家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

1細胞胚の細胞質マイクロインジェクションは非常に強力な手法です。これは、例えば、遺伝子機能を研究するために、または遺伝子編集動物を生成するために遺伝子ノックアウトを生成するために胚に任意の溶液を送達するために使用することができます。ほとんどの農学関連の農場の動物の接合体は、それらの細胞質が不透明と1ダークになり、非常に高い脂肪酸組成を有します。彼らはまた、かなり弾性原形質膜(PM)を有します。これらの特性は、挑戦的で、しばしば不正確なげっ歯類で使用されるような従来の前核/細胞質の注入を使用して、マイクロインジェクションを行います。

実行が容易であり、また、より高い生存率を2で、その結果、注入された胚にはあまりダメージを引き起こすため、細胞質マイクロインジェクションは、前核マイクロインジェクションを超える利点を有しています。このプロトコルの全体的な目標は、農場の動物の接合体の細胞質にソリューションを提供するための成功した方法を実証することです。実行できるようにするには家畜の胚に高い効率で細胞質マイクロインジェクション、レーザは透明帯(ZP)に穴を生成するために使用され、その後、平滑末端ガラス針をマイクロインジェクションのために使用されます。この戦略は、注入中の胚に刻印機械的損傷を軽減することを目指しています。その後、注射針の内側の細胞質内容物の吸引は、溶液は、胚の細胞質に送達されることを確実にPMを効率的かつ自信を持って破損することができます。

この技術はすでに正常接合体の細胞質3,4へのsiRNAを送達するようにし、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復(CRISPR)/ CRISPR関連するシステム9(Cas9)システム5を用いて突然変異を生成するために、ウシの胚で使用されてきました。また、ウシ卵丘に囲まれた卵母細胞6を注入する(若干修正済み)が適しています。ここでは、色素を提供我々の注入プロトコルを説明し、それは任意のDESの注入に適用することができますIRED接合子への溶液、およびこの技術を使用して最小限の溶解を引き起こし、初期胚の発育に影響を及ぼさないことを示しています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.マイクロピペット生産

  1. インジェクションマイクロピペット
    1. ホウケイ酸ガラスキャピラリー(:1.0ミリメートル、内径(ID):外径(OD)0.75ミリメートル)を配置(左右キャピラリーホルダーの中央に)マイクロピペットプラーでは、それをロックします。
    2. それは長いタッパーと細い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。 (例:熱:825;プル:30;速度:120;時間:200;圧力:500)。
    3. 慎重にデバイスからプルピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージの上に置きます。
    4. 焦点にそのガラスビーズと引っ張らピペットおよびマイクロフォージヒーターフィラメントを持参してください。所望の厚さを測定し、ヒーターフィラメントが目標内径(5ミクロン)まで水平にピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。
    5. 約45%に熱を調整し、それがフィラメントに触れるようにそっとピペットをもたらします。簡単にヒーターをアクティブにします。このワット病気少しそれがフィラメントに付着するように、ピペットを溶融し、冷却時に、ピペットは、ストレートカットを生成する接触点で壊れます。
      注:適切な温度を設定すると、ピペット曲げを行いますので、ストレートカットができなくなりますし、温度が低すぎるピペット( 図1A)を溶融するのに十分ではない、あまりにも高温以来、この段階で鍵となります。
    6. ヒーターフィラメントから約10μm離れて、それを配置することにより、ピペットチップの近くに約30°の角度を作ります。 60%まで温度を設定し、ヒーターを作動させます。
      注:これはフィラメントの上にピペットを曲げます。この角度は、インジェクタ( 図1B)に取り付けられたときに、針の先端が注入板の面と平行になるように求められています。
    7. 彼らは非常に鋭く、壊れやすいよう慎重にマイクロインジェクションピペットを扱います
  2. ホールディングマイクロピペット
    1. borosilicを配置(左右のキャピラリーホルダーの中央に)マイクロピペットプラーで、それをロックガラスキャピラリー(0.75ミリメートル:1.0ミリメートル、ID OD)を食べました。
    2. (200;プル815:20;速度:140;::;時間圧力175:ヒート例)、それは長くても先細りと平行な壁の薄い先端になるようにガラスキャピラリーを引っ張って適切なプログラムを使用してください。
    3. 慎重プラー装置から引き出さピペットを削除して、水平位置にマイクロフォージホルダーの上に置きます。ヒーターフィラメントとピペットにフォーカスを調整します。
    4. ピペットの直径を測定し、フィラメントの上に、その直径は180μmでになるまでピペットを移動するために接眼レンズのレチクルを使用してください。
    5. 指示されたサイズで、ダイヤモンドチップペンでガラスキャピラリーをマークしてから、そっとガラスを破るために引っ張っ先端に押してください。これは、ストレートカット( 図1C)をもたらすはずです。
    6. フィラメントに近いその先端が垂直位置にピペットを移動します。温度を設定 60%のマイクロフォージの。
    7. ファイアーポリッシュそれが40μmのIDに到達するまでの標準的な技術7を使用してピペットの先端。 ID( 図1D)を確認するために接眼レンズのレチクルを使用してください。
    8. ピペットの角度を作ります。
      1. 約10μm離れたフィラメントと離れてその先端から5mmから戻って水平位置にピペットを持参してください。約60%に温度を設定し、フィラメントの上にピペットを曲げるためにヒーターを作動させます。 (約30 Oの)所望の角度に達するまで加熱を続けます。視覚角度( 図1E)を確認してください。
        注:ピペットは、通常、注射皿の底部に対して60 Oのおおよその角度でマイクロインジェクターに取り付けられています。それは、その中間面における胚の正確な注入に必要な皿の底に平行になるようにピペットの先端が折り曲げられています。
ル "> 2。マイクロマニピュレータのセットアップ

  1. microinjectorsが完全に油がロードされていることを、システム内に気泡が存在しないこと(マイクロインジェクター内の気泡が注射の細かな制御を防ぐ)を確認してください。
  2. マイクロマニピュレーターは、中心位置にあることを確認してください。これは、ピペットの動きの広い範囲を可能にします。
  3. 右顕微ホルダーに左マイクロマニピュレーターホルダーとインジェクションピペットにホールディングピペットを挿入します。
  4. 油が毛細管現象によりピペットに入ると、システムはマイクロインジェクターのコントロールを使用してピペットの内側に上下に油を移動させることにより、正常に動作していることを確認することができます。
    注意:針内のオイルの動きがない場合は、詰まりがあるかもしれません。この場合、新しい針を使用しています。
  5. ビューの顕微鏡の視野の中心にピペットをもたらすためにマイクロマニピュレーターコントロールを使用します。 4Xの倍率を使用して、マイクロピペットの先端が正しい角度(Pであることを確認してください皿の底にarallel)。
    注意:針の正しいセットアップが成功した注射のため、結果の一貫性のためのキーです。
  6. メーカーのキャリブレーション・マニュアルに従ってレーザーシステムのキャリブレーションを行います。

注射皿の調製(図2)

  1. 100ミリメートルのペトリ皿の蓋の中央に20%ウシ胎児血清(FBS)を補充温め(37℃)SOF-HEPES(材料セクションの詳細構成)の50μlのドロップを置きます。噴射ドロップの近くに注入される溶液2μlのドロップ - 1を配置します。胚はRT下に冷却しないことを確認してください。
    注:このプロトコルでは、注射部位を可視化し、後でそれを追跡することができるように注入溶液にデキストラン - レッド染料を追加します。
  2. 鉱物油の約10 mlで用いて射出プレートの低下をカバーします。
  3. 倒立顕微鏡のステージ上に注入皿を置き、ピップをもたらします注射ドロップにettes。針がドロップ内部焦点になっていることを確認してください。マイクロマニピュレーターコントロールを使用して、必要に応じてその高さを調整します。
  4. 噴射ドロップの上側に - (20時間後に受精(HPF)17)30接合体 - マイクロディスペンサーを用いて、約20をロードします。注射降下の胚の数は、人はそれらを注入することができる速度によって決定されるように室温で注入を実行します。 30分で注入することができるものよりも多くの胚をロードしないでください。
    1. マイクロディスペンサへの胚をロードするには、完全にプランジャーを押し下げると胚を含む溶液に先端を浸します。胚が(一度に1つずつ)ガラスキャピラリーの先端でピックアップされるタッチすると、ゆっくりと各胚がキャピラリーに入るように、プランジャーを解放します。すべての胚がピックアップされているか、マイクロディスペンサの容量がいっぱいになるまでこれを繰り返します。
    2. 、ロードされた胚を解放し、ボリューム全体の共同まで静かにプランジャーを押し下げるために、胚をntainingは毛細血管から解放されます。

4.マイクロインジェクション

  1. 4X対物レンズを使用して、負圧(吸引)を適用することによって、注入ピペット内に注入される溶液を読み込みます。 3接合体 - 2を注入するのに十分なソリューションをロードします。そして、射出ドロップに移動します。
  2. 先端が受精卵に近づくように、注射ドロップ内では、保持ピペットを移動します。接合体は、保持ピペットに固定され、20X対物レンズに変更されますので、保持マイクロインジェクターで負圧(吸引)を適用します。
  3. 受精卵をホールディングピペットに装着された後、静かにそれを取り外すことなく、周りの胚を移動するために注入ピペットを用いてその品質を確認してください。良質な受精卵は2極体(時には唯一の1が見られますが)、均質な細胞質を持っている必要があります。異常な接合体( 図3A)を注入しないでください。
  4. 必要であれば、適切な注射用の胚を再配置ロケーション。良いポジショニングとは、ZPとPMの間にいくつかのスペースがあるので、PMは、レーザーによって損傷されないということでしょう。
  5. インジェクションピペットを穏やかに注射部位に受精卵をタッチすることにより、胚のミッドプレーン上に配置されていることを確認してください。それは、その中央平面上にない場合、針が胚ではなく、穿刺回転させる傾向があります。必要に応じてインジェクションピペットの高さを調整します。
  6. レーザー( 図3B)を使用して、ZPに穴を作ります。
    1. レーザーのソフトウェア場所穴(胚は、ホールディングピペットに装着されている場所の反対側に)行われますZPにおけるレーザーレチクルを使用。発射ボタン上のレーザ制御ウィンドウのクリックを使用しました。穴の大きさはPM損傷させずに通過する針のためのZPに開口部を作成するのに十分な大きさであることを確認します(例:0.662ミリ秒パルス幅/ 6.9μmの穴の大きさ)。
  7. 注射針を渡しますZPの穴に通し、PMと接触します。針は胚( 図3C)への道の3/4になるまで前方にピペットを押し続けます。
  8. これは一貫して注入量を制御するために使用されるように、溶液を油相間でのメニスカスの位置を観察します。
  9. PMと細胞質が注射針に吸引されることになりインジェクションピペット、上の負圧(吸引)を適用します。針への質の動きが加速または注射液と取り違え、細胞質の内容を見ることができるときまで継続します。これらは、PM( 図3D)の破損を示します。
  10. ソリューション油相間でのメニスカスが出発点過去1受精卵の直径相当を進んでいるまで、正圧(注入)を適用することにより、接合体の細胞質への溶液、続いて細胞質コンテンツをバック注入します。
    注意:私たちの条件の下では、このrepresents注入した溶液( 図3E)の約7 plの。
  11. 4X目的に変更し、噴射ドロップの下側に/ sの注入された胚を移動します。保持マイクロインジェクターに正の圧力を加えることによって胚をリリース。注入/非注入胚を追跡し、効率的に作業を助けるために、上側の非注入胚とドロップの下側に注入されたものを保管してください。

5.胚の回復と注入結果

  1. 予熱したSOF-HEPESで新しい皿に約200μlの3滴を加えます。 (上記のように)マイクロディスペンサーを用いて注入された胚を収集します。 SOF-HEPESが低下3を介してそれらを移動することにより、注入された胚を洗います。
  2. マイクロインジェクション中に溶解した胚をカウントし、それらを捨てます。
    第1は、全体ZPを記入し、半透明表示されますので、溶解した接合体が無傷の1から容易に区別することができる、そしてそれは通常、細胞質を持っています注意してください胚の外部に漏れるコンテンツ。
  3. 必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて、マイクロインジェクション効率を確認してください。紫外線曝露がその後の発展に影響を与えることができる胚の損傷を引き起こすことがあるので注意してください。
  4. 38.5℃で鉱物油の下で4 mg / mlウシ血清アルブミン(BSA)を補充したカリウムシンプレックス最適化培地の50μlの液滴(KSOM)25注入胚の培養基、飽和5%の空気中のCO 2、湿度。
  5. 2日目の注射後、5%FBSを含む培地を補います。
  6. 注射の7日後に胚盤胞(BL)料金をチェック。胚盤胞の胚/そのドロップで培養した胚の合計数の総数としてBL率を計算します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

レーザーアシスト細胞質マイクロインジェクションは、家畜の接合体の細胞質にソリューションを提供する、強力で信頼性の高いプロトコルである。 図3は、接合体の概要前と注射後だけでなく、技術の全体的な概要を示しています。デキストラン赤注射および注入効率と精度の追跡サイトを可能にするために溶液を注入するように使用されます。溶液の成功した送達は、色素が均一細胞質に分布している最近注入胚を示す。図4に示されています。この技術を用いて胚の100%が、それらの細胞質に注入されます。

このプロトコルは、ウシやヒツジ接合体で最小の溶解速度を有することが示されました。注入された胚の唯一の15.6±5および5.8±3.9%は、マイクロインジェクションの結果として、それぞれ、牛や羊に溶解しました図6に示すように、また、ウシ(32.8±6.6%制御、注入された31.4±5.9%)およびヒツジ胚(40.3±7.8コントロール、30.3の両方に注入群対コントロールの胚盤胞の発達率の有意差は統計学的に存在しません注入された6.0%)±。

これらの結果は、レーザ支援細胞質内注入は、通常の胚盤胞の現像速度で注入し、その結果の間に最小限の損傷を引き起こすことを示しています。

図1
図1:一般的なダイアグラムホールディングとインジェクションピペットを作る方法を示します。 AB)インジェクションピペット、CE)ピペットを保持。A)静かに所望の直径(5ミクロン)で引っ張っピペットを用いてフィラメントをタッチします。 Oで示した(簡単にヒーターを活性化させます範囲)。それは、フィラメントに付着して冷却すると、ピペットはストレートカットを生成する接触点で壊れますので、これは少しピペットを溶融する。B)約10ピペットを配置することにより、約0.5cm離して、その先端からピペットで行い、角度ミクロン離れヒーターフィラメントから。所望の角度が達成されるまで加熱を続ける。C)所望の直径(180ミクロン)でホールディングピペットをマークし、カットするダイヤモンドチップのペンを使用してください。D)縦位置では、火災・ポリッシュホールディングピペットの先端それまで所望の内部直径(40ミクロン)。E)はカップルミクロン離れてフィラメントからと約0.5cm離して、その先端から水平位置に戻し、ピペットをもたらすピペットの角度を作る達します。フィラメントの上にピペットを曲げるためにヒーターをアクティブにします。所望の角度が達成されるまで加熱を続けます。針を作成する方法の詳細については、8,9,10を参照てください。= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2: インジェクション皿の一般的なセットアップピペットの配置、降下、および胚をこの図に表示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3: レーザーアシスト細胞質内注入プロトコル A)注射の前にホールディングピペットに取り付けられた接合体の概略図。 PB:極体、ZP:透明帯、CYT:細胞質、PN:前核、PM:プラズマmembran電子、HP:保持ピペット、IP:インジェクションピペットBE)マイクロインジェクション手順:。。B)は 、レーザーを使用して、ホールディングピペットに取り付けられた接合体のZPに穴を作るC)は 、胚の反対側に注入ピペットを導入します。メニスカス(b)は、過去の開始いち接合体の直径に達するまでメニスカス(A)Dの位置を確認してインジェクションピペット内部の細胞質内容を吸引することにより細胞膜を破る。E)の接合体の細胞質への細胞質の内容及び溶液バック注入。距離abが注入されたソリューションを提供します。F)注入後の受精卵の全体図の〜7 PLを表します。注入した溶液を均一に細胞質内に広がっていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


図4:デキストラン-赤を注入した受精卵の代表的な図 A)を注入接合体Bの明視野像)を注入受精卵の蛍光画像。。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
5:2 つの異なる種における受精卵のマイクロインジェクション後に溶解した胚の割合は、データがウシ胚(103注入された接合体の合計)のために複製し、3は、ヒツジ胚(173注入された接合体の合計)のために複製し4を表します。エラーバーはSEMを表すご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

図6
図6: ウシやヒツジ胚のデータで胚盤胞料金は 4が注入された102と156の制御胚の合計とウシ種のために複製し、3が注入された163と239の制御胚の合計ヒツジ種のために複製を表します。エラーバーはSEMを表す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

接合体のマイクロインジェクションは、哺乳動物の胚にソリューションを導入するための十分に確立された方法です。種および実験の目的に応じていくつかのバリエーションでは、この技術は、広く使用することができます。私たちは、平滑末端マイクロピペットの入り口を支援するためにレーザーを使用して細胞質内マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。 (例えばウシ、ヒツジ、およびブタなど)いくつかの家畜種の接合体は、胚の内部に一度注入ピペットの可視化を妨げ、暗い細胞質を持っています。また、それらの形質膜は、非常に弾性で達成することは難しい(通常はげっ歯類の接合体を注入するために使用)面取りスパイク針で自分の浸透を作ります。これらの制限を克服するために、我々は、原形質膜および胚の細胞質内の溶液の放出の破損を確実にするために、透明帯と細胞質の内容の後続の吸引を介して平滑末端針の通過を可能にするためにレーザを使用します。また、injectiによって針の入り口の反対側のサイトでngの(約3/4胚の内部)我々はPNを置換し、従って、それらの吸引/注入を回避することを目指しています。さらに、このは、このように低い溶解速度が得られ、癒すために壊れた膜のための接触のより多くのポイントを提供します。

良いマイクロピペット(特別に注入ピペット)を製造し、適切にマイクロマニピュレーターにそれらを設定すると、この技術では良好な結果を達成するための鍵です。注射針であれば注射液が針の内部に円滑に移動するために使用することができます。場合によっては、細胞質の内容あるいは前核コンテンツは流れが不均一に実行させ、注入を複雑に、針の先端の内側にはまり込む(これはまた、溶解速度を増加させ、プロセスを遅延させます)。この場合、注射針を交換することは、このプロトコルで最適な結果を得ることが必要です。胚がインキュベータの外側にある時間の量は非常に重要です一貫性の生存率を得るために、30分を超えてはなりません。トレーニングや練習の後、オペレータは通常、毎分1-2注入胚の射出速度を実現します。このプロトコルの成功のためのもう一つの重要なポイントは、一貫して胚あたりの溶液の体積と同じ量を注入することです。これは、簡単かつ正確に液 - 油界面のメニスカスの変位を観察することによって制御されます。ピペットの直径は操作の間およびチップは定期的かつ一定の直径を有している一貫していることが重要です。先端の5μMのIDピペットで、7 - 注入量の10 PLは受精卵の長さに相当するものを注入することによって達成されます。過剰注入は、多くの場合、胚溶解をもたらします。

このプロトコルを使用して、胚の100%は完全に( 図4)虚偽の囲卵腔注射を避け、細胞質に適切に注入されます。これは、(行われているアッセイの信頼性と再現性を最大化かかわらず、結果以来の注入溶液)のみを注入した溶液の効果にではなく、注射の不整合に起因しています。注入された接合体のいくつかは、通常、注射の際に、機械的な損傷を溶解します。注射後の生存の通常率は75%で11です。この方法を使用して、我々は、溶解した胚( 図5)の最小速度を取得することができます。また、胚盤胞の開発速度は注入技術は、初期胚の発育に有害な影響を持っていないことを示す、非注射(コントロール)の胚( 図6)に匹敵しました。このプロトコルの効率は、ウシ接合体5を注入する(デZPを貫通するレーザーを使用することなく面取りスパイクガラス針を用いて直接細胞質マイクロインジェクション)は、従来の細胞質マイクロインジェクションプロトコールに比べ最近ました。結果は直接cytoplために溶解した胚の有意に高い率と胚盤胞形成率の低下を示しましたasmicマイクロインジェクション。我々は、レーザ支援の細胞質マイクロインジェクションを使用して、このプロトコル我々の研究室で家畜種を注入するための好ましい一つとなったときに、これらの違いは、針貫通時に少ない機械的損傷によるものであると信じています。

ここでは、 インビトロ受精によって得られたウシおよびヒツジ胚のデータを提示するだけでなく(データは示さず)、同様の結果を得るブタ胚インビボおよび インビトロで使用してプロトコルをテストしました。注入された溶液によって、このプロトコルは、多くの用途に使用することができます。最近、我々はノックアウトするためのin vitro受精ウシ胚上の特定の遺伝子をCRISPR / Cas9システムを導入するためにそれを使用し、変異を有する配列決定された胚盤胞の割合が高いを発見した:胚の50%を(n = 6)が二対立遺伝子変異を持っていました、33%(N = 4)の1アレルの変異を有し、17%(N = 2)野生型5でした。このプロトコルは、非常に信頼されているとで使用することができます。いくつかの種と無数のアプリケーションに最適です。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats