل التصفية لتعيين مرشح فارغة (على سبيل المثال، والمكونات، إم: حفرة، المرآة: لا شيء). تعيين مكسب ل135، مع الوقت التكامل من 0.5 ثانية لكل بئر وارتفاع قراءة من 6.5 مم. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات للقراءة التلألؤ.
  6. أداء الفلورسنت مقروءة
    1. إخراج حامل لوحة عن طريق اختيار علامة التبويب "السيطرة أداة 'ثم اضغط على" لوحة out'.Place وحة 96 جيدا على حامل لوحة، وضمان غطاء على. إغلاق حامل لوحة بالضغط على "لوحة في" علامة التبويب تحت "السيطرة أداة". انقر على "قراءة الآن" من شريط الأدوات لأداء القراءة الانارة.
    2. تصدير القياسات النسبية وحدة الانارة (RLU) لكل بئر إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
  7. كرر الخطوات من 3،1-3،6 لتسجيل انتشار كل 24 ساعة تصل إلى 96 ساعة بعد البذر الخلايا.

4. تحديد عدد الخلايا باستخدام جهاز التصوير خلية

  1. إعداد تجربة التصوير الخلية باستخدام متعددة وضع البرامج خلية تصوير
    1. تشغيل متعدد الأوضاع تصوير الخلية وعشر مفتوحةبرنامج البريد.
    2. في "إدارة المهام"، حدد علامة التبويب "تجارب" و "إنشاء new'.On على" ملف "شريط الأدوات، انقر على '' علامة التبويب وفتح 'بروتوكول الإجراء" tab.Select "مجموعة درجات الحرارة' العمل. تعيين حاضنة ل'على' وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وتحقق "سخن" قبل المتابعة مع مربع الخطوة التالية ". انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات.
    3. تحديد العمل 'قراءة'. انقر على 'صورة' طريقة الكشف، اختر 'نقطة النهاية / الحركية "قراءة نوع ونوع البصريات" مرشحات ". انقر على "OK'.Click على 'علامة التبويب لوحة كاملة' وحدد الآبار على طبق من ذهب إلى أن تصوير. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات.
    4. حدد الهدف 2.5X من القائمة المنسدلة خيارات "الأهداف". ضمن علامة التبويب "قنوات"، حدد قناتين: GFP 469، 525 والميدان مشرق. تحقق "السيارات" التعرض لكل من القنوات وتحديد التعرض السيارات أيضا.
    5. لتحديد التسليمس ضبط التركيز، اختر 'التركيز التلقائي "وانقر على" خيارات ". لخيارات التركيز التلقائي، حدد "مسح ثم التركيز التلقائي" الأسلوب. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات.
    6. ضبط الأفقي والرأسي تعويض من مركز جيد (ميكرون) إلى 0.Select لمسح عدة صور لكل بئر في المونتاج 3 × 2، مع التباعد الأفقي (ميكرون) = 2881 والتباعد العمودي (ميكرون) = 2127. انقر فوق "موافق" لحفظ إعدادات الإجراء.
      ملاحظة: انظر الجدول رقم 2 للمعلمات القراءة.
  2. أداء مقروءة تجربة على لوحة مختارة
    1. انقر على علامة التبويب "السيطرة أداة 'وحدد" لوحة خارج' function.Place لوحة 96-جيدا في حامل لوحة، وضمان غطاء على. ضمن علامة التبويب "السيطرة أداة"، حدد "لوحة في" وظيفة. اختر 'قراءة الآن "من علامة التبويب لوحة. تكرار قراءة كل 24 ساعة تصل إلى 96 ساعة بعد البذر.
  3. تحليل عدد خلايا باستخدامخلية تصوير البرنامج.
    1. تحليل صورة، انقر فوق علامة التبويب "البيانات" على لوحة المصورة، حدد "الصورة [GFP 469، 525 + الحقل مشرق] '. انقر مرتين على تصويرها بشكل جيد.
    2. انقر على الصورة المحملة. اختر 'تحليل' وحدد صورة واحدة من المونتاج ليتم تحليلها. انقر على "OK'.Check على" GFP "قناة فقط، وتعيين المعلمات على النحو المبين في الجدول 3. انقر على" ستارت "لتطبيق المعلمات إلى الخلايا المصورة.
    3. مراقبة قناع عد الخلايا وضعت على الخلايا المصورة، والذي يستخدم لتحديد عدد الخلايا في صورة. انقر على "تطبيق التغييرات" والحفاظ على هذه الإعدادات لكل لوحة تصوير كافة مراحل التجربة.
    4. مرة واحدة إلى الوراء في لوحة المصورة، انقر على انخفاض "البيانات" من القائمة المنسدلة واختر 'خلايا'. هذا وسوف تولد خلايا الكلي لكل بئر.
    5. تصدير جميع البيانات إلى جدول بيانات عن طريق النقر على علامة التبويب "تصدير" لمزيد من التحليل سو عدد الخلايا لكل بئر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدراسة أساليب مختلفة لقياس انتشار الخلايا المستزرعة، وتكاثر الخلايا من قدم مكعبة-7-Δ40p53 خلايا transduced وبالمقارنة مع غير transduced-قدم مكعبة-7-ليغو سرطان الثدي خط الخلية. الطرق الثلاثة التي تم مقارنة - التصوير طريقة عدادة الكريات التقليدية، بقاء الخلية التلألؤ الفحص، وخلية analysis- الموضحة في الرسم التخطيطي (الشكل 1). ولكل طريقة مزايا وعيوب لقياس بدقة عد الخلايا مع مرور الوقت، والأسلوب الأكثر فعالية يعتمد على متطلبات نقطة النهاية من التجربة والمعلومات التي يمكن الحصول عليها لسكان الخلية.

تم قياس نمو قدم مكعبة-7-ليغو وخلايا MCF-7- Δ40p53 بعد 24 ساعة لمدة 4 أيام. كما هو مبين في الشكل رقم 1، وكانت المصنفة خطوط الخلايا اثنين على ثلاث كثافات مختلفة من الخلايا (1.5 × 10 3 3؛ 5 × 10 3 خلايا / جيد) وخلية العد تم إجراء 24، 48، 72 و 96 ساعة بعد البذر. أظهر كل طريقة زيادة تكاثر الخلايا، وذلك باستخدام عدادة الكريات، مقايسة على أساس التلألؤ، وتصوير الخلية (أرقام 2A وباء وجيم، على التوالي) أكثر من 96 ساعة. وقد شهدت أكبر زيادة في تكاثر الخلايا في أعلى كثافة الخلية (5 × 10 3 خلايا)، وأيضا أظهرت النتائج الأكثر استنساخه في كل نقطة زمنية، مما يشير إلى أن تكون هذه هي كثافة الخلية المثلى لقياس انتشار في هذه الخلايا. لم يكن هناك اختلاف كبير في تكاثر الخلايا بين خطوط الخلايا.

وتمت مقارنة قياس تكاثر الخلايا بين طرق مختلفة عن طريق تحليل الانحدار الخطي 6 (الشكل 3؛ الجدول 4). كان هناك ارتباط كبير بين كل من طرق مختلفة اختبارها، وعند مقارنة جانتشار الذراع في كل من كثافة الخلايا في كل من خطوط الخلايا (الشكل 3A و ب). وقد لوحظ أقوى علاقة بين المقارنة للمقايسة على أساس التلألؤ، وتصوير الخلية (R 2 = 0،8899، ص ≤0.0001، R 2 = 0.9805، ص ≤0.0001، الشكل 3A و ب، على التوالي).

ويرد التمثيل المرئي للتكاثر الخلايا باستخدام تصوير الخلية (الشكل 4). كما يستخدم هذا الأسلوب قياسات مستمرة من لوحة واحدة، والخلايا يمكن تصوير كل 24 ساعة حتى الخلايا تصل إلى ما يقرب من 100٪ التقاء. كما هو مبين في الشكل 2، كانت معدلات نمو الخلايا Δ40p53 قدم مكعبة-7 قدم مكعبة-7-ليغو وقابلة للمقارنة في جميع نقاط الوقت. وهذه الطريقة توفر المعلومات الخلوية مفيدة، بما في ذلك القدرة على رصد بصريا نمو الخلايا عبر عدة أيام، والمقارنة بين حجم الخلية ومورفو خليةبليد الحركة بين خطوط مختلفة من الخلايا.

شكل 1
الشكل 1: الرسم التخطيطي لثلاثة طرق مختلفة قياس انتشار الخلايا خلايا المصنف في ثلاثة كثافات مختلفة من الخلايا الى عدة لوحات 96-جيدا والمحتضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة تصل إلى 96 ساعة. وقد تم قياس كل 24 ساعة، تكاثر الخلايا إما عن طريق استخدام عدادة الكريات، فحص أو خلية التصوير القائم على التألق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: القياسات تكاثر الخلايا بعد التهم 96 ساعة خلية تم قياس كل 24 ساعة لمدة 96 ساعة في قدم مكعبة-7-الساقيا وقدم مكعبة-7-Δ40p53 الخلايا المصنفة في ثلاث كثافات مختلفة من الخلايا. تم قياس عدد خلايا باستخدام (أ) عدادة الكريات في خلية / مل، (ب) باستخدام الفحص القائمة على التألق في وحدات الانارة النسبية (RLU)، أو (ج) عدد خلايا المستمر باستخدام جهاز تصوير الخلايا في خلية / صورة. وأظهرت الظروف لتصوير خلية في الجدول رقم 2. جميع التجارب تمثل متوسط ​​ثلاث تجارب مستقلة، ± وSD الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة قياس انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي تم إجراء تحليل الانحدار الخطي للمقارنة بين العلاقات المترابطة بين مختلف م ethods فحص لقياس انتشار الخلايا في الفقرة (أ) خلايا MCF-7-ليغو و (ب) خلايا MCF-7-Δ40p53. تم حساب معامل الارتباط لبيرسون وأهمية تحديد (ع <0.05) بين أساليب مختلفة قياس تكاثر الخلايا. كل النتائج تمثل متوسط ​​± SD ومن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: صور GFP إيجابية قدم مكعبة-7-ليغو وقدم مكعبة-7-Δ40p53 خلايا سرطان الثدي صور الممثل من الخلايا من 5 × 10 3 خلايا المصنف تصويرها باستخدام جهاز تصوير خلية كل 24 ساعة. يمثل شريط مقياس 1000 ميكرون. وتتلخص المعلمات للتصوير خلية في الجدول 2. أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كثافة الخلايا (خلايا / جيد)
نوع من الخلايا 1.5 × 10 3 3.0 × 10 3 5 × 10 3
قدم مكعبة-7-ليغو 76 ميكرولتر في 8.4 مل سائل الإعلام 152 ميكرولتر في 8.3 مل سائل الإعلام 254 ميكرولتر في 8.2 مل سائل الإعلام
قدم مكعبة-7-Δ40p53 93 ميكرولتر في 8.4 مل سائل الإعلام 185 ميكرولتر في 8.3 مل سائل الإعلام 308 ميكرولتر في 8.2 مل سائل الإعلام

الجدول 1: خلية البذر أحجام التداول لمدة 96 لوحات جيدة.

"FO: المحافظة على مع next.within صفحة =" دائما "> قراءة المعلمات نوع لوحة 96 جيد طريقة صورة موضوعي 2.5X اللون GFP (469، 525)، مشرق الميدان تعرض السيارات تركز السيارات (المسح الضوئي ثم التركيز التلقائي)

الجدول 2: قراءة معلمات التصوير الخلية باستخدام جهاز التصوير الخلية.

الجدول 3: التصوير معلمات لتحليل عد الخلايا.

المعلمات التصوير
عتبة 5000
حجم الكائن الحد الأدنى (ميكرون) 30
حجم الكائن الحد الأقصى (ميكرون) 300
قدم مكعبة-7-ليغو
ساحة R ف قيمة
عدادة الكريات مقابل الفحص القائمة على التألق 0.6301 0.0021
تصوير الخلية مقابل عدادة الكريات 0.7524 0.0003
فحص القائم على التألق مقابل تصوير خلية 0.8899 <0.0001
قدم مكعبة-7-Δ40p53
ساحة R ف قيمة
عدادة الكريات مقابل لوفحص القائم على minescence 0.8983 <0.0001
تصوير الخلية مقابل عدادة الكريات 0.9303 <0.0001
فحص القائم على التألق مقابل تصوير خلية 0.9805 <0.0001

الجدول 4: خطي تحليل الانحدار من ثلاثة طرق انتشار مختلفة اختبارها.

طريقة مزايا عيوب الملاحظات الفنية الناتج النهائي
عدادة الكريات تكلفة منخفضة خطأ بشري عالية ماصة عدة مرات لإعداد تعليق خلية واحدة خلية / مل
يتطلب الحد الأدنى من المعدات يتطلب تعليق وحيد الخلية أداء تهم متعددة لتحقيق الدقة
عدد خلايا المباشر ارتفاع عدد الخلايا اللازمة لتقييم دقيق لعدد خلايا
نقطة النهاية
فحص القائم على التألق استخدام مع صيغ multiwell لوحة الكواشف مكلفة احم من الضوء النسبية الفلورسنت وحدات (RLU) / جيد
من السهل على أداء يتطلب الانارة قارئ لوحة تشمل آبار المراقبة لتحديد التلألؤ الخلفية
فحص سريع درجات الحرارة الحساسة
يقدم معلومات بقاء الخلية متغير اعتمادا على النشاط الأيضي للخلايا
قياس غير مباشر
نقطة النهاية
تصوير خلية القياس المستمر تصوير مكلفة ومن المقرر ضمان تصوير الخلية إلى 37 درجة مئوية خلية / صورة
التحكم في درجة الحرارة مهارة مكثفة تجنب اهتزاز لزوم لها أو تهتك الخلايا
يوفر المعلومات الخلوية متغير تبعا للالتقاء الخلايا
فعالة من حيث التكلفة (إذا كان لديك تصوير) عدد نسبي
القياس المباشر
التصوير الآلي للشكل multiwell لوحة

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول تم فحص ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في الخلايا المستزرعة. كان كل طريقة قادرة على قياسات متكررة ودقيقة من تكاثر الخلايا أكثر من 96 ساعة، وكانت النتائج مماثلة بين كل من طرق اختبار (الشكل 2 و 3). كلا الفحص القائمة على التألق وطريقة التصوير الخلية تنتج نتائج أقوى، والتي تبين زيادة خطية في تكاثر الخلايا بعد 96 ساعة (الشكل 2B، ج). بالإضافة إلى ذلك، التصوير الخلية على مر الزمن صورت لا يوجد فرق كبير في معدلات النمو بين خطوط الخلايا transduced وغير transduced (الشكل 4).

هناك العديد من مزايا وعيوب كل طريقة فحص في هذا البروتوكول، انظر الجدول 5 للحصول على ملخص. طريقة عد الخلايا التقليدية باستخدام عدادة الكريات هي طريقة منخفضة التكلفة التي تتطلب الكواشف إضافية قليلة جدا أو effoغ لإعداد وتشغيل. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة quantitates تعداد الخلية المطلق في خلية / مل 14. ومع ذلك، هناك عيوب خطيرة، والتي تشمل تستغرق وقتا طويلا طبيعة عد الخلايا، ومعدلات الخطأ العالية التي ينتج عنها انحرافات كبيرة بين التهم، وحقيقة أن مجموعة كبيرة من وأعداد الخلايا ضرورية لتعداد خلايا دقيقة. ويمكن ملاحظة ذلك في الشكل 2A، حيث أظهر عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات نتائج متباينة في كثافة الخلايا منخفضة، والانحرافات المعيارية كبيرة في نقطة زمنية لاحقة. هذه العيوب تجعل هذه الطريقة مفيدة لعد الخلايا من عينات صغيرة الحجم، وغير كافية لقياسات عالية الإنتاجية الكبيرة التي تحتاج إلى أحجام أصغر لوحة وكثافة البذر. يمكن تخفيف هذه القيود إذا تم زيادة كثافة الخلايا، مثل أن الحد الأدنى لعدد الخلايا عدها بدأ في عتبة أكبر من 100 خلية. أكثر المخفف تعليق خلية، أو خفض الخلية دensity، وفرصة أكبر للعد أقل من 100 خلية، وبالتالي زيادة التباين بين يعيد 15. ومع ذلك، وهذه الطريقة لا تصلح ل96 لوحة جيدا، ويرجع ذلك إلى منطقة سطح الخلية منخفضة، وبالتالي، عدم كفاية عدد الخلايا التي يمكن استخدامها في التحليل. وهذا يؤكد عدم وجود قدرات إنتاجية عالية من هذه الطريقة والعيب واضحا للمستخدمين الذين يحتاجون إلى هذه القدرة.

يحدد الفحص القائمة على التألق بقاء الخلية عن طريق قياس كمية ATP، الذي هو مقياس وجود خلايا نشطة عملية الأيض 16. تم تصميم هذا الاختبار لفحص إنتاجية عالية من عينات متعددة في شكل لوحة البئر 96 لتحديد تكاثر الخلايا. هذه طريقة بسيطة quantitates تكاثر الخلايا كوحدة التلألؤ النسبي (RLU) باستخدام قارئ لوحة، والذي يتناسب مع الحاضر ATP في الخلايا النشطة في عملية الأيض. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو روقال انه كلف من كاشف، والاعتماد على القياس على النشاط الأيضي للخلايا. شروط زراعة الخلايا المختلفة، مثل نقطة درجة الحرارة أو دورة الخلية الوقت، يمكن أن تؤثر بسهولة كمية ATP التي تنتجها الخلايا، وهو يتناسب طرديا مع إشارة الانارة الناتجة عن فحص 17. وبالتالي، فمن المهم تحديد تجريبيا أن ظروف التجربة لا تتدخل في النشاط الأيضي للخلايا ويحتمل أن تعيق إشارة الانارة النسبية التي تولدها الخلايا.

والطريقة الثالثة فحص لتحديد انتشار الخلايا جهاز تصوير الخلايا الحية والبرامج لإجراء تعداد خلايا النسبي. تصوير خلية لديها قدرات إنتاجية عالية كما أنه يمكن أن يكون آليا لالتقاط صور متعددة لكل بئر، في الوقت الحقيقي مع التحكم في درجة الحرارة، وذلك باستخدام الخلايا نفسها خلال مدة الفحص. كما هو مبين في الشكل (4)، ويمكن أن يكون تكاثر الخلايا مonitored في نفس اللوحة على دورة الزمن، والتي يمكن أن توفر معلومات إضافية حول السكان الخلية جنبا إلى جنب مع تحليل عد الخلايا. هذا هو مفيد جدا لأنه يزيل التباين عبر لوحة والخلايا الخطأ البذر، الذي هو شائع في 96 صيغ لوحة جيدا. البرنامج المصاحب للتصوير الخلية يسمح لتحديد الكميات من عدد الخلايا باستخدام المعلمات الواردة في الجدول رقم 2 و 3. ولذا فمن المفيد في وضع الإنتاجية العالية، ويمكن بسهولة أن المضاعفة إلى فحوصات أخرى لقياس الوظائف الخلوية مثل موت الخلايا المبرمج أو السمية الخلوية. والعيب الرئيسي لهذا النظام هو البرمجيات، والذي يقتصر في قدرته على تقسيم الأشياء مؤثرة. في حين أنها يمكن أن تؤدي هذه الوظيفة في الخلايا التقاء أقل، فإنه يشكل قيدا رئيسيا للمقايسة، وبالتالي يتطلب من نوع الخلية الأمثل محددة. أيضا، في حين أن التجارب الفردية باستخدام التصوير هي تكلفة منخفضة جدا على نطاق ولوحة من قبل لوحة، فإن هذا الأسلوب علىحيث التكلفة لاي فعالية إذا تم تعيين أداة بالفعل في المختبر. لذلك، وهذا يوفر طريقة جديدة لقياس انتشار الخلايا من الخلايا المستزرعة، ولها الميزة الرئيسية للا تتطلب الكواشف إضافية، وغير قادرة على 96 لوحة جيدا العد الآلي، مما يجعل هذه الطريقة مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. هذا هو تحسن كبير على طريقة عد الخلايا عدادة الكريات التقليدية، وهذه تكلفة خيار أكثر فعالية لفحص القائم على التألق.

الخطوة الحاسمة عند استخدام تصوير الخلية خلال تحليل الصور الملتقطة وعدد خلايا لاحق في الصورة. هذه الصور يمكن معالجتها باستخدام عدد من منصات التصوير الخلية. ولذلك فمن الأهمية بمكان لتحديد البرنامج الأنسب لنوع من الخلايا قيد التحقيق. وسيكون من المفيد للتحقق من صحة التهم خلية من الصور التي حصل عليها تصوير الخلية باستخدام برامج التصوير مختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلىالخلايا المستزرعة ص، إلا أن المعلمات التحليل أن يجب أن تكون محددة لكل خط الخلية. وهذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت في البداية، ولكن بمجرد أن يتم تعيين المعلمات، ويمكن أن يكون آليا طريقة لصورة لوحات كلها في وقت واحد.

من المهم أن نلاحظ أن هذه القياسات ليست في الواقع مقياس غير مباشر من انتشار الأسلحة النووية، كما أنها قياس عدد الخلايا (عدادة الكريات، خلية تصوير)، أو النشاط الأيضي (مقايسة على أساس التلألؤ)، على مدى فترة من الزمن. هذه الأساليب يمكن تعديله بسهولة لقياس العوامل الهامة الأخرى التي يمكن أن تؤثر على انتشار الأسلحة النووية. على سبيل المثال، يمكن بسهولة أن تدمج في التريبان طريقة الأزرق الاستبعاد إما إلى عدادة الكريات أو تصوير خلية طريقة لاستبعاد الخلايا الميتة، وبالتالي تحديد خلية جدوى (13). مقايسة على أساس التلألؤ يمكن المضاعفة مع فحص السمية الخلوية لتوفير معلومات إضافية حول صحة الخلايا، والنشاط الأيضي قياسها خلال هذا الاختبار هو أيضا قياس viabi خليةعنه lity 12. ولذلك، فإن مرونة هذه المقايسات إلى أن المضاعفة مع فحوصات أخرى لتقديم معلومات إضافية الخلوية هي ميزة قوية من كل من هذه الأساليب.

يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا سرطان الثدي البشرية MCF-7 التي تم transduced ستابلي مع ليغو-iG2-بورو + ناقلات تحتوي على الجين GFP. هذا يسمح باستخدام مرشح GFP البصريات لصورة الخلايا، دون الحاجة لإضافة أي وكلاء صبغة في مستنبت. هذه الطريقة يمكن بسهولة تعديل لخلايا GFP سلبية صورة أو خطوط الخلايا حتى الابتدائية، إما عن طريق تصوير الخلايا باستخدام مشرق البصريات حقل نوع، أو عن طريق وصفها الخلايا مع علامة الانتشار. الطرق مقارنة في هذا البروتوكول هي قوية بما يكفي لاستخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من خطوط مختلفة من الخلايا، ولكن إعدادات بروتوكول الأمثل لكل خط الخلية الفردية ينبغي أن تحدد أولا. التصوير من الخلايا باستخدام قناة الحقل مشرق يمثل الخيار الأفضل لم الابتدائيLLS أو تلك التي هي بطيئة النمو، ويرجع ذلك إلى طبيعة طويلة الأجل لهذا الأسلوب. المقايسات نقطة النهاية، مثل الفحص القائمة على التألق، وغير ملائم لتحليل نمو الخلايا على المدى الطويل.

وقد وصفت هذا البروتوكول ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا في المختبر. كل طريقة يمكن أن يؤديها بشكل روتيني في المختبر لقياس نمو الخلايا، وسيكون معظم المختبرات يمتلكون المهارات اللازمة لأداء واحد من هذه الأساليب. ومع ذلك، هناك أيضا مجموعة من فحوصات أخرى متاحة لقياس تقسيم الخلايا. ويمكن أن تشمل هذه الأساليب التي تقيس توليف الحمض النووي، والنشاط الأيضي، المستضدات المرتبطة الانتشار أو تركيز ATP 9. على سبيل المثال، تم وضع عدد من فحوصات لقياس معدل توليف الحمض النووي للخلايا التي وصفها الخلايا مع مادة مشعة مثل 3H-الثيميدين. ومن عيوب هذه الطريقة هي استخدام واضح من المواد المشعة، والتخلص منها. آخرالطرق التي تستخدم بشكل روتيني لقياس انتشار الخلايا تشمل استخدام العلامات BrdU من الحمض النووي التي شكلت حديثا، والتي يمكن قياسها باستخدام التدفق الخلوي 18. التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتحليل كل عدد الخلايا وكذلك معلومات دورة الخلية. قد يكون هذا نتيجة مفيدة لتجارب معينة، ولكن عيوب هذه الطريقة فإن وقتا إضافيا والخطوات، الكواشف مكلفة وزيادة مهارات المدربين المستخدم من أجل تشغيل قياس التدفق الخلوي وتحليل البيانات الناتجة 18. لذلك، هناك العديد من فحوصات مختلفة للعلماء لتقييم نمو الخلايا، وطريقة اختيار يعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا المستخدمة، والمستخدم ومستوى مهاراتهم، ونوع البيانات المطلوبة عند نقطة نهاية التجربة.

في الختام، تمت مقارنة ثلاث طرق مختلفة لقياس انتشار الخلايا باستخدام خلايا سرطان الثدي. كل أسلوب له العديد من المزايا ومساوئهوفاق، وبالتالي وبناء على احتياجاتها من كل تجربة التي تعتمد على المستخدم، من حيث تحديد فحص الأنسب لأداء عد الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358, (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (1), a001008 (2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12, (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19, (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14, (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35, (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11, (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2, (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
  12. CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
  14. Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
  15. Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14, (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics