O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
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Immunology and Infection

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Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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Abstract

A etiologia e os impactos da exposição humana aos patógenos ambientais são uma grande preocupação no mundo inteiro e, assim, a capacidade de avaliar a exposição e infecções usando rentáveis, abordagens de alto rendimento seria indispensável. Este manuscrito descreve o desenvolvimento e análise de um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo capaz de medir a presença de anticorpos na saliva humana a vários patógenos simultaneamente. Saliva é particularmente atraente nesta aplicação porque é não-invasivo, mais barato e mais fácil de recolher além do soro. Os antigénios de agentes patogénicos ambientais foram acoplados a microesferas carboxiladas (grânulos) e utilizado para medir os anticorpos em volumes muito pequenos de amostras de saliva humana utilizando um ensaio solução-fase à base de grânulo. As esferas foram acoplados com antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovírus (G I.1 e G II.4) e vírus da hepatite A. Para assegurar que os antigénios foram suficientemente acoplado aas contas, o acoplamento foi confirmada usando, anticorpos de captura primária de origem animal espécie-específicos, seguido de incubação com biotinilados anti-espécies anticorpos de detecção secundárias e repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como um controlo para medir a ligação não específica, um conjunto de esferas foi tratada de forma idêntica aos outros, excepto que não foi acoplado a qualquer antigénio. As esferas juntamente com antigénio e de controlo foram então incubados com amostras de saliva humana prospectivamente-recolhidos, medido num analisador de alto rendimento com base nos princípios de citometria de fluxo, e a presença de anticorpos para cada antigénio foi medida em unidades de intensidade média de fluorescência (IMF) . Este imunoensaio multiplex tem um número de vantagens, incluindo mais dados com menos de amostra; redução de custos e de trabalho; e a capacidade de personalizar o ensaio para muitos alvos de interesse. Os resultados indicam que o imunoensaio multiplex salivar pode ser capaz de identificar as exposições e infecções anteriores, que pode ser especially útil em estudos de vigilância envolvendo grandes populações humanas.

Introduction

Oitenta e oito por cento das doenças relacionadas com a diarreia em todo o mundo está associada à exposição humana à água contaminada, alimentos não seguros, e falta de saneamento / higiene, causando cerca de 1,5 milhões de mortes, a maioria dos quais são crianças 1. Esta é uma das principais causas de preocupação para os funcionários de saúde pública e os decisores políticos. Em um esforço para investigar exposições e doenças associadas à base de água e de outros patógenos ambientais, foi desenvolvido um imunoensaio multiplex para medir anticorpos em amostras humanas 2-4. Este método pode ser aplicado a estudos epidemiológicos para determinar a exposição humana para estes agentes patogénicos e para melhor definir e infecções immunoprevalence incidentes.

Saliva é uma promessa considerável como uma alternativa ao soro para pesquisa com biomarcadores humano. Entre as vantagens da utilização de saliva são os não-invasivo e facilidade de recolha de amostras, de baixo custo, e as amostras podem ser facilmente obtidas de crianças 5-7 </ Sup>. As amostras de soro e saliva foram estudados extensivamente para anticorpos contra H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, vírus da hepatite A e C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, vírus da dengue 16, o vírus da imunodeficiência humana (VIH) 17, e Escherichia coli O157: H7 18.

Um imunoensaio em multiplex permite a análise de múltiplos analitos em simultâneo dentro de um único volume de amostra e dentro de um único ciclo ou correr. Antígenos multiplexados de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, vírus da hepatite A, e duas noroviruses foram usadas para medir humano IgG salivar 4/2 e IgA IgG no plasma 3,4 e 2,3 respostas de anticorpos para estes agentes patogénicos usando um-Grânulo baseado imunoensaio multiplexação. Quando usado em conjunto com estudos epidemiológicos de exposição a micróbios em água, solo e dos alimentos, do tipo de ensaio descrito neste estudo pode fornecer informação valiosa para melhorar a compreensão de infecções causadas por agentes patogénicos ambientais. Além disso, os dados obtidos a partir de anticorpos salivares tais estudos pode ser usada para melhorar os modelos de avaliação do risco 19-22.

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Protocol

A aprovação foi obtida a partir do Institutional Review Board (IRB # 08-1844, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) para a recolha de amostras de saliva crevicular estimulados de banhistas em Boquerón Beach, Puerto Rico, como parte dos Estados Unidos Environmental Protection Agency (EPA) epidemiológica Nacional e Avaliação ambiental de recreio (neear) Estudo de água 23 para avaliar as exposições e doenças de natação associado. Os sujeitos do estudo forneceu consentimento informado e foram instruídos sobre o uso do dispositivo de recolha de saliva por empreiteiros USEPA treinados. As amostras de saliva foram enviadas em gelo e, após a recepção, eles foram centrifugadas e armazenadas a -80 ° C como descrito 4.

1. A activação do grânulo

  1. Conjunto de esferas stocks Ressuspender por vórtex e ultrassons durante 20 segundos e transferência de aproximadamente 5,0 x 10 6 dos grânulos Stock (400 ul) a tubos de microcentrífuga.
    Nota: Tele grânulos são fornecidos a uma concentração de 12,5 x 10 6 contas / ml.
  2. Sedimentar as pérolas de banco por centrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas peletizadas em 100 ul de água destilada (dH2O) por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. Repita o passo 1.2.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender as esferas lavadas em 80 ul de 100 mM de fosfato de sódio monobásico, pH 6,2 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
  5. Imediatamente antes da utilização, fazer uma solução 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) por adição de 200 uL de dH2O de 10 mg, Sulfo-NHS alíquota. Misture por vórtice.
  6. Adicionar 10 ul de 50 mg / ml de sulfo-NHS para os grânulos. Misture por vórtice.
  7. Imediatamente antes da utilização, fazer uma de 50 mg / mL de 1-etil- [3dimethylaminopropyl] carbodiimida solução (EDC) de cloridrato por adição de 200 ul de água destilada (dH2O) para os 10 mg de EDC alíquota. Misture por vórtice.
  8. Adicionar 10 ul de 50mg / ml solução EDC para os grânulos. Misture por vórtice. Incubar as contas durante 20 min à temperatura ambiente, no escuro, com agitação por vortex em intervalos de 10 min. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  9. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 250 ul de ácido 2- 50 mM de [N-morfolino] etanossulfónico (MES), pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
  10. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  11. Repita os passos 1.9 e 1.10.
    Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com 50 mM de MES, pH 5,0.
  12. Ressuspender as pérolas em 100 ul de 50 mM de MES, pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.

2. Bead Coupling

  1. Par os antigénios para os conjuntos de esferas usando as concentrações apresentadas na Tabela 1.
  2. Adicionar cada antigénio para as esferas activadas e levar o volume total a 500 mL em MES 50 mM, pH 5,0. Misturar os antigénios umd grânulos por vortex.
  3. Incubar os antigénios e os grânulos durante 2 horas, com mistura por rotação (~ 15 rpm) à temperatura ambiente no escuro. Agregar as esferas acopladas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 500 ul de salina tamponada com fosfato (PBS), albumina de soro -bovine (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sódio a azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vórtice e sonicação. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min e remove-se o sobrenadante.
    Cuidado: A azida de sódio é um produto químico altamente tóxico. É fatal se ingerido ou entra em contato com a pele. Não respirar as poeiras / fumos / gases / névoas / vapores ou spray. Use equipamento de proteção pessoal adequado (do PPE) ao manusear e descartar de acordo com as leis apropriadas.
  5. Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS-TBN por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
  6. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  7. Repita os passos 2.5 e 2.6.
    Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com PBS-TBN.
  8. Ressuspender as esferas acopladas e lavadas em 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Armazenar as esferas acopladas num refrigerador entre 2-8 ° C no escuro.

3. Contagem Bead

  1. Prepara-se uma diluição das pérolas acopladas em água ou tampão PBS 1:10.
  2. Carga de 10 ul da diluição o grânulo em um hemocitómetro no ponto de introdução da amostra.
  3. Contar as esferas visto em um dos 4 x 4 grelhas de canto. Calcular o número total de pérolas acoplado usando a seguinte fórmula: Contagem (uma esquina da grade 4 x 4) x (1 x 10 4) x (factor de diluição) x volume de ressuspensão em ml.

4. Confirmação do Antigen Coupling

  1. Ressuspender a mistura estoque de esferas acopladas a antígenos de interesse pelo vórtice e sonicação por 20 s.
  2. Prepare uma mistura de pérolas para trabalhar diluindo os estoques talão acoplados a uma finalconcentração de 100 esferas / mL de cada grânulo único situado em tampão PBS-BSA a 1% (PBS-BSA a 1%, pH 7,4).
  3. Preparar pelo menos duas 7 diluições em série de anti-IgG de espécies de anticorpo primário de acordo com as recomendações do fabricante em placa de 96 poços de fundo redondo com tampão PBS-BSA a 1%.
  4. Pré-molhou uma coluna de oito poços separada (8 linhas) de uma placa de fundo de filtro de 96 poços para cada teste de confirmação de ligação de antigénio com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Adicionar 50 ul de mistura de pérolas para trabalhar (grânulos acoplado-antigénio) aos poços pré-molhado.
  5. Adicionar 50 ul de diluições de anticorpos de linhas 1-7 de cada coluna da placa de filtro de 96 poços e 50 ul de tampão BSA a 1%, PBS a linha 8 no lugar de anticorpo diluído para servir como poços de fundo. Misture com uma pipeta multi-canal pipetando cima e para baixo 5 vezes. Execute o mesmo procedimento para cada conjunto de esferas acopladas-antigénio a ser confirmada.
  6. Tampa e deixa-se incubar no escuro à tempratura durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração.
  7. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repetir 1x. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  8. Diluir biotinilados anti-espécies anticorpo de detecção secundário IgG específica para 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  9. Adicionar 50 uL de anticorpo secundário diluído a cada poço, pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
  10. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  11. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  12. Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  13. Adicionar 50 ul de repórter para cada poço e misture pipetando cima e para baixo 5 vezes.
  14. Csobre a placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  15. Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador 29.
    Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex com base em grânulo são medidas de intensidade de fluorescência média (IFM). Sempre consulte a versão mais recente do manual do software, se disponível para evitar erros.

5. salivar Multiplex Immunoassay

  1. Remover saliva da -80 ° C congelador e deixa-se descongelar à temperatura ambiente.
  2. antígeno Ressuspenda acoplado stocks talão por vórtice e sonicação por 20 s.
  3. Prepara-se uma mistura de pérolas de trabalho por diluição das existências grânulo acoplados a uma concentração final de 100 esferas / mL de cada conjunto de esferas original em PBS-1% de BSA tampão.
  4. Prepara-se uma diluição de 1: 4 de saliva Wom PBS-1 de tampão BSA% em um 96 bem, placa poço profundo.
  5. placa de filtro pré-molhado com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração.
  6. Adicionar 50 ul de uma mistura de pérolas de trabalho e um volume igual de saliva diluída a 95 poços das placas de filtro de 96 poços para uma diluição de 1: 8 definitiva. Misture reacções com uma pipeta multi-canal. Para o controlo de uma cavidade, adicionar 50 grânulos acoplado-antigénio ul, mais 50 ul de PBS-1% BSA (tampão como um substituto para a saliva).
  7. Tampa e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  8. grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  9. Dilui-se o anticorpo de detecção secundário anti-IgG humano de cabra biotinilado a 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  10. Adicionar 50 ul de anticorpo secundário diluído a cada poço e misturar o conteúdo comuma pipeta multi-canal.
  11. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  12. grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  13. Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  14. Adicionar 50 ul repórter a cada poço e misture com uma pipeta multi-canal.
  15. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  16. Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador 29.
    Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex são medidos em unidades Mediana intensidade de fluorescência (MFI). Consulte sempre oa versão mais recente do manual de software, se disponível para evitar erros.

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Representative Results

Um conjunto de esferas original foi utilizado como um controlo para medir a ligação não específica e amostra para amostra variabilidade. Estas esferas foram tratadas de forma idêntica ao antigénio esferas acopladas com a excepção de que não foram incubadas com qualquer antigénio no passo de acoplamento. IFM valores> 500 obtidos a partir das esferas de controlo incubadas com todas as amostras de saliva foram retirados da análise ainda mais devido à suspeita de contaminação do soro e as respostas restantes foram distribuídos log. A saliva pode ser contaminado com soro se as gomas são esfregadas com muita força com a esponja ligado ao dispositivo de recolha ou de se o participante do estudo tem doença periodontal. O registo de dados transformados IFM foram usadas para calcular um ponto de corte imuno de 505 MFI baseada na média mais 3 desvios-padrão dos valores de MFI de log. Além disso, os grânulos acoplado de antigénio foram adicionadas a poços específicos que foram tratados como poços de teste em cada forma, excepto dilbuído saliva foi substituída com PBS-BSA a 1% para avaliar a fluorescência de fundo e reactividade cruzada. Os valores de MFI obtidos nestes poços de fundo foram subtraídos dos valores de MFI de cada conjunto de esferas acopladas-antigénio para cada amostra de saliva.

acoplamento do grânulo foi confirmada utilizando derivados de animais específicas para cada espécie de detecção de anticorpos primários específicos para cada antigénio. Para assegurar que o antigénio acoplado grânulos eram capazes de se aproximar da gama dinâmica do ensaio, que definido de acoplamento adequada como um MFI ≥18,000, a observação da resposta à dose e a reactividade cruzada entre os anticorpos primários e não-alvos de <10% tal como descrito dois . Confirmações de acoplamento representativos para C. jejuni e T. gondii dos antigénios do ensaio são mostrados na Figura 1.

Com base no ponto de corte estabelecido (505 IFM), a taxa de immunoprevalences para as amostras (n = 2078) variou de cerca de 2% (n = 41) para T. gondii para cerca de 50% (n = 1009) para GI.1 norovírus (Figura 2). Os dados indicam que a taxa de immunoprevalence foi mais elevada para os noroviruses seguido por vírus da hepatite A e H. pylori.

Enquanto 32% (n = 672) das amostras foram immunonegative para todos os agentes patogénicos no ensaio, 68% (n = 1406) foram imunopositivas para um ou mais agentes patogénicos. A Figura 3 mostra a discriminação do imunopositividade para um ou mais dos patógenos.

figura 1
Analisa Acoplamento de confirmação para dois dos organismos no imunoensaio multiplex confirmação O acoplamento foi realizado para todos os antigénios e os gráficos de C.: A Figura 1. jejuni e T. gondii nesta figura são represensentante das confirmações de acoplamento para os antígenos no imunoensaio multiplex. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Immunoprevalence de agentes patogénicos específicos Immunoprevalence de agentes patogénicos específicos no imunoensaio multiplex variou desde cerca de 2% para T. gondii para quase 50% para GI.1 norovirus. Os anticorpos contra os antígenos de norovírus foram mais comumente observado seguido por HAV (vírus da hepatite A) e H. pylori. T. gondii e C. anticorpos jejuni apareceu com menor frequência nas amostras de saliva analisadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

Figura 3
Figura 3:. Composição de imunopositividade para vários agentes patogénicos simultaneamente O imunoensaio multiplex permite a análise de múltiplos agentes patogénicos imunopositividade para simultaneamente em um volume de amostra de 50 ul. Quase um terço das amostras de saliva analisadas foi immunonegative para anticorpos contra todos os antígenos no multiplex. Cerca de 31% das amostras foi imuno por um antígeno enquanto um quarto foi positivo para dois antígenos. 9,4% foi imunopositivas para três antigénios. 3% foi positivo para quatro ou mais antigénios simultaneamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

antígeno Bead Set tampão de acoplamento Ag Concentração (ug) # De contas em um canto # De grânulos / ul Vol. para 100 B / UL para 4 ml (mL)
C. jejuni 8 MES 5.0 50 64 6.400 94
H. pylori 33 MES 5.0 25 71 7.100 85
Hepatite A 42 MES 5.0 100 91 9.100 66
T. gondii 30 MES 5.0 25 85 8.500 71
norovirus GII.4 55 MES 5.0 5 72 7.200 83
norovirus GI.1 67 MES 5.0 5 63 6.300 95
desacoplado 80 MES 5.0 60 6.000 100
O volume total dos grânulos (ul) 594
O volume total de tampão necessário (l) 3406

Tabela 1:. Trabalhando mistura de esferas para o imunoensaio multiplex Após confirmação do acoplamento e foram concluídas, uma mistura principal que consiste em cada conjunto de esferas foi preparado como mostrado. A mistura principal foi distribuído entre umaLL dos poços da placa de 96 poços. Todos os poços foram incubados com saliva com a excepção de um poço fundo controlo que continha apenas grânulos e PBS-1% de BSA tampão.

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Discussion

Estes resultados indicam que o método de imunoensaio em multiplex é útil para discriminar entre amostras de saliva que são imunopositivos ou immunonegative. Para determinar imunopositividade, um único ponto de corte foi desenvolvido através do cálculo da média mais três desvios-padrão do log transformado respostas IFM dos cordões desacoplados de controle testados com todas as amostras de saliva. O ponto de corte proporcionou a capacidade de avaliar a exposição e immunoprevalence a qualquer um único ou vários patógenos. Este poder discriminatório pode ser útil em estudos populacionais para investigar os riscos de saúde associados com a exposição a patógenos ambientais e outros.

Existem vários outros métodos que podem ser usados ​​para determinar um ponto de corte de acordo com a distribuição da IFM, controles desacoplados eo que causa o estudo foi concebido para responder. Alguns exemplos para determinar pontos de corte incluem modelagem mista finita 24-26, média mais 3desvios-padrão de respostas aos controles, média mais 2 desvios-padrão de respostas aos controles, e três vezes a média de respostas aos controles 27,28. Para rastreios simples, critérios menos rigorosas podem ser utilizadas, mas para estudos epidemiológicos, pode ser mais apropriado utilizar uma definição mais rigorosa para reduzir a probabilidade de falsos positivos de relatórios. Nosso pedido inicial é olhar para immunoconversion e immunoprevalence entre nadadores e não nadadores. Neste estudo, os SNM de controlo não foram desacoplados normalmente distribuídos e os resultados foram transformados de log.

Vantagens para realizar um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo incluem a utilização de volumes muito baixos de amostra, a redução no tempo e de trabalho e a capacidade de medir as respostas de até 500 analitos simultaneamente, enquanto que requer uma quantidade mínima de reagentes. Pelo contrário, os métodos tradicionais de avaliação dos níveis de anticorpos indicativos de exposição e / ou infecção (por exemplo, ELISA exigem pelo menos 100 ul de amostra enquanto um imunoensaio multiplex podem exigir 50 ul ou menos.

Limitações de um imunoensaio multiplex incluem a necessidade de otimização rigorosa para determinar as concentrações ideais de captação primária e anticorpos de detecção secundárias, antígenos e repórter. Reatividade cruzada é também uma grande preocupação em imunoensaios como anticorpos contra um antigénio específico pode reagir de forma cruzada com antígenos de outros organismos e, assim, levar a leituras falso-positivos. Optimization, reatividade cruzada e ligação não específica foram abordados anteriormente 2-4. O sucesso de um tal ensaio é largamente dependente da capacidade de obter antigénios altamente imunogénicas, bem como Antibo específicamorre a estes antigénios para utilização nos passos de acoplamento e talão de confirmação de acoplamento. Outra limitação é a disponibilidade limitada de amostras caracterizadas (diagnóstico positivo e negativo) para validar os ensaios.

Há um número de etapas críticas no âmbito do protocolo. Estes incluem: assegurar que os antigénios será acoplado às esferas não contêm proteínas estranhas, azida, glicina, tris ou quaisquer aminas primárias. Se qualquer um desses agentes de existir na preparação de antigénio, que deve ser removido por diálise ou cromatografia. Recomenda-se que se deve começar com 5 ug de antigénio por 5 milhões de contas de e titular de encontrar a melhor concentração. Escolha a concentração do anticorpo de detecção ideal que dá a melhor sensibilidade e gama dinâmica. Tenha em mente que os sinais tendem a diminuir com o aumento das concentrações de anticorpos antígeno e detecção (efeito gancho). Por exemplo, se o sinal diminui à medida que aumenta antigénio concentração, em seguida, detectaranticorpo de iões pode ser limitativos. Por outro lado, se os sinais de diminuir à medida que aumenta a detecção de anticorpos em seguida repórter (SAPE) pode ser limitante. Verificar o multiplex para a reactividade cruzada, combinando o acoplamento óptimo para cada proteína (5,000 de cada conjunto de microesferas por poço). Testar os conjuntos de talão multiplexados por combinação com a quantidade de anticorpo de detecção óptima. Optimizar o repórter e fazer uma curva-padrão de antigénio a testar por cada antigénio individualmente.

Solucionando um imunoensaio multiplex para melhorar a sensibilidade e aumentar sinal fluorescente médio são extremamente importantes. Melhorar a sensibilidade, quer diminuir a quantidade de antigénio acoplado às esferas ou a concentração do anticorpo de detecção. A utilização de uma maior afinidade de anticorpos para captura e / ou detecção também pode melhorar a sensibilidade. Aumentando a quantidade de antigénio acoplado às esferas pode aumentar o sinal fluorescente mediana. Um estudo demonstrou que a pré-incubação de amostras de soro com polyvinylalcohol mais polivinilpirrolidona tampão (PVX) é capaz de suprimir a ligação não específica em ensaios serológicos, utilizando o ensaio multiplex baseadas em esferas 30 tal como a que estamos a descrever aqui. No entanto, outro estudo realizado por nossos colaboradores encontraram nenhum efeito significativo entre buffers PBS-BSA e PVX. Eles concluíram adicionalmente que, devido à maior viscosidade do tampão PVX, criou-se problemas com a aquisição do grânulo no analisador e a espuma formada nas microcavidades 3.

Em conclusão, nós apresentamos um método que é capaz de medir a presença de anticorpos IgG salivares humanas para vários agentes patogénicos simultaneamente em um volume de amostra muito pequena. No futuro, este ensaio será usado para detectar a presença de anticorpos salivares associados a exposições ou infecções relacionadas com a natação e para ajudar a informar modelos de avaliação de risco. Além disso, o ensaio pode ser usado para medir anticorpos associados com exposur ar e de origem alimentares, determinar infecções incidentes ou immunoconversions e fornecer informações imunológica crítica aos epidemiologistas que realizam estudos populacionais do tipo questionário.

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Disclosures

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos através do seu Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento financiada e gerida a pesquisa descrita aqui. Ele foi submetido a revisão administrativa da Agência e aprovado para publicação. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação para o uso.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

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References

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