Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano
Published 10/07/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hidrojeller, doğal ya da sentetik, ve ayırt edici bir üç boyutlu bir yapı ile karakterize olan, hidrofilik, çapraz-bağlanmış polimerler, ile oluşturulan üç boyutlu ağlardır. Bu cihazlar, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, gen taşıyıcıları ve akıllı sensörler 1,2 biyomedikal alanlarında giderek daha caziptir. Gerçekten de, yüksek su içeriği, aynı zamanda bunların reolojik ve mekanik özellikleri onları yumuşak doku mikroçevrelerde taklit eden ve suda çözünür sitokin ya da büyüme faktörü verilmesi için onları etkili araçlar yapmak için uygun bir aday yapar. En umut verici bir kullanım hücreleri ve biyoaktif bileşikler taşıyan bir enjektabl biyomateryal gibidir. In vitro ve in vivo deneyler 3,4 de görüldüğü gibi Hidrojeller, tutma ve hassas fizyolojik ilgili bir şekilde kök hücre düzenleyici sinyallerini sağlayan hücre hayatta kalma ve kontrol kök hücre kaderine iyileştirebilir. Bu lider avantajı olasılıktırvücudun her yerinde göç ve hedef gol 5 kaybetme, dolaşım torrent içine alan ve extravasates bırakır hücrelerin miktarını en aza indirerek, (in situ) aşılama bölgesi içinde enjekte hücreleri korumak için. Üç boyutlu hidrojel ağların stabilite polimer zincirleri 6 arasındaki kovalent bağ ya da bir arada tutma kuvvetlerinden oluşan olan çapraz-bağlama yerleri, kaynaklanmaktadır.

Bu çerçevede, ortogonal seçici kimya polimer zincirleri uygulanan hidrojel performanslarını 7 geliştirmek mümkün çok yönlü bir araçtır. Gerçekten de, uygun bir kimyasal grup ile polimerlerin modifikasyonu hücre canlılığı ve doku oluşumu kullanımlarını artırmak için, uygun kimyasal, fiziksel ve mekanik özellikleri sağlamak için yardımcı olabilir. Aynı şekilde, teknikler arasında RGD peptidin kullanımı hücre yapışması ve hayatta kalma mümkün kılmaktadır, jel matris, hücreler ya da büyüme faktörleri yükleyin. RGD oluşan bir tripeptidegereğidir arginin, glisin ve aspartik asit, en etkili ve çoğu zaman, birden fazla hücre yapışma reseptörüne yönelik kabiliyetini ve hücre ankraj, davranış ve hayatta kalma 8,9 ilgili biyolojik etkisi tripeptid kullanılabilir. Bu çalışmada, RGD işlevselleştirilmiş hidrojellerin sentezi dostça bir hücre mikro için yeterli biyokimyasal karakterize ağları bir amacı ile incelenmiştir.

Hidrojel sentezinde mikrodalga radyasyonunun kullanımı yan reaksiyonların en aza indirmek ve konvansiyonel termal proseslerin 10 ile karşılaştırıldığında daha kısa bir süre içinde daha yüksek reaksiyon verimleri ve oranları elde etmek için basit bir prosedür sunmaktadır. Bu yöntem, polimer etkileşimleri ve reaksiyon sisteminde 11 bir organik çözücü olmaması nedeniyle saflaştırma adımları ve verimi, steril hidrojeller gerektirmez. Bu nedenle, hiçbir mod çünkü polimerik ağ bağlantılı RGD yüksek oranlarda sağlarifications jel oluşumunda rol oynayan bir polimer kimyasal gruplara gerekmektedir. Karboksil grupları, PAA ve karbomer ve hidroksil grupları, PEG ile ilgili ve agaroz, bir polikondensasyon reaksiyonu yoluyla hidrojel üç boyutlu bir yapıya yol açar. Bahsedilen polimerler, omurilik hasarı tamir tedavileri 12 hidrojellerin sentezi için kullanılır. Bu cihazlar, bir önceki bildirilen yüksek biyo-uyumluluk gibi birçok canlı dokular kişilerce tiksotropik doğada benzer mekanik ve fiziksel özellikleri gösteren, 13,14 çalışır. Ayrıca, enjeksiyon bölgesinde yerinde lokalize kalır.

Bu çalışmada, PAA karboksil grupları bir alkin grubu ile (Şekil 1) değiştirilir ve RGD azit bileşiği yapı (CH2) n ile hazırlanan bir kimyasal bileşik ile tripeptid terminal grubu -NH2 reaktivitesini istismar sentezlenir - N 3 (<strong> Şekil 2). Daha sonra, tadil edilmiş PAA CuAAC Click reaksiyonu 15-17 (Şekil 3) ile RGD azid türevi ile reaksiyona girer. bakır (I) 'in bir katalizörün kullanımı, reaksiyon hızı ve regio selektivite her iki büyük değer gelişmelere yol açmaktadır. CuAAC Reaksiyon organik sentezlerde yaygın olarak, polimer bilimi kullanılır. Bu fonksiyonel gruplar, yüksek verim ve yüksek tolerans birleştirir ve organik çözücülerin kullanımı ile etkilenmez. Yüksek seçicilik, hızlı reaksiyon süresi ve basit bir saflaştırma işlemi istenen kısımları 18 aşılama yıldız polimerler, blok kopolimerleri veya zincirlerin alınmasını sağlar. Bu tıklama stratejisi mümkün nihai biyokimyasal uygulamaya göre fizikokimyasal özellikleri özelleştirmek için polimerizasyon sonra polimerlerin değiştirmek için yapar. CuAAC deneysel koşullar kolayca (bakır oksidasyon minimal oluşabilir oysa reaksiyon, su duyarsızdır) tekrarlanabilir ve doğa vardıroluşan triazol ürünün stabilitesini sağlar. Bakır metali kullanımı nedeniyle hücrelerine karşı potansiyel toksik etkisi ve biyolojik mikro olarak, kritik bir nokta olarak kabul edilebilir, fakat diyaliz katalitik kalıntıları tamamen çıkarılmasına olanak sağlayan bir saflaştırma yöntemi olarak kullanılır. Son olarak, PAA RGD hücre ya da ilaç taşıyıcılar olarak bu sistemlerin potansiyel özelliğe kontrol etmek için, incelenmiştir hidrojel sentezi (Şekil 4) ve elde edilen ağların fizikokimyasal özellikleri kullanılır modifiye.

Şekil 1
Şekil 1: PAA alkin sentezi modifiye alkin grubuyla PAA işlevsellik şemasıdır;. "n" karboksil grubu propargilamin ile reaksiyona ile monomerler gösterir. görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

şekil 2
Şekil 2:.. RGD-azid sentezi RGD-Azid türevi sentezi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: reaksiyonu tıklayın Şema RGD-azid türevi ve alkin-PAA arasındaki tıklama reaksiyonun.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Hidrojel syntnüklerde. RGD işlevselleştirilmiş hidrojel sentezi prosedür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Alınan olarak kimyasallar kullanılmaktadır. Linear RGD satın alınan, ancak standart Fmoc katı faz peptit sentezi 16,19 ile hazırlanabilir. Çözücüler, analitik sınıftadır. Diyaliz kesme eşittir 3,500 Da W M zarın kullanımını gerektirir. Sentezlenen 1 400 MHz spektrometre kullanılarak kloroform kaydedilmiş 'H NMR spektrumu (CDCI3) ya da çözücü madde olarak döteryum oksit (D 2 O) ile karakterize edilir, ve kimyasal kaymalar, milyon başına kısımlar olarak δ değerler olarak rapor edilmiştir. Ayrıca, hidrojeller KBr ufak topak tekniği kullanılarak FT-IR analizi tabi tutulur ve fiziksel karakterizasyonu, 37 ° C'de ters test tüpü kullanılarak değerlendirildi jelasyon çalışmaları içerir edilir.

4-Azidobutanoyl 1. sentezi Klorür 1

  1. 10 mL diklorometan ve 0.5 mi dimetilformamid içinde 4-azidobutanoic asit (3.90 mmol), 500 mg eritin.
  2. 0 ° C'da, çözelti soğutulurBir buz banyosu kullanılarak.
  3. karıştırılırken, reaksiyon sistemine damla damla ilave yavaş 5 ml diklorometan ile oksalil klorür (5.85 mmol) 505 ul ilave edin ve.
  4. Bir buz banyosu kullanılarak, 0 ° C'de 1 saat sonra, oda sıcaklığına dönmesi.
  5. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın.
  6. CDCI3 16 örnek eritilmesi, 1H-NMR spektroskopisi ile elde edilen ürünü karakterize eden.

Türev RGD azid 2 2. sentezi

  1. 1 M NaOH ile 1 ml RGD 50 mg (0.145 mmol) çözündürülür.
  2. 2 ml tetrahidrofuran içinde 1 (0.16 mmol) 24 mg eritin.
  3. Bir buz banyosu kullanılarak, 0 ° C 'de çözelti 1 damla damla RGD bir çözüm tüm ekleyin.
  4. Oda sıcaklığına dönmesi ve gece boyunca karıştırın.
  5. 1 M HCI 1 ml ilave edilir.
  6. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın.
  7. OBT karakterizeained 1 'H-NMR spektroskopisi ile ürün D 2 O 16 örnek eritilmesi.

3. PAA Alkin Modifikasyonu 3

  1. damıtılmış su, 15 ml PAA çözeltisi (2.8 mmol) ağ / ağ% 35, 200 mg eritin.
  2. propargilamin hidroklorür (0.20 mmol), 15.4 mg ekleyin.
  3. 1 h / h asetonitril: 1 14 ml 1-hidroksibenzotriazol hidrat 42.8 mg (HOBt, 0.28 mmol) çözülür, 50 ° C'de ısıtılarak damıtılmış su çözeltisi.
  4. oda sıcaklığında PAA çözeltisine HOBt çözümünün tüm ekleyin.
  5. Reaksiyon karışımına etildimetilamino-propilkarbodiimid 53.6 mg (EDC, 0.28 mmol) eklenir.
  6. 5.5 pH ayarlamak ve gece boyunca oda sıcaklığında reaksiyon sistemi karışmaya 1 M HCI kullanarak.
  7. çözüm dialyze. damıtılmış su, 2 L sodyum klorür 11.2 g çözülür ve sonra HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ekleyin. 3.5 kDa kesme W M olan bir zar kullanılarak çözelti dialyze.
  8. perfoÜç gün boyunca rm diyaliz. HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ihtiva eden taze hazırlanmış damıtılmış su, 2 L günlük diyaliz solüsyonunu değiştirin.
  9. -80 ° C de nihai çözelti saklayın. üreticinin protokollerine göre bir liyofilizer içinde liyofilize edin.
  10. D 2 O 16 örnek eritilmesi, 1H-NMR spektroskopisi ile işlevselleştirilmiş polimer karakterize.

PAA-RGD 4. sentezi Polimer 4

  1. PAA 78 mg damıtılmış su, 10 ml alkin 3 (1.083 mmol) modifiye içinde çözülür.
  2. 5 ml tetrahidrofuran içinde RGD azid 2 türevi (0,0722 mmol), 25 mg eritin.
  3. polimerik çözüm RGD çözümün bütün ekleyin.
  4. bakır iyodür (0.0116 mmol) ve sodyum askorbat 2.2 mg (0,0111 mmol), 2.2 mg ekleyin.
  5. karıştırılarak 60 ° C de bir gece boyunca elde edilen karışım, geri akış.
  6. 25 ° C'ye soğutun.
  7. Dialyzçözelti e. damıtılmış su, 2 L sodyum klorür 11.2 g çözülür ve sonra HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ekleyin. 3.5 kDa kesme W M olan bir zar kullanılarak çözelti dialyze.
  8. Üç gün boyunca diyalize gerçekleştirin. HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ihtiva eden taze hazırlanmış damıtılmış su, 2 L günlük diyaliz solüsyonunu değiştirin.
  9. -80 ° C de nihai çözelti saklayın. üreticinin protokollerine göre bir liyofilizer içinde liyofilize edin.
  10. D 2 O 16 örnek eritilmesi, 1H-NMR spektroskopisi ile elde edilen ürünü karakterize eden.

5. RGD fonksiyonalize Hidrojel sentezi

  1. PBS hazırlayın. damıtılmış su, 50 ml PBS tuzu 645 mg çözülür.
  2. Oda sıcaklığında, karbomer, 40 mg ve PBS (aşama 5.1) 9 ml işlevselleştirilmiş PAA 4, 10 mg Karışım, tamamen çözülünceye (30 dakika kadar).
  3. çözeltiye PEG 400 mg ekleyin ve 45 dakika boyunca karıştırmaya devam edin.
  4. karıştırmaya durdurun ve sistem 30 dakika boyunca yerleşmek için izin verir.
  5. 7.4 pH ayarlamak için 1 N NaOH kullanarak.
  6. Elde edilen karışım, 5 ml için, agaroz tozu 25 mg ekleyin.
  7. genellikle 30 saniye ile 1 dakika arasında bir süre boyunca, kaynayana kadar 500 W mikrodalga radyasyon ile sistemin ışın tedavisi ve elektromanyetik olarak 80 ° C'ye kadar ısıtın.
  8. sıcaklığı 50 ° C'ye düşene kadar oda sıcaklığında maruz beklettikten sonra 1 bir çözelti elde etmek üzere, PBS (aşama 5.1) 5 mL: 1 hacim oranında.
  9. 1.1 sm bir çapı olan 12 çukurlu levha ihtiva eden çelik silindirler hazırlayın.
  10. çözelti 500 ul alikotları alın ve her bir çelik silindirlere koyun.
  11. Sistemin tam jelleşme kadar 45 dakika boyunca geri kalanı bırakın.
  12. hidrojeller elde etmek için bir paslanmaz çelik silindir forseps kullanılarak çıkarın.

Terapötik Aracı 6. Yükleme (İlaç veya Hücreler)

  1. st tekrarlayın5.1-5.7 eps.
  2. 1 hacim oranı: (daha önce sol durumunda) karışımı, 37 ° C'ye ulaştığı zaman, 1 son bir sistem elde etmek için, istenen ilaç çözeltisi ya da hücre kültürü içeren çözeltinin 5 ml.
  3. Tekrarlayın fiziksel jel içinde sıkışan biocompounds ile polimerik ağlar elde 5.9-5.12 adımları.

7. Hidrojel Karakterizasyonu

  1. FT-IR Analizi
    1. Jel oluşumunun ardından 24 saat süre ile damıtılmış su içinde 2.5 ml sentezlenmiş hidrojellerin bir bekletin.
    2. Hidrojel batık sulu ortamları çıkarın ve donma-kuru sıvı N2 ile.
    3. KBr ufak topak tekniğine göre hidrojel örnek Laminat.
      1. bir akik havanda içine KBr dolu bir spatula ekleyin. hidrojel örneği küçük bir miktar alın ve KBr tozu ile karıştırın (KBr miktarı, ya da spatula ucu karşılamak için yeterli yaklaşık% 0.1-2).
      2. Toz ince ve homojen olana kadar mikserden. </ Li>
      3. IR pelet oluşturmak için KBr pelet kiti kullanın. Manuel bir laboratuar presi kullanılarak toz basın: 10 ton basınç kapasitesi 3 dakika boyunca, sonra 5 ton eşit ve basınç kapasitesi 3 dakika daha karıştırıldı.
      4. görünüş olarak homojen ve şeffaf nihai pelet elde etmek için baskı bırakın. IR numune tutucu içine pelet yerleştirin ve spektrum 16 çalıştırın.
  2. jelleşme Çalışmaları
    1. PBS 900 ul 2 ml mikrosantrifüj tüpü doldurmak ve 37 ° C'ye kadar dengeye getirin.
    2. hidrojel oluşturan ve 37 ° C'de inkübe hazırlanan polimer çözeltisinin 100 ul ekle.
    3. tüp ters çevirin ve jel, 1, 2, 5, 10 ve 20 dakikada akarsa dikkate alınmalıdır. Jel jelleşme süresi olarak akmayan zaman kaydedilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

N, karboksil grupları amin ile reaksiyona monomerler etiketler, Şekil 1 'de gösterdi PAA alkin türevi etkili bir poliakrilik asit ve propargilamin sentezlenir. Ürünün kimliği 1H-NMR spektroskopisi ile doğrulanmıştır. 5 üçlü bağ ile modifiye PAA 1H-NMR spektrumunu göstermektedir.

Şekil 5,
Şekil 5: PAA 1 H-NMR spektrumu alkin modifiye alkin kısma ilişkin sinyal vurgulanır.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Polimer zincirinin sinyal aralığında 2,75-1,50 ppm gözlemlenebilir; 2,8 bir zirve ise 0 ppm, alkin en H temsilcisi ve -CH2 2 H ilişkin 4.20 ppm'de bir pik noktası, propargil yarımını karakterize eder. Bu PAA düzgün modifiye edilmiş olduğunu doğrular. Şekil 5'te gösterildiği gibi, alkin işlevsellik derecesinin değerlendirilmesi ve propargil kısmı (monomeri başına hidrojenlerin sayısı göre 3.00 olarak ayarlanmıştır) PAA tepelerin altındaki alanların integrasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Işlevsellik f derecesidir şu şekilde hesaplanır:

denklem

denklem propargil kalıntısının ayrılmaz alanı temsil, alkin adlı H alanının toplamı (etiketli denklem ) Ve -CH2 alanı (belirtildiği gibi denklem ), buna karşılıkion "src =" / files / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "> polimer sinyallerinin ayrılmaz alana. işlevsellik derecesi% 10 olarak hesaplanmıştır ve hidrojel sentezi göre düşünün tatmin edici değindiği / PAA 3D ağ oluşturmak için kalıntı karboksil grupları aracılığıyla tepki verir. kantitatif bir verimle modifiye edilmiş polimerin 16 elde edilir.

Benzer bir şekilde, Şekil 6, alkin modifiye PAA ve RGD azid ile CuAAC Click reaksiyonu sonrasında ürünün 1H-NMR spektrumunu gösterir. 8.15 ppm oluşan triazol pik Reaksiyon, kantitatif bir verimle gerçekleşir ve RGD güçlü PAA zincirlerine bağlı olduğunu doğrular. 6 PAA zinciri ve RGD karakteristik sinyaller her göstermektedir Şekil.

Şekil 6,
Şekil 6:RGD 1 H-NMR spektrumu PAA bağlı. Triazol sinyali ( "A" olarak etiketlenen) belirtilmiştir. CuAAC tıklama reaksiyonu ile RGD polimer fonksiyonlandırmalar yapılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

RGD fonksiyonalize hidrojeller mikrodalga destekli serbest radikal polimerizasyonu ile, dört polimer (PAA, karbomer, agaroz ve PEG) kimyasal çapraz bağlanma yoluyla hazırlanır. 80 ° C'ye ısıtma daha yüksek bir makromer hareket yol açar ve bu şekilde polimer karboksil grupları ile hidroksil grupları arasında kısa menzilli bağlantıları geliştirir. esterleşme reaksiyonu bu fonksiyonel gruplar arasında yer alır ve "mikro-j eller" adı verilen yerel ağları üretmektedir.

polikondansasyon ilerledikçe, sürekli sistem viskozite arttıkça, wmakromer reaktif siteler arasındaki etkileşim olasılığı azalır, pompanın. Bununla birlikte, yakın fonksiyonel gruplar nedeniyle yine de daha yavaş bir hareketliliğe verimli etkileşim. Elde edilen fiziksel durumu hidrojel nihai 3D makro yapıyı üreten mikrojel yüzeyleri arasında bir "kaynak" ile karakterize edilir. esterleşme, hidrojen bağı ve karboksilasyon böylece istikrarlı bir heterojen yapısı oluşturma, istatistiksel yakın polimer zincirleri getir. Elde edilen sistem çöz / jel davranışı sergiler ve 5 dakika içinde, bir jel durumuna geçiş yapar. Bu zaman aralığı, jelleşme süresi olarak rapor edilir.

RGD-fonksiyonlu hidrojellerin kimyasal yapısı Şekil 7. FT-IR analizi kullanılarak RGD-Azid bileşiğin FT-IR spektrumları (yeşil hat), RGD işlevsellik (siyah çizgi) olmadan sentezlenen hidrojel arasında karşılaştırma gösterir ve okudu edilir peptid modifikasyonu (mavi çizgi) ile hidrojel. hidrojel specTra hem geniş 3,600-3,200 cm sinyal -1 aralığında kalan OH bağların uzanan titreşim temsilcisi ve 2,940 cm-1 civarında CH streç bir zirve ile karakterize edilir. Esterifikasyon, karboksil ve hidroksil polimer grupları arasında oluşur doğrulama simetrik ve asimetrik CO2 yarımının uzanan, sırasıyla karşılık gelen 1600 cm-1 ve 1400 cm-1 civarında zirveleri ile verilir. RGD hidrojel spektrumda kısmen I ve II amid grupları olarak gösterilen sinyaller sahiptir, oysa bu tepe noktaları, işlevselleştirilmemiş hidrojel spektrumunda daha belirgindir.

Şekil 7,
Şekil 7:. FT-IR spektrumları karşılaştırılması RGD (yeşil hat) FT-IR spektrumları, RGD işlevsellik (siyah çizgi) ve RGD fonksiyonelleştirilmiş hidrojel (mavi çizgi) olmadan hidrojel.RGD gösterilir amid ile ilgili sinyal. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

C gerilmesi = O, amid grup I (Şekil 7'de "Amid I") olarak adlandırılan, 1.650 sm bir tepe -1 tripeptit spektrumunda sunulur ve yaklaşık 1.670 cm kaydırılır -1 RGD hidrojel numunede . (Şekil 7'de "Amid II") amid bandı II ile ilgili NH eğilme, RGD spektrumda -1 1.550 cm civarında sinyal ile kaydedilebilir ve çevresinde 1.600 cm, ayrıca hidrojel numunede tanınabilir - 1. Standart hidrojel formülasyonda herhangi bir amid bileşenleri var olduğu için, bir amidik doğa tepe varlığı PAA çok RGD ile işlevlendirilmektedir ve polimerik ağ içinde yer alan peptit siteleri ile bir hidrojel oluşturmak mümkün olduğunu göstermektedir.

Hidrojel FT-IR spektrumu da agaroz monosakkarit birimlerinin ve ester grupları arasında glikozidik bağ COC gerilmesi titreşim ile ilgili zirveleri (900-1,000 cm -1 aralık) gösterir.

Önceki 13,20 çalışır açıklandığı gibi şişme kinetiği ve reolojik çalışmalar yapılmaktadır, 3D yapısı ve bu hidrojellerin fiziksel ve mekanik özellikleri, SEM analizi, jelleşme içgörü elde etmek. SEM sonuçlar (Şekil 8) hidrojelleri gözenek duvarları küçük gözenekler ihtiva eden bazı büyük gözenekler ve bazı fibriller ağı ile kompleks mikroskopik yapısı ile karakterize edilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, gözeneklerin en birbirine bağlıdır. dolaşmış yapı aynı tarzda, fakat RGD işlevsellik olmadan hazırlanan hidrojeller 3D ağa benzer. Bu RGD polimer ağı değiştirmediğini gösterir. ters tüp testi kullanılarak, hidrojel sRGD işlevsellik 21 olmadan hidrojel örneğinde görüldüğü gibi 5 dakika içinde bol katılaşır. Bu kısa jelleşme süresi biyomedikal uygulamalar için uygunluğu altını çizmektedir.

Şekil 8,
Şekil 8:.. SEM analizleri SEM görüntüleri RGD fonksiyonlu hidrojel örneği (A) ve işlevsel (B) olmayan bir hidrojel morfoloji göstermektedir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Denge şişme oranı emer ve büyük bir su miktarını tutma yeteneğine işaret etmektedir ve hidrojel sistemlerinde 20,22 lider özelliklerinden biridir. analiz numuneleri hızlı kinetik şişme sergileyen ve ilk bir saat içinde denge şişme ulaştığınız. onların kabarmaing denge değeri S önceki çalışmaları 16 bildirilir ve tripeptit polimer ağı ile entegre olan ve jelleştirme işlemi için yüksek engel oluşturmaz teyit RGD olmayan hidrojeller analizi ile elde edilen değere benzerdir.

Reolojik çalışmalarla, jel depolama modülü (G') malzemenin 23 elastik yerine yapışkan bir işaret, kayıp modülü (G'') daha yüksek büyüklükte yaklaşık bir sırası olarak bulunur ve her ikisi de esas itibariyle frekansından bağımsızdır. G've G'' Benzer değerleri bir peptit değişiklik 16 olmadan jel örneği ile kaydedilir. Bu polimer ağı içinde RGD varlığı biyomedikal uygulama için, enjekte edilebilir sistemi için rekabet özgü özellikleri muhafaza malzemesi reolojik özelliklerini etkilemez göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Yazarlar dil düzenleme için verimli bir tartışma Prof. Maurizio Masi ve Miss Chiara Allegretti teşekkür etmek istiyorum. Yazarların araştırma Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in Regenerative Medicine. Adv. Mater. 21, (32-33), 3307-3329 (2009).
  2. Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. Current options for drug delivery to the spinal cord. Expert Opin. Drug Deliv. 10, (3), 385-396 (2013).
  3. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9, (6), 518-526 (2010).
  4. Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34, (15), 3775-3783 (2013).
  5. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat. Mater. 12, (5), 458-465 (2013).
  6. Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (6), 2318-2323 (2013).
  7. Rossi, F., van Griensven, M. Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances. Tissue Eng. Part A. 20, (15-16), 2043-2051 (2014).
  8. Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition. Acta Biomater. 8, (9), 3201-3209 (2012).
  9. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins. Angew. Chem. Int. Edit. 52, (51), 13803-13807 (2013).
  10. Larrañeta, E., et al. Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications. Macromol. Mater. Eng. 300, (6), 586-595 (2015).
  11. Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions. Macromol. Rapid Comm. 33, (4), 332-336 (2012).
  12. Perale, G., et al. Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies. J. Control. Release. 159, (2), 271-280 (2012).
  13. Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers. J. Appl. Polym. Sci. 123, (4), 2211-2221 (2012).
  14. Frith, J. E., et al. An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration. Biomaterials. 34, (37), 9430-9440 (2013).
  15. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Edit. 40, (11), (2001).
  16. Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels. Tetrahedron Lett. 55, (50), 6817-6820 (2014).
  17. Ossipov, D. A., Hilborn, J. Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by "click chemistry". Macromolecules. 39, (5), 1709-1718 (2006).
  18. Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by "Click" Chemistry. Biomacromolecules. 13, (12), 4012-4021 (2012).
  19. Hou, R. Z., et al. New synthetic route for RGD tripeptide. Prep. Biochem. Biotechnol. 36, (3), 243-252 (2006).
  20. Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications. J. Appl. Polym. Sci. 123, (1), 398-408 (2012).
  21. Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels. Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).
  22. Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches. Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).
  23. Rossi, F., et al. Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord. Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).
  24. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov. Today. 8, (24), 1128-1137 (2003).
  25. Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions. Chem. Commun. 46, (44), 8368-8370 (2010).
  26. Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels. Biomaterials. 32, (14), 3564-3574 (2011).
  27. Caron, I., et al. A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury. Biomaterials. 75, 135-147 (2016).
  28. Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation. Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).
  29. Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. J.Biomed. Eng. 32, (2), 387-392 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats