Artbestämning och kvantifiering i blandningar Använda MRM masspektrometri av peptider som kött autentisering

Biochemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby, N. M., Philo, M., Peazer, J. K., Kemsley, E. K. Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication. J. Vis. Exp. (115), e54420, doi:10.3791/54420 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. proteolys och analys av referens Myoglobins

  1. Proteolys av referens myoglobins
    1. Bereda lösningar av de renade referens myoglobins (intervall 0,2-0,5 mg / ml i 25 mM ammoniumbikarbonat) 3.
    2. Överföring 1 ml alikvoter av varje prov till 2 ml centrifugrör.
    3. Termiskt denaturera de extraherade proteinerna genom upphettning av provet i ett varmt block vid 95 ° C under 30 min. Får provet svalna under ca 15 min tills den når rumstemperatur. Tillsätt 30 mg urea (slutkoncentration 0,5 M) för att förbättra matsmältningen, sedan blanda.
  2. tryptisk proteolys
    1. Bered en 1 mg / ml lösning av trypsin i 25 mM ammoniumbikarbonat och lagra på is efter behov. Lägg till en tillräcklig volym av trypsin så att den slutliga enzymaktiviteten är 420 BAEE (N -bensoyl-L-arginin-hydroklorid) enheter / mg av extraherat protein, blanda försiktigt genom att vortexa och låt proteolyze natten vid 37 ° C.
    2. Utföra natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) 17 för att visa att fullständigheten av proteolys.
  3. Avsaltning av den post-proteolys prov
    1. Späda provet 1: 2 volym: volym med vatten.
    2. Aktivera en polymer med omvänd fas-patron (RP) fylld med 30 mg RP-material genom att tillsätta 1 ml metanol, sedan ekvilibrera patronen genom att tillsätta 1 ml 1% myrsyra.
    3. Ladda provet på patronen under självtryck.
    4. Tvätta med 1 ml 5% metanol / 1% myrsyra under gravitation.
    5. Eluera peptiderna med 1 ml acetonitril / vatten (90:10 v: v; 0,1% myrsyra) under tyngdkraften in i 2 ml mikrocentrifugrör förfylld med 5 | il dimetylsulfoxid (DMSO).
    6. Avlägsna lösningsmedlet under vakuum vid 50 ° C med användning av en centrifugal förångare för 120 minuter, därefter lös upp återstoden i 250 | il acetonitril / vatten (3:97 v: v; 0,1% myrsyra).
    7. Överföringlösningen till en liten volym automatisk provtagare flaskan.
      Notera: Prov kan förvaras vid 4 ° C tills redo för vätskekromatografi masspektrometri (LC / MS) -analys.
  4. Generation övergångslistor för MRM
    1. Leta upp myoglobin sekvenserna för de olika kött från UniProt databasen.
    2. Ange myoglobin sekvenserna i "Target" rutan av peptiden och övergångs förutsägelse programvara (t.ex. Skyline). Om det behövs, muspekaren över en peptid för att avslöja dess fragment listan.
    3. Klicka på "Inställningar" och välj "peptid Inställningar. Mata in preferenser för matsmältningen (dvs trypsin) och antalet missade klyvningar (0). Ange önskat urval för ytterligare parametrar, i synnerhet peptidlängd (6-25), N-terminal undantag (0) och antas aminosyramodifieringar (ingen).
    4. Klicka på "Inställningar" och välj "Övergångs inställningar". Välj inställningarna förtyp instrument som används för LC / MS analys.
    5. Klicka på "Export" och välj "Transition List" för att skapa ett kalkylark med de genererade MRM övergångar och parametrar.
  5. Analys med LC / MS
    1. Inrätta ett system för binär gradient (vatten (A) och acetonitril (B), var och en med 0,1% myrsyra v: v) högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med automatisk provtagare, C18 kärna skal HPLC-kolonn (10 cm x 2,1 mm , 2,6 | j, m partikelstorlek) som är ansluten till en trippel kvadrupol masspektrometer drivs i positiv elektrospray-läge med MRM detektering.
    2. I datainsamlingsprogram (t.ex. Analyst), välj "File" och "New" och klicka på "Förvärv Method" i pop-up rutan och klicka sedan på "OK".
      Obs: Detta öppnar instrument Method Editor, som innehåller en lista över de anslutna enheter som gör det möjligt att installationen av en ny LC / MS-metod.
    3. Klicka på "Binary Pump" och jagmatas n flödesvärdet (300 | j, l / min) och gradienten gånger i tabellen, sätta en binär gradient profilen för 3% B till 30% B över 22 min, ökande till 100% B vid 23 min för en 5 min tvätta ur innan han återvände till begynnelsevillkor och återjämvikt för en ytterligare 6 min.
    4. Klicka på "Autosampler" och sätt i injektionsvolym (5 l). Aktivera "Needle Wash Cycle" och ange "Wash Time" (30 sek) och välj "Flush Port".
    5. Klicka på "termostat Kolumn Controller" och "kolonnugn Properties ställa in" Vänster temperatur "och" rätt temperatur (40 ° C).
    6. Klicka på "masspektrometer" och klicka sedan på "Redigera parametrar" för att ange gas förhållanden källa. Välj "Scan Type" som "MRM (MRM)" och "polaritet" som "positiv". Gå till "Period Sammanfattning" och ange "Duration Time", den totala tiden för LC-analys end ekvilibrering (35 min).
    7. I tabellen högerklicka och välj "Declustering Potential (DP)" och "kollisionsenergi (CP) för att lägga till dessa kolumner i tabellen. Ange Q1, Q3, Tid (ms), ID, DP och CE-värden för alla övergångar för en enda kött art, som skapats i listan övergången (se steg 1.4.5).
      Obs: Tid (ms) avser uppehållstiden, den tid masspektrometern bringar skanna varje övergång, summeringen av vilka bör inte överstiga 3 sek.
    8. Spara förvärvsmetoden fil (filändelse .dam).
      Obs: Steg 1.5.2 - 1.5.8 behöva upprepas för varje köttarter. Detta kommer att skapa en enda metod fil för varje köttarter i skärm i förberedelse för analys nedan.
    9. I datainsamlings mjukvaran, klicka på "Skaffa" och välj "jämvikt". I rutan som öppnas, välj önskad förvärvsmetoden börjar instrumentet jämvikt.
    10. Sätt provflaskor i arack i den automatiska provtagaren.
    11. Klicka på "Arkiv" och välj "Nytt" och sedan "Förvärv Batch". I "Sample fliken välj" Lägg Set "och sedan" Lägg till Samples ". Sätt antalet prover som ska analyseras och klicka på "OK". I "Förvärv rutan välja metod fil som ska användas för analys från rullgardinsmenyn.
    12. I tabellen, välj "Plate kod" och välj konfiguration lämpligt magasin från rullgardinsmenyn. Vänsterklicka på "Plate koden kolumnrubriken sedan högerklicka och välj" Fyll Down ". I "Vial Position" anger positionen för varje prov i den automatiska provtagaren i raderna.
    13. I "datafil" anger filnamnet för förvärvet sedan vänsterklicka på kolumnrubriken följt genom att högerklicka och välj "Fyll Down". I "Sample Name" sätter identiteten av varje prov som skall analyseras. Spara som ett förvärv kommandofil (fil eXTension .dab).
    14. Klicka på fliken "Skicka" markera sedan proverna som måste analyseras på LC / MS. Klicka på "Skicka". Klicka på "Skaffa" och "Starta prov" för att börja analysen.
      Obs: Varje förvärvsmetoden kommer att söka efter de MRM åkningar över hela längden av kromatografen för en enda kött art. Masspektrometer inställningar för en MRM förvärv varierar beroende på typ av instrument och peptid.
    15. Se de genererade datafiler med hjälp av datavisning programvara. Klicka på XIC (extraherade joner) och i rullgardinsmenyn markera alla fragment (Q3 värden) för en enda föregångare (Q1). En ny ruta öppnas som visar endast de markerade övergångar.
    16. Spela retentionstiden (Rt) för grupper av samtidiga övergångar eftersom dessa motsvarar en enda peptid.
    17. Upprepa de två föregående stegen för varje uppsättning av övergångar för att tilldela topparna till sina respektive peptider för varjeav köttarter.
    18. Registrera markör peptider som är lämpliga för att ge artbestämning (t.ex. peptid HPGDFGADAQGAMTK, föregångare m / z = 752, Rt = 12,0 min, för häst), tillsammans med deras retentionstider, och anteckna vilka bildar motsvarande par som lämpar sig för relativ kvantifiering .
      Obs: Till exempel, hästen markörpeptid (prekursor m / z = 752) har en motsvarande nötkött peptid, HPSDFGADAQAAMSK (prekursor m / z = 767, Rt = 13,2 min).
    19. För att skapa en enda dynamisk metod som omfattar alla köttarter, i datavisningsprogram, för varje kött arter i sin tur öppna uppgifter XIC övergångs för varje föregångare (tilldelas en särskild peptid i 1.5.8).
    20. Zooma in på topp kluster på den valda uppehållstiden genom att vänsterklicka och dra markören under klustret. Identifiera de mest intensiva övergångarna (genom att högerklicka på toppetiketten).
    21. registrera övergångarna manuelltoch retentionstider i ett kalkylblad.
    22. Att ange parametrar som en ny dynamisk metod på LC / MS mjukvaran, klicka på "masspektrometer" och klicka sedan på "Redigera parametrar" för att ange gas förhållanden källa. Välj "Scan Type" som "MRM (MRM)" och "polaritet" som "positiv".
    23. Gå till "Period Sammanfattning" och ange varaktighet (satt som den totala tiden för LC-analys och jämvikt). I tabellen högerklicka och välj "Declustering Potential (DP)" och "kollisionsenergi (CP) för att lägga till dessa kolumner i tabellen.
      Obs: "Time" kolumnen hänvisar nu till den förväntade retentionstiden (min) för varje övergång.
    24. I "Redigera parametrar" delen av LC / MS datainsamling programvara, kontrollera "Schemalagda MRM rutan. Ingång Q1, Q3, Tid (min), ID, DP och CE-värden för övergångarna som skapats i tabellen (1.5.21) och spara förvärvsmetoden (file förlängning .dam).
      Obs: Den här metoden minskar typiskt antal MRM övergångar till fyra mest intensiva för varje peptid och skannar bara över retentionstiden fönster för varje peptid topp, vilket ger förbättrad känslighet och kvaliteten på uppgifterna. En "dynamisk" metod är en "guidad uppehållstid fönster metoden, som ibland kallas schemaläggning.

2. Upprättande och analys av kalibreringsprov

  1. Utvinning av köttblandningar
    1. Med användning av kött tidigare frysta maldes därefter till ett pulver, framtagandet av en rad köttblandningar genom vägning respektive mängderna av kött (total massa av omkring 300 mg) i 15 ml plast centrifugrör.
    2. Tillsätt 4 ml av extraktionsbuffert (0,15 M kaliumklorid + 0,15 M fosfatbuffert vid pH 6,5). Vortex under 30 sek. Extrahera på ett labb skakanordning vid rumstemperatur under 2 h vid 250 cykler / min.
      Notera: Cykler / min hänför sig till en oscillerande rörelse.
    3. Överför 2 ml avextrahera i ett 2 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera i 5 minuter vid 4 ° C vid 17000 x g.
    4. Överföring 200 mikroliter alikvoter av supernatanten (reservera en liten summa för proteinanalys, se 2,2) i 2 ml centrifugrör och torrt med en centrifugal förångare (förinställt program: 50 ° C, utan ventilation och 120 min varaktighet).
  2. proteinanalys
    1. Överföring 7 il alikvoter av det monopoliserade supernatanten (se 2.1.4) i tre exemplar till brunnarna i en platta med 96 brunnar.
    2. Överföring 7 il portioner av en serie av proteinstandarder i tre exemplar, intervallet 0-1,0 mg / ml bovinserumalbumin (BSA), till samma 96 brunnar.
    3. Tillsätt 200 pl av Coomassie plus proteinanalysreagens till varje brunn.
    4. jämför visuellt färgen på provbrunnarna med proteinstandarder för att kontrollera proven är i intervallet av kalibreringsstandarder. Om nödvändigt, upprepa med utspätt prov så det blir inom räckhåll.
    5. Låt plattan stoch under 3 min.
    6. Burst eventuella bubblor som har bildats med en injektionsnål.
    7. Analysera plåten på plattavläsare med användning av en standard-slutpunktsprotokoll vid en våglängd av 595 nm.
    8. Bestämma proteinkoncentrationen av proverna med användning av kalibreringsdata från de proteinstandarder.
      Obs: Detta krävs för beräkning av mängden trypsin som används i den tryptiska Digest.
  3. Proteolys av köttblandningar
    1. Återupplös den torkade återstoden från steg 2.1.4 i 1 ml 25 mM ammoniumbikarbonatlösning. Blanda väl på en rotamixer.
    2. Följ protokollet från steg 1.1.3 till 1.3.7.
  4. Analys med LC / MS
    1. Ställ in LC / MS som tidigare (steg 1.5.1).
    2. Skapa ett nytt förvärv parti som beskrivits ovan (steg 1.5.9 - 1.5.14), val av förvärvsmetoden skapade i steg på 1.5.24 som använder en dynamisk LC / MS-metod som kombinerar alla köttarter, och skaffa data för de DigesTED köttprover.
    3. Visa hela kromatogrammet i datavisningsprogram. Visa XIC för varje övergång som i tur och ordning. bekräfta visuellt varje kluster innehåller erforderligt antal klockformade toppar vid den förväntade retentionstiden, vilket bekräftar förekomsten av den valda peptiden.
    4. Utför kvantifiering med hjälp av datavisning programvara för att integrera toppområden för var och en av övergångarna av intresse genom att dubbelklicka på "Build Kvantifiering Method" i navigeringsfältet.
    5. I "Välj Sample" rutan väljer "Data File" och "Prov" som skall analyseras för att generera en "Analyter 'bord.
    6. Klicka på fliken "integration" för att visa den första av de övergångar (analyt) som skall integreras.
    7. Klicka på "analyt" rutan för att visa rullgardinsmenyn övergångar. Markera varje övergång i sin tur för att visa den och bekräfta visuellt rätt toppen ut för integration. till modify eller tvinga integration, vänsterklicka och dra markören över målet topp (detta kommer att markeras i grönt). Klicka på "Välj Peak" -knappen och klicka på "Apply".
    8. Spara arbetsytan som en metod fil (.qmf).
      Obs: Detta skapar en kvantifiering metod fil för efterföljande beräkning av provtoppytor.
    9. Dubbelklicka "Kvantifiering Wizard" i navigeringsfältet. I "Välj Samples" fönster skapa "Kvantifiering Set" genom att välja en enda "datafil", sedan en eller flera "tillgängliga prover". Välj "Nästa" för att visa "Välj Inställningar och Query rutan. Lämna med defaults, klicka på "Nästa" för att visa "Välj metod. Från rullgardins "Metod" rutan väljer "Integration Method" fil som skapats i steg 2.4.8, välj sedan "Finish".
      Obs: Detta skapar en "Resultattabell", inklusive övergångstoppområden till följd av köttblandningar.
    10. <li> Spara "Resultattabell" (filändelse .rdb), export som en textfil (.txt) och öppna den i kalkylblad för att granska uppgifterna.
    11. Plot diagram av den procentuella (genom övergångstopparea) av en kött i en annan jämfört med den uppmätta procentandelen (vikt / vikt) av två kött för den valda MRM för utvalda övergångar från motsvarande peptider, med fokus på de fall där de två fragmenten innehåller samma antal aminosyror som räknas från den C-terminala änden.
      Obs: Identiska fragment med identiska fragmenterings platser ger optimalt resultat.
    12. Undersök tomter från 2.4.11 ovan. Antingen visuellt eller med hjälp av en trendlinje verktyg i plottning paket, identifiera en grupp tomter som är både linjära och liknande lutning. Använd en eller flera av dessa CPCP plus fragmentkombinationer för kalibrering i verkliga köttprover.
      Obs: En kurva som visar en ovanlig gradient kan indikera antingen peptid eller fragment dämpning med en åtföljande minskning av signal strength. Icke-linjära tomter kan tyda på dålig toppdetektering eller andra problem.

3. Kött Prover

  1. Utvinning av proteiner från målet köttprov
    1. I förekommande fall, punkt ovidkommande icke-köttmaterial från provet med hjälp av en spatel. Till exempel, skrapa bort sås och pasta från en kyld lasagne.
    2. Väg upp 20 g av köttet i en metallbägare.
    3. Tillsätt 100 ml 0,15 M kaliumklorid / 0,15 M kaliummonofosfat-buffert vid pH 6,5.
    4. Extrahera proteinerna genom blandning av köttet i en höghastighetshomogenisator under 1 minut.
    5. Följ protokollet från steg 2.1.4 - 2.3.2.
  2. Analys av prover med LC / MS
    1. Upprepa steg 2.4.2 att samla in data med hjälp av dynamisk LC / MS-metod.
    2. Identifiera peptiderna från varje kött myoglobin som utförs i steg 2.4.3.
    3. För kvantifiering använder kvantifiering programvara för att integrera toppområdena för varje övergång av intresse,som beskrivs i steg 2.4.9.
    4. För identifiering av arter i en blandning, registrera dessa markörpeptider uppfyller överenskomna kriterier för antalet övergångar och signal-brus för dessa övergångar.
    5. För kvantifiering använda integrerade övergångstoppområden som överenskommits från steg 2.4.12 och med hjälp procenten övergångstoppområdet, beräkna andelen myoglobin från de två arterna i blandningen.
    6. Använd förkunskaper från litteraturen 18 av troliga nivåer myoglobin i kött för att uppskatta de relativa w / w mängder av två kött som finns i provet.

Representative Results

I en enda dynamisk-mode MRM experiment varje programmerad övergång redovisas separat (som detektor pulser per sekund, cps) över en specificerad uppehållstid fönster. Därför från alla data som samlas in i ett experiment, toppintensiteten för varje övergång kan individuellt utvinnas. Då det enda finita signalen är för retentionstidsfönster inställd för denna övergång. Utsidan av fönstret, är signalen noll per definition. Signalen för varje en övergång, till exempel, 752 → 1269 från häst (peptid monoisotopisk massa 1,501.66 dalton, prekursor jon m / z 751.84 dalton, laddningstillstånd = 2, fragmentjon y 13) har typiskt att konkurrera endast med mätbrus och inte från andra övergångstoppar som kanske kan vara från andra arter. Utgången är därför en uppsättning rena toppar, en per övergång, vid en gemensam uppehållstid för dessa övergångar som delar en gemensam föregångare jon.

Figur 1 visar resultatet för uppsättningen av fyra övergångar 752 → (1269, 706, 248, 1366) för en blandning av 1% vikt / vikt häst i nötkött. Eftersom de fyra övergångar visas är förknippade med häst och är frånvarande i prover av rent nötkött, lamm eller fläsk, dessa toppar betyder närvaron av hästen. Beroende på robusthet kriterier en uppsättning av två eller flera övergångar som väger mer än någon specificerad signal till brusnivån fastställs identifiering. Denna siffra fastställs därför närvaron av hästen i blandning av 1% vikt / vikt häst i nötkött.

Ibland är en enda isolerad övergång detekteras. Detta tyder på en chans matchning av prekursor jon och ett enda fragment, möjligen från ett främmande protein, med de som förväntades från systemet och programmerad i masspektrometern. Singularis naturen av toppen, och dess förekomst på ett oväntat retentionstid, är signature av en oavsiktlig övergång som kan ignoreras.

Arean under varje omvandlingstopp kan beräknas individuellt. Baserat på ett lämpligt fragment, förhållandet av hästen till nötkött övergångstoppområden, till exempel, 752 → 1269 (häst) till 767 → 1299 (nötkött), kommer att vara proportionell mot förhållandet mellan faktiska kött i blandningen. Figur 2 visar en plot av procent genom topparean för dessa två övergångar kontra den procentuella vikten för vikten av häst i en blandning av häst med nötkött. Om den procentuella övergångstopp områden motsvarar den procentuella vikten för vikten av kött då lutningen är 1. Lutningen på denna kurva är 1,03, vilket tyder på att, för dessa övergångar och CPCP par övergångstoppytor ger ett tillförlitligt mått på de relativa mängderna av de två kött i blandningen. Om hästkött i provet var dubbelt så rik i myoglobin som nötkött sedan, med andra faktorer oförändrade, lutning linje skulle vara större än ett.

Figur 1
Figur 1. MRM övergångsintensitet kontra uppehållstid för 1% w / w häst i nötkött. Övergångarna är 752 → (1269, 706, 248, 1366), som visas i orange, svart, blått och grönt, respektive. Markören peptiden är HPGDFGADAQGAMTK. De fyra övergångsfragment kan betecknas y 13, y 7, y 2 och y 14, respektive, där y n betecknar räkning i n aminosyror från peptiden C-terminala änden. Signal-brus varierar från 23 till 53 under de fyra övergångar. En extra röda linjen betecknar 752 → 1269 övergång till 0% häst, 100% nötkött för jämförelse. Endast den icke-noll-regionen av kvarhållningstiden visas. Denna siffra har ändrats från Watson et al. 3.es / ftp_upload / 54.420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Tomt häst nötkött, som procent vikt för vikt, jämfört med häst nötkött som procent övergångstopparea. Handlingen använder paret av peptider nötkött (767) och häst (752) och y 13 fragment jon för båda. Om A betecknar topparea då ordinatan är 100 A H / (A H + A B). Lutningen av den bäst anpassade linjen (R2 = 0,99) är 1,03. Denna siffra har ändrats från Watson et al. 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Valet av ett lämpligt målprotein är viktig. En bra målprotein måste ha motsvarande former i arter av intresse, tillräcklig arter beroende sekvensvariation, artspecificitet, och finns i tillgängliga kvantiteter inom organismerna. För bedömning av blandningar som har bearbetats (till exempel värmebehandling), är önskvärt ett protein som har en sekvens relativt immun mot att behandling. Myoglobin är en bra kandidat för rött kött, inklusive kokt rött kött, men är inte den enda möjligheten. När målproteinet avgörs, är den mest kritiska delen av protokollet protein proteolys. Ett protein skiljer sig från myoglobin kan mycket väl kräva en alternativ proteolys protokoll.

Protokollet som beskrivs innefattar ett segment baserat på referens renade proteinet. Detta syftar till att upptäcka behålla tidsfönster och lämpliga prekursor och fragmentjoner. Detta segment är mycket hjälpsam men inte nödvändigt.

figur 2). Detta beror på att den senare peptiden härrör från en relativt undertryckt KE klyvning, vilket orsakar en underskattning av nivån på hästen i blandningen. Motsvarande peptider som börjar med olika aminosyror därför bäst att undvika. Ofta fragmenten från två motsvarande peptider har identiska aminosyrasekvenser och är hjälpsökande, men detta är inte alltid fallet och behöver kontrolleras under metodutvecklingen. Artbestämning är mycket mindre känsliga för dessa frågor än relativ kvantifiering.

Protokollet har visats för fyra rött kötts 3. Ytterligare köttarter kan ingå, även om kvaliteten på övergångstoppformen kan försämras om alltför många markörpeptider co-elueras, vilket effektivt minskar uppehållstiden och slutligen förnedrande relativa kvantifiering uppskattningar. Förbättrad instrumentering, som redan finns, kommer att förbättra detta. En relaterad fråga är att inte alla kött har olika myoglobins. Till exempel, häst, åsna och zebra myoglobins är identiska och därmed strängt taget metoden är endast kapabel att detektera häst eller åsna eller zebra i nötkött. I vissa fall, även om myoglobins inte är identiska, kan vissa viktiga peptider vara. Till exempel, vissa lamm myoglobin härrörande markörpeptider visas också i get.

En komplikation inför denna och alla andra proteinbaserade kvantifiering metod är att proteinnivå måste antas vara konstant över alla arter, om protein- eller peptidnivåer är att jämställa trivialt till nivåer av kött i en blandning. För myoglobin och fyra röda mäter detta är inte allmängiltigt. Nivåerna är i allmänhet arter som är beroende, med fläsk som uppvisar den lägsta nivån på fyra. Dessutom varierar myoglobin i nivå med köttet styckas och djur ålder. Så även om förhållanden av övergångstoppareor karta tillförlitligt till förhållanden av myoglobin, kartläggning till förhållandet mellan faktiska kött är en uppskattning som drar på antaganden om sannolika källor till kött i blandningen.

Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta arbete skiljer sig på flera sätt från andra publicerade bidrag. En mer typisk väg är att använda proteomik metoder för att identifiera olika disparata arter beroende markör peptider, varvid markörer för olika arter besitter någon särskild relation med varandra 8-12,14,19. Däremot har vi valt proteiner som är gemensamma för alla arter av intresse upp arter beroende sekvensvarianter 3. Bortsett från att vara central för vår relativa kvantifiering strategi, har detta fördelen att provetförberedelse strategier kan optimeras. Dessutom kan sådana motsvarande proteiner förväntas uppföra sig på liknande sätt, till exempel, i extraktion eller i kommersiell bearbetning av prover såsom matlagning eller konservering. Artidentifiering då normalt fortskrider via detektion av disparata markörpeptider, medan det i de CPCP inflygningsidentifierings arter skrider via detektering av nära besläktade peptider som besitter typiskt en eller två sekvensskillnader. Slutligen, för att kvantifiering av proteiner uppskatta viktprocent av en art i en annan kan konventionellt fortskrida via absolut kvantifiering av varje protein separat baserat på kända standarder 7,14,15. Men med hjälp av CPCP metoden finns det inget behov för kalibreringsmetoder. Istället är relativa nivåer beräknas genom att jämföra signalstyrkor av två motsvarande peptider från de två arterna, förbi absolut mätning scenen helt och hållet. Eftersom det slutliga målet är en viktprocent av en art i anoTher, en relativ kvantifiering, då CPCP är både mer direkt och enklare än att jämföra två absoluta kvantifiering. Dessa funktioner översätta till korta experiment gånger, förväntade att vara ungefär två timmar med hjälp av raffinerade protokoll, vilket gör tekniken användbar som en snabb verktyg övervakning i sfären för upptäckt mat bedrägeri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uniprot database www.uniprot.org Freely accessible database of protein sequences
Skyline software www.skyline.gs.washington.edu Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com O9830
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10674922
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10010010
Urea Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com T1426
Formic acid  Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com 1856210
Protein standard Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com P0914
Ultra Turrax homogeniser T25 Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com 75002420
Vacuum centrifuge RC 1022 Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes Phenomenex, Macclesfield, UK 8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 mm x 2.1 mm, 2.6 µm particle size) Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
  2. Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
  3. Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
  4. Food Standards Agency. Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. (2013).
  5. Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
  6. Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
  7. Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
  8. Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
  9. Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
  10. von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
  11. von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
  12. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
  13. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
  14. Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
  15. Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
  16. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  17. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. JoVE, Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2016).
  18. Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. Encyclopedia of Meat Sciences. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).
  19. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics