Помощью лазера цитоплазматических микроинъекции в животноводстве зиготы

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Цитоплазматическая микроинъекции 1-клеточных эмбрионов является очень мощной техникой. Он может быть использован для доставки любого раствора в эмбрион, чтобы, например, производят генных нокаутов для изучения функции генов или для создания генных отредактированный животных. Большинство сельскохозяйственно-зиготы соответствующих сельскохозяйственных животных имеют состав , очень высокую жирных кислот , что делает их цитоплазме непрозрачными и темные 1. Кроме того, они имеют достаточно эластичную мембрану плазмы (ПМ). Эти характеристики делают микроинъекции с использованием обычных пронуклеусов / цитоплазматической инъекции, используемый в сложных видов грызунов и часто неточны.

Цитоплазматических микроинъекции имеет преимущества по сравнению с пронуклеарной микроинъекции так как легче выполнить , а также вызывает меньше повреждений инжектированных эмбрионов, что приводит к повышению жизнеспособности 2. Общей целью данного протокола является демонстрация успешного способа доставки решений в цитоплазму зиготы сельскохозяйственных животных. Для того, чтобы быть в состоянии выполнитьцитоплазматический микроинъекции с высокой эффективностью на эмбрионов скота, лазер используется для создания отверстия в пеллюцида (ZP), а затем стакан игла с тупым концом используется для микроинъекции. Эта стратегия направлена ​​на снижение механических повреждений отпечатаны на эмбрион во время инъекции. Затем, стремление цитоплазматического содержимого внутри инъекционной иглы позволяет эффективно и уверенно поломку ПМ, удерживающее раствор подается в цитоплазму зародыша.

Эта методика уже успешно используется в эмбрионы крупного рогатого скота для доставки миРНК в зиготического цитоплазме 3,4 и генерировать мутации , используя кластерные регулярно interspaced короткие палиндромных повторы (CRISPR) CRISPR ассоциированной системы / 9 Система 5 (cas9). Он также подходит (с незначительными изменениями) , чтобы придать бычьи кучевые огороженный ооциты 6. Здесь мы описываем наш протокол инъекции поставляя краситель, который может быть применим к любой инъекции DESIRED раствор в зиготу, и показать, что с помощью этой техники вызывает минимальное лизис и не влияет на раннее развитие эмбриона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Производство Микропипетки

  1. Инъекции микропипетка
    1. Поместите боросиликатного стеклянный капилляр (наружный диаметр (OD): 1,0 мм, внутренний диаметр (ID): 0,75 мм) в микропипетки съемник (в центре держателей правый и левый капиллярных) и зафиксировать его.
    2. С помощью соответствующей программы, чтобы вытащить стеклянный капилляр, так что приводит к тонким кончиком с длинной конусность. (Пример: Тепло: 825; Вытащите: 30; Скорость: 120; Время: 200; Давление: 500).
    3. Осторожно удалите растянутой пипетки из устройства и поместите его на microforge в горизонтальном положении.
    4. Доведите притянутое пипетку и нагреватель нити microforge с его стеклянными шариками в фокусе. Используйте окуляр визира для измерения желаемой толщины и переместите пипетку горизонтально, пока нить нагреватель не достигнет цели (внутренний диаметр 5 мкм).
    5. Отрегулировать высокую температуру до приблизительно 45% и аккуратно довести пипеткой вниз таким образом это касается нити. Включите нагреватель на короткое время. Это жбольной слегка растопить пипетку так что прилипает к нити, и при охлаждении, пипетка будет перерыв в точке контакта, генерирующего прямой разрез.
      Примечание: Установка нужной температуры является ключевым фактором на этом этапе , так как температура слишком высока сделает пипеток изгиб и , таким образом, прямой срез не будет и температура слишком низкая , не будет достаточно , чтобы расплавить пипетка (рис 1А).
    6. Сделать приблизительный 30 ° угол вблизи кончика пипетки, поместив его около 10 мкм от нити накала нагревателя. Установите температуру до 60% и активировать нагреватель.
      Примечание: Это будет изгибаться пипетку над нитью. Этот угол желательно таким образом, кончик иглы параллельно поверхности инжекционного пластины при установке в инъектор (Фиг.1В).
    7. Ручка микроинъекции пипетки с осторожностью , так как они очень острые и хрупкие.
  2. Проведение микропипетка
    1. Поместите borosilicсъел стеклянный капилляр (OD: 1,0 мм, ID: 0,75 мм) в микропипетки съемник (в центре держателей правый и левый капиллярных) и зафиксировать его.
    2. Используйте соответствующую программу, чтобы вытащить стеклянный капилляр, так что приводит к тонким наконечником с длинным даже сужаются и параллельные стенки (Пример: Heat: 815; Вытащите: 20; Скорость: 140; Время: 175; Давление: 200).
    3. Осторожно удалите вытащил пипетку из съемника устройства и поместите его на держателе microforge в горизонтальном положении. Отрегулируйте фокус на нити нагревателя и пипеткой.
    4. Используйте окуляр визира для измерения диаметра пипетки и перемещать пипетку, пока его диаметр по нити достигает 180 мкм.
    5. В указанном размере, отметьте стеклянный капилляр с наконечником пера алмазов, а затем аккуратно нажмите на выдвинутом наконечник, чтобы разбить стекло. Это должно привести к прямой разрез (рис 1C).
    6. Перемещение пипетку в вертикальном положении с ее наконечником близко к нити. Установите температуру от microforge до 60%.
    7. Противопожарные польский кончик пипетки с использованием стандартных методик 7 до тех пор , пока не достигнет идентификатора 40 мкм. Используйте окуляр визира , чтобы проверить идентификатор (Рисунок 1D).
    8. Сделайте угол на пипетку.
      1. Доведите пипетку обратно в горизонтальное положение около 10 мкм от нити и на 5 мм от его кончика. Установите температуру до приблизительно 60% и активировать нагреватель, чтобы согнуть пипетку над нитью. Продолжайте нагревание до тех пор , требуемый угол (около 30 °) не будет достигнута. Проверьте угол визуально (рис 1E).
        Примечание: Пипетка обычно устанавливается на microinjector приблизительно под углом от 60 ° по отношению к нижней части инъекционного тарелки. Кончик пипетки согнута таким образом, что параллельно нижней части блюда, которое необходимо для правильного введения эмбриона в ее средней плоскости.
ле "> 2. Установка Микроманипулятор

  1. Убедитесь, что microinjectors полностью загружены с маслом, и что нет пузырьков воздуха в системе (пузырьки в microinjector предотвратить точный контроль впрыска).
  2. Убедитесь, что микроманипуляторы находятся в центральном положении. Это позволит для широкого диапазона движения пипеток.
  3. Вставьте холдинг пипетки в держатель левого микроманипулятора и инъекционный Налить в правообладателю Микроманипуляция.
  4. Дать маслу входить в пипеток капиллярного и убедитесь, что система работает должным образом, перемещая масло вверх и вниз внутри пипетки с помощью элементов управления microinjector.
    Примечание: Если нет движения нефти внутри игл, может быть забивают. В этом случае рекомендуется использовать новую иглу.
  5. С помощью элементов управления Микроманипулятор принести пипеток в центр поля микроскопа зрения. Использование 4X увеличение, убедитесь, что кончики микропипетка находятся в правильном угле (рarallel на дно тарелки).
    Примечание: Правильная установка игл является ключом для успешной инъекции и для обеспечения согласованности результатов.
  6. Калибровка системы лазерной калибровки следующей инструкцией изготовителя.

3. Подготовка инъекций блюдо (рисунок 2)

  1. Поместите каплю 50 мкл подогретой (37 ° C) SOF-HEPES (композиции, описанные в разделе материалы), дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в центре крышки 100-мм чашках Петри. Поместите 1 - 2 мкл капли раствора для инъекций близко к падению впрыска. Убедитесь в том, что эмбрионы не охладить до температуры ниже комнатной температуры.
    Примечание: В этом протоколе мы добавим декстранфосфатные-красный краситель в раствор для инъекций, чтобы иметь возможность визуализировать места введения и отслеживать его позже.
  2. Накройте капель в инъекционной пластины использованием около 10 мл минерального масла.
  3. Поместите инъекции блюдо на стадии инвертированного микроскопа и довести пипEttes в каплю инъекции. Проверьте, что иглы находятся в фокусе внутри капли. Отрегулируйте их высоту по мере необходимости с помощью элементов управления Микроманипулятор.
  4. Использование microdispenser, загружаем около 20 - 30 зиготы (17 - 20 ч после оплодотворения (HPF)) в верхней части капли впрыска. Выполнение инъекции при комнатной температуре таким образом, количество эмбрионов в капле впрыска определяется скоростью, при которой человек может впрыскивать их. Не загружайте больше эмбрионов, чем те, которые могут быть введены в течение 30 мин.
    1. Для загрузки эмбрионов в в microdispenser, нажмите на поршень полностью и погрузить кончик в раствор, содержащий зародыши. Прикоснитесь к эмбрионы быть подобран с наконечником стеклянного капилляра (по одному в то время) и медленно отпустите поршень, так что каждый эмбрион входит в капилляр. Повторите эту процедуру, пока все эмбрионы подбирают или емкость microdispenser полна.
    2. Чтобы освободить загруженные эмбрионов, не нажимайте на поршень аккуратно, пока весь объем сотрудничестваntaining эмбрионов высвобождается из капилляра.

4. Микроинъекция

  1. Использование цели 4X, загрузите решение для введения в инъекционной пипетки путем применения отрицательного давления (аспирационной). Загрузите достаточное количество раствора, чтобы впрыснуть 2 - 3 зиготы. Затем переходите к падению впрыска.
  2. В капле впрыска, переместите холдинг пипетки таким образом наконечник приближается к зиготы. Применить отрицательное давление (с) аспирации удерживающей microinjector так зигота фиксируется к удерживающей пипеткой и изменения к цели 20Х.
  3. После того, как зигота прикрепляется к удерживающей пипеткой, проверить его качество с помощью инъекционного пипетки, чтобы аккуратно двигаться эмбрион вокруг, не снимая его. Хорошее качество зиготы должны иметь два полярных тела (хотя иногда только один виден) и однородная цитоплазма. Не вводить ненормальные зиготы (рис 3А).
  4. При необходимости, изменить положение эмбриона для надлежащей инъекцииместо нахождения. Хорошее позиционирование было бы, что, в которых есть некоторое пространство между ЗП и ПМ, так что ПМ не повреждаются лазером.
  5. Убедитесь, что инъекции пипетка расположена на средней плоскости эмбриона, осторожно касаясь зиготу на месте инъекции. Если это не на его серединной плоскости, игла будет иметь тенденцию сделать зародыш вращаться вместо пункции. Высоту инъекционной пипеткой по мере необходимости.
  6. Сделайте отверстие в ЗП с помощью лазера (рис 3B).
    1. Использование лазера программного обеспечения место лазер прицельной метки в ЗП, где будет производиться отверстие (на стороне, противоположной стороне, когда эмбрион прикрепляется к удерживающей пипеткой). С помощью лазерного управления окна нажмите на кнопку огня. Убедитесь в том, что размер отверстия достаточно большой, чтобы создать отверстие в ЗП для иглы, чтобы пройти через без повреждения ПМ (пример: 0,662 мс Ширина импульса / Размер отверстия 6,9 мкм).
  7. Пропускают инъекционной иглойчерез отверстие в ЗП и вступить в контакт с ПМ. Продолжить нажатием пипетку вперед , пока игла не три четверти пути в эмбрионе (рис 3C).
  8. Обратите внимание на положение мениска в раствор нефтяного интерфазе, так как это будет использоваться, чтобы постоянно контролировать объем впрыска.
  9. Применить отрицательное давление () на аспирации инъекционной пипеткой, что приведет к ПМ и цитоплазма быть набраны в инъекционной иглы. Продолжайте, пока движение цитоплазмы в иглу не ускоряется или когда содержание цитоплазма смешиваясь с инъекционного раствора можно увидеть. Это будет означать разрушение ПМ (рис 3D).
  10. Вводят назад цитоплазматический содержание с последующим решением в цитоплазму зиготы путем применения положительного давления (инъекционный), пока мениск в раствор масла интерфазе не продвинулась эквивалентный диаметр одной зиготы в прошлом отправной точкой.
    Примечание: В наших условиях это представисентов приблизительно 7 мкл введенного раствора (рис 3Е).
  11. Изменение к цели 4X и переместить впрыскиваемого эмбриона / с до нижней части капли впрыска. Выпуск эмбриона путем применения положительного давления на удерживающей microinjector. Держите неинъекционные эмбрионов на верхней стороне и инъекционные из них на нижней стороне капли, чтобы помочь отслеживать инжектированных / не впрыскивается эмбрионов и эффективно работать.

5. Эмбрион восстановления и нагнетательных Результаты

  1. Сделайте 3 капли приблизительно 200 мкл в новое блюдо с предварительно подогретой SOF-HEPES. Сбор инъецированные эмбрионы, используя microdispenser (как описано выше). Вымойте инъекционные эмбрионов путем перемещения их через 3 SOF-HEPES капель.
  2. Количество эмбрионов лизированных во время микроинъекции и выбросить их.
    Примечание: лизируют зигота может быть легко отличить от неповрежденной один, так как первый появляется полупрозрачный, заполнить всю З.П., и она обычно имеет цитоплазматическиеутечку наружу зародыша содержание.
  3. При желании, проверить эффективность микроинъекции с помощью флуоресцентного микроскопа. Имейте в виду, что УФ воздействие света может вызвать повреждение эмбриона, которые могут повлиять на последующее развитие.
  4. Культура группы 25 инъецированных эмбрионов в 50 мкл капель оптимизации симплекс калия среды (КСОМ) , дополненной 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соответствии с минеральным маслом при 38,5 ° С в атмосфере 5% СО 2 в воздухе, и влажность до насыщения.
  5. Дополнение к культуральной среды с 5% FBS через два дня после инъекции.
  6. Проверьте БЛАСТОЦИСТНОЙ (BL) ставки 7 дней после инъекции. Рассчитать BL цены как общее число бластоцисты эмбрионов / общее количество эмбрионов, культивируемых в этой капле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Лазерная помощь цитоплазматический микроинъекции является мощным и надежным протоколом для доставки решений в цитоплазму зиготы скота. На рисунке 3 показан общий контур зиготы до и после инъекции, а также общий контур техники. Декстран-красный используется в качестве инъекционного раствора для обеспечения отслеживания места инъекции и инъекции эффективности и точности. Успешное предоставление раствора показано на фиг.4 , показывающий в последнее время впрыскиваемого эмбриона , в котором краситель равномерно распределен в цитоплазме. С помощью этого метода 100% эмбрионов впрыскивают в их цитоплазме.

Этот протокол продемонстрировал иметь минимальные ставки лизису в бычьих и овечьих зиготы. Только 15,6 ± 5 и 5,8 ± 3,9% от инжектированных эмбрионов лизируют в крупный рогатый скот и овец, соответственно, в результате микроинъекции рисунке 6, существует статистически значимых различий в частоте развития бластоцисты в контроле против инжектированных групп как для крупного рогатого скота (контроль 32,8 ± 6,6%, 31,4 ± 5,9% , инъецированные) и баранину эмбрионов (контроль 40,3 ± 7,8, 30,3 ± 6,0% впрыскивается).

Эти результаты указывают на то, что с помощью лазера Интрацитоплазматическую инъекции вызывает минимальное повреждение во время инъекции и приводит к нормальной скорости развития бластоцисты.

Рисунок 1
Рисунок 1: Общая схема , показывающая , как сделать Холдинговая и нагнетательных пипеток. AB) Инъекции пипетка, CE) Держа пипетку. A) Осторожно прикоснуться к нити с выдвинутом пипеткой на нужный диаметр (5 мкм). Включите на короткое время нагреватель (показал в о ассортимент). Это будет слегка растопить пипетку так что прилипает к нити , и при охлаждении, пипетка будет перерыв в точке контакта генерации прямой разрез. Б) Марка и угол в пипетку примерно 0,5 см от его кончика, расположив пипетку около 10 мкм от нити накала нагревателя. Продолжайте нагревание до нужного угла не будет достигнута. C) Используйте ручку алмазного наконечника , чтобы отметить и не перерезать удерживающую пипеткой на нужный диаметр (180 мкм). D) в вертикальном положении, огонь-польский кончик удерживающей пипеткой до него достигает желаемого внутреннего диаметра (40 мкм). E) Сделайте угол на пипеткой принося пипетку обратно в горизонтальное позиционирование несколько мкм от нити и около 0,5 см от его кончика. Включите нагреватель, чтобы согнуть пипетку над нитью. Продолжайте нагревание до нужного угла не будет достигнута. См 8,9,10 для получения более подробной информации о том , как сделать иглы.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:.. Общие настройки впрыска Блюдо Устройство пипеток, капель и эмбрионов отображаются на этом чертеже Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: помощью лазера Протокол Интрацитоплазматическую Инъекции A) Общая схема зиготы , прикрепленной к удерживающей пипеткой перед инъекцией. PB: Полярные тела, ZP: пеллюцида, цитохром: цитоплазма, PN: пронуклеусов, PM: Плазма MEMBRANе, HP: держа пипетку, IP:. инъекции пипетка BE) шаги Микроинъекция: B) Сделайте отверстие в ЗП зиготы , прикрепленной к удерживающей пипеткой с помощью лазера С) ввести инъекции пипетки к противоположной стороне эмбриона. , Проверьте положение мениска (а). D) Перерыв плазматическую мембрану аспирацией цитоплазматический содержимое внутри инъекционной пипеткой. E) Вводить обратно цитоплазматического содержание и раствор в зиготического цитоплазмы, пока мениск не достигнет одного диаметра зигота (б) мимо Отправной точкой , Расстояние АВ представляет ~ 7 мкл введенного раствора. F) Общая схема зиготы после инъекции. Обратите внимание , что вводимый раствор равномерно распространяется в цитоплазму. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 4:.. Представитель Рисунок впрыснутые зиготы с декстран-красный A) Светлое поле изображения нагнетаемой зиготы B) флуоресцентное изображение закачиваемой зиготы Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рис . 5: Доля лизируют Эмбрионы после зиготы микроинъекции в двух различных видов представляет данные 4 размножается для эмбрионов крупного рогатого скота ( в общей сложности 103 инъецированных зигот) и 3 размножается для овечьих эмбрионов ( в общей сложности 173 инъецированных зигот). Усы представляют СЭМ Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры.

Рисунок 6
Рис . 6: Бластоциста Цены на говядину и баранину эмбрионов данные представляют 4 размножается для видов крупного рогатого скота в общей сложности 102 инъекции и 156 контрольных эмбрионов и 3 размножается для вида баранину с общим количеством 163 впрыскивается и 239 контрольных эмбрионов. Усы представляют СЭМ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микроинъекция зигот является хорошо установленный способ введения растворов в эмбрионов млекопитающих. С некоторыми вариациями в зависимости от вида и цели эксперимента, этот метод может быть использован в широком смысле. Мы покажем, как выполнить интрацитоплазматическую микроинъекции с помощью лазера, чтобы помочь входу в тупым концом микропипетки. Зиготы некоторых видов животных (таких, как крупный рогатый скот, овцы и свиньи) имеют темную цитоплазму, препятствуя визуализации инъекционной пипеткой один раз внутри эмбриона. Кроме того, их плазматические мембраны очень эластичны, что делает их проникновение со скошенным игольчатым иглы (обычно используется для введения зиготы видов грызунов) трудно достичь. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы использовали лазер, чтобы позволить прохождение тупым концом иглы через пеллюцида и последующее стремление цитоплазматического содержимого, чтобы обеспечить разрушение плазматической мембраны и высвобождению раствора внутри цитоплазмы эмбриона. Кроме того, по injectiнг в противоположном месте входа иглы (около 3/4 внутри эмбриона) мы стремимся сместить PN и тем самым избежать их аспирации / инъекции. Кроме того, это обеспечивает большую точку контакта для разбитое мембраны лечить, таким образом, что приводит к снижению ставок лизиса.

Получение хороших микропипетки (специально впрыскивание пипеток) и соответствующим образом устанавливать их в микроманипулятором является ключом к достижению хороших результатов с этой техникой. Инъекционную иглу можно использовать до тех пор, пока инъекционный раствор плавно перемещается внутри иглы. Иногда, цитоплазматический содержание или даже пронуклеусов содержание застревает внутри кончика иглы, в результате чего поток работать неровно и усложняя инъекции (это также увеличивает скорость лизису и задерживает процесс). Замена иглы для инъекций, когда это происходит, необходимо для получения оптимальных результатов с этим протоколом. Количество времени, что эмбрионы находятся вне инкубатора имеет решающее значениечтобы получить согласованные показатели выживаемости и не должна превышать 30 мин. После обучения и практики, операторы обычно достигают скорость впрыска 1-2 инъецированных эмбрионов в минуту. Еще одним ключевым моментом для успеха этого протокола является последовательно вводить одинаковое количество объема раствора на эмбрион. Это легко и точно регулировать путем наблюдения за смещение интерфейса мениска раствора масла. Важно, чтобы диаметр пипетка согласуется между манипуляциями и что наконечник имеет регулярный и постоянный диаметр. С 5 мкМ ID пипеток на кончике, а 7 - 10 мкл объема впрыска достигается путем введения эквивалентной длине зиготы в. Чрезмерная инъекции часто приводит к лизису эмбриона.

Используя этот протокол, 100% эмбрионов впрыскивают должным образом в цитоплазме, полностью избежать ложного перивителлиновое пространство инъекций (рисунок 4). Это обеспечивает максимальную надежность и воспроизводимость анализа делается (независимо от введенного раствора), так как результаты обусловлены только действием введенного раствора и не инжекционных несоответствий. Некоторые из инжектированных зигот обычно лизировать из-за механического повреждения во время инъекции. Обычная норма выживания после инъекции составляет 75% 11. Используя этот метод, мы можем получить минимальные ставки лизированных эмбрионов (Рисунок 5). Кроме того , бластоцисты темпы развития были сравнимы с неинъекционные (контроль) эмбрионов (Рисунок 6), обозначая , что метод инъекции не имеет отрицательных последствий для раннего развития эмбрионов. Эффективность этого протокола был недавно по сравнению с обычным протоколом цитоплазматической микроинъекции (прямой цитоплазматический микроинъекции с использованием скошенный игольчатым стеклянной иглы без использования лазера проникать де ЗП) для инъекций бычьего зиготы 5. Результаты показали значительно более высокие показатели лизированных эмбрионов и более низкие показатели формирования бластоцист для прямого cytoplasmic микроинъекции. Мы полагаем, что эти различия обусловлены меньшим количеством механических повреждений во время проникновения иглы при использовании с помощью лазера цитоплазматический микроинъекции, что делает этот протокол предпочтительным для потребителей инъекционных видов скота в нашей лаборатории.

Здесь приведены данные для крупного рогатого скота , овец и коз эмбрионов , полученных в экстракорпорального оплодотворения, но также протестировали протокол с использованием в естественных условиях и в пробирке эмбрионы свиней получение аналогичных результатов (данные не показаны). В зависимости от введенного раствора, этот протокол может быть использован для многих приложений. В последнее время мы использовали его , чтобы ввести / систему CRISPR cas9 в нокаут-специфические гены in-vitro оплодотворенных эмбрионов крупного рогатого скота и обнаружили высокую долю секвенсированными бластоцисты с мутациями: 50% эмбрионов (n = 6) имели биаллельных мутации , 33% (n = 4) имел моноаллельной мутации, и 17% (п = 2) были дикого типа 5. Этот протокол был очень надежным и может быть использован внесколько видов и мириады приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats