Высокая пропускная способность, Multi-Image Cryohistology минерализованных ТКАНЕЙ

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Биологические исследования часто требует эффективного фенотипирования, который часто ассоциируется с какой - то гистологического анализа 1-3. Эта потребность становится еще более очевидным с амбициозными проектами , чтобы сорвать каждого гена в геноме мыши 4. Эти гистологические анализы могут варьироваться от оценки морфологии клеток и / или анатомических особенностей для отображения экспрессии специфических генов или белков на отдельные клетки. На самом деле, одним из основных вкладов гистологии в области геномики является способность ассоциировать определенный молекулярный сигнал к определенной области или клеточного типа.

Традиционные методы гистологии, особенно для костно-мышечной ткани, часто отнимает много времени и трудоемкий, требующий иногда несколько недель, чтобы исправить, ДЕКАЛЬЦ, раздел, пятен и изображения образец затем анализируют изображения через человеческой интерпретации. Анализ нескольких молекулярных сигналов, будь то с помощью иммуногистохимии, на месте hybridizat виона, или специальных красителей, требует нескольких разделов и даже несколько образцов для выполнения надлежащим образом. Кроме того, эти множественные ответы могут не быть совместно локализованы в той же самой клетке, а иногда может не быть совместно локализованы в определенной области в пределах данного образца. В поле геномика и Epigenomics переходит в цифровую эпоху, гистологическое поле должно также последовать этому примеру, чтобы обеспечить эффективную, высокой пропускной способностью, а также автоматизированный анализ различных молекулярных сигналов в пределах одного гистологического среза.

Действительно, существует потребность в улучшенных гистологических методов, которые можно связать несколько молекулярных сигналов к специфическим клеткам в пределах данного образца. Недавно мы опубликовали новый высокой пропускной способностью cryohistological метод оценки нескольких ответных мер в рамках данного раздела из минерализованной ткани 5-14. Процесс включает в себя стабилизацию cryosection с замороженными cryotape, приклеивания приклеенный участок жестко предметное стекло микроскопа, ипроведение нескольких раундов окрашивания и обработки изображений на каждой секции. Эти раунды изображения затем выравнивается вручную или с помощью компьютерной автоматизации для предварительного анализа изображений (рисунок 1). Здесь мы приводим подробные протоколы этого процесса и привести примеры, когда эти методы улучшили наше понимание различных биологических процессов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Университет штата Коннектикут медицинского центра институционального и использованию животных комитета одобрил все процедуры животных.

1. Закрепление и встраивание

  1. Усыпить животное с помощью СО 2 удушья или других утвержденных методов.
  2. Заготавливают интересующую ткань (например, конечностей, позвонки и т.д.) и место в 10% нейтральном забуференном формалине при 4 ° С , пока должным образом не фиксирована. Соблюдайте особую осторожность, чтобы поддерживать последовательную анатомическое размещение до фиксации. Например, исправить конечности с суставами на последовательное сгибание, внутреннее вращение, и углы поворота внешнего 11. Как правило, исправить целые конечности мыши в течение 1 - 3 дней.
    Внимание: формалин является токсичным и должны быть обработаны в вытяжном шкафу при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты.
    Примечание: Временной интервал фиксации зависит от размера образца. Если эксперимент позволяет, разрезав кость улучшит фиксацию отсека мозга.Некоторые образцы могут потребовать перфузионной фиксации 15 , чтобы минимизировать флюоресцентный фон (например, слабые флуоресцентные сигналы в пределах костного мозга).
  3. Передача образцов из формалин до 30% сахарозы, сделанные в 1х PBS и инкубировать в течение 12 - 24 ч при температуре 4 ° С.
    Примечание: После того, инкубируют в течение 12 - 24 ч, образцы могут быть помещены при температуре -80 ° С в течение длительного хранения. Этот метод хранения рекомендуется для экспериментов , в которых исследователи намерены встроить несколько образцов в том же блоке , но не можно собирать из этих образцов , в то же время (например, эксперименты с несколькими точками времени).
  4. Удалить образцы из сахарозы и отсечь любую лишнюю ткань.
  5. Заполните cryomold (размер формы зависит от размера образца) часть пути с крио вложение среды. Поместите образец в форму таким образом, что плоскость вырезания для интересующей нас области параллельно с нижней частью литейной формы.
    Примечание: пример конкретного размещения ткани и ориентацииможно найти на рисунке 2А - B.
  6. не Поместите cryomold на кусок сухого льда, пока тонкий слой крио вложение среды замерзает, а затем фиксирует образец на месте. Заполните оставшийся объем cryomold с крио вложение среды при сохранении cryomold на сухой лед гранулы.
  7. Поместите cryomold в контейнере, содержащем 2-метил-бутан, предварительно охлажденное сухим льдом. После того, как образцы полностью заморожен, удалите cryomolds и стряхните 2-метил-бутан. Оберните cryomolds в целлофан и поместить в -20 ° C или -80 ° C морозильника для хранения.
    Примечание: Образцы могут высыхать в течение долгого времени при хранении в крио вложение среды, особенно при -20 ° С. Мы рекомендуем хранить образцы дольше, чем 1 - 2 месяца в крио вложение среды при -80 ° С или в 30% сахарозы при -80 ° С (см шаг 1.3).

2. Лента-стабилизированной ткани Секционирование

  1. Удалить из блоков с образцами морозильника и поместить в cryostaт с температурой, установленной от -20 до -25 ° C.
  2. Удалить блок из cryomold и обрежьте излишки крио вложение среды с лезвием бритвы.
  3. Поместите некоторое крио вложение среды на образец диска, а затем выровнять блок таким образом, что поверхность образца диска параллельна нижней поверхности блока, таким образом, создания надлежащей секущей плоскости для интересующей области.
  4. Поместите образец диска в криостат и позволяют крио вложение среды для замораживания.
  5. Поместите образец диска на голову образца и отрегулировать головку таким образом, что срезает, параллельно поверхности блока образца.
  6. Обрежьте блок вниз до уровня в пределах области, представляющей интерес и стряхните любые стружку с поверхности блока.
  7. Вырезать кусок cryotape достаточно большой, чтобы покрыть область интереса и обработки перед холодом в криостате.
    Примечание: Несколько компонентов могут быть сокращены последовательных размеров и хранятся в cryostв течение секционирования.
  8. Удалите неприлипающими защитную пленку с cryotape, взявшись за ленту, не-липкое серебро / золото вкладок с помощью щипцов затем поместите ленту на блок липкой стороной вниз.
  9. Надавите на cryotape с помощью валика (рис 2С).
  10. Сделать раздел (5 - 8 мкм), используя либо автоматический двигатель или ручной режущий диск криостата.
    Примечание: Это хорошая практика , чтобы удерживать край cryotape , как это происходит на стадии таким образом, что секция не падает со сцены во время секционирования (рис 2D).
  11. Поместите боковую часть ткани на пластиковом стекле микроскопа внутри криостата.
  12. Удалите пластиковую слайд из криостата и позволить крио вложение среды, чтобы расплавить таким образом, что секция прилипает к поверхности ползуна.
  13. Повторите секционирования для последовательных секций или других регионах, представляющих интерес.
  14. После завершения, сохраните секции в слайд-ящикт 4, -20 или -80 ° C в зависимости от длины хранения необходимой и ответных мер вниз по течению. Например, можно использовать слайды, которые собираются быть окрашены для ферментативной активности (см 5.2 - 5.3) в течение месяца при хранении при 4 ° С.

3. Адгезия секций к предметные стекла микроскопа

  1. УФ-отверждаемый клей методом.
    1. Добавьте стекло микроскопа.
      Примечание: Для повышения автоматизации, образцы и слайды могут быть помечены штрих-коды.
    2. Нанесите каплю оптического клея УФ-активируемые для двух предметных стекол и использовать край пластиковой горкой, чтобы нанести тонкий слой клея по всей поверхности предметные стекла.
    3. Отрезанные / вкладку золото серебро и положите приклеенный боковую часть ткани на клей первого слайда. Применяют раздел в прокатном движения от одного края к другому, с тем чтобы свести к минимуму образование пузырьков, увлеченного расположенных под лентой.
      Примечание: Первый слайд используется для предварительного смачивания изнанка тон ленту перед размещением его на второй (постоянной) слайде (этап 3.1.4).
    4. Удалите приклеенный участок с первого слайда и поместить его на клеевой слой второго слайда (рис 3А). Опять же, позаботиться, чтобы избежать захвата пузырьков.
      Примечание: Этот шаг требует практики мастера.
    5. После того, как соответствующее количество секций для данного эксперимента помещается на каждом слайде, вытрите излишки клея из окружающих областей.
    6. Осмотрите каждую секцию близко для пузырьков или волокон, расположенных под лентой. Выполните эту проверку под микроскопом или лупой. Если есть препятствия, удалить отдельные секции, удалите препятствие, а затем повторно применить его к стеклу.
    7. После того, как определено, что не существует никаких препятствий под тесьмой секций, поместите предметные стекла микроскопа под УФ-черным светом в течение 5 - 10 мин сшивать клей.
  2. Хитозан клеевой метод.
    1. Приготовьте тысе 1% хитозана клей. Готовят раствор уксусной кислоты путем растворения 0,25 мл концентрированной уксусной кислоты в 100 мл деионизированной воды (0,25% об / об). Растворить 1 г хитозана порошка в 100 мл раствора уксусной кислоты и перемешайте раствор O / N или пока весь порошок хитозан не растворяется.
      Примечание: Раствор стабилен при комнатной температуре.
    2. Депозит каплю раствора хитозана для каждого раздела, который будет размещен на слайде.
    3. Отрезанные вкладку серебро / золото ленты и поместить каждую приклеенный боковой секции ткани вверх на клей (рис 3А). Используйте большую осторожность, чтобы избежать захвата пузырьков.
    4. После того, как все секции размещены на слайде, наклоняя слайд вверх на одном из своих длинных кромок и перетащите чрезмерное хитозан к нижнему краю с помощью щипцов.
    5. Поместите слайды в этой ориентации на верхней части бумажного полотенца в коробке слайдов. Сила тяжести будет вызывать избыток хитозан падать вниз на полотенце, получая плоский и однородный слой хитозана.
    6. Пласе ящик слайд с крышкой расклиненной открытым в холодильнике O / N, чтобы позволить хитозан высохнуть.
      Примечание: смотри таблицу 1 для сравнения между двумя клейкими методами.

4. Применение опорных маркеров к слайдам

  1. Готовят раствор сравнения маркера путем растворения 50 мкл зеленого и 50 мкл красных микросфер в 100 мкл воды. Храните раствор в темноте при 4 ° С.
  2. Поместите 10 мкл или 20 мкл пипеткой наконечник в раствор микросферы. Добавить небольшую каплю микросферы раствора в каждую секцию , примыкающей к интересующей области (рис 3C). Будьте осторожны, чтобы не получить микросферы в пределах области, представляющей интерес.
  3. Сухие слайды при комнатной температуре (защищенном от света месте) в течение 30 мин при обработке слайдов в этот день. Если нет, то поместите слайды в коробке слайдов при 4 ° С.
    Примечание: До тех пор пока раствор микросферы высыхает до увлажняющим между слайдами, милиcrospheres будет оставаться приклеены к слайдах во время многократных циклов окрашивания / визуализации.

5. Несколько раундов окрашивающего

Примечание: Выбирая согласованная последовательность изображений, окрашивания и этапы reimaging, можно обнаружить и совместно локализовать многие биологические сигналы на той же секции ткани. Каждый раунд визуализации / окрашивания / reimaging должен быть разработан для конкретного гистологического вопроса. Последовательность изображений / окрашивания / reimaging обычно включает в себя приобретение эндогенные флуоресцентные сигналы (например, сотовой связи, GFP минерализация красители, в естественных условиях зонды визуализации) на первом этапе обработки изображений с последующим флуоресцентным мультиплексной иммунным окрашиванием и несколько раундов ферментных пятен активности. И, наконец, раздел может быть окрашивали с использованием хромогенные красители (например, H & E, толуидиновым синим, Safranin O и т.д.) , чтобы выделить архитектуру ткани. Представленные в данном разделе, специальные методы, адаптированные изкоммерчески доступные протоколы.

  1. Кальцеин синего окрашивания накопленного минерала
    Примечание: Кальцеин синего окрашивания дает последовательную минеральную поверхность, которая поддается автоматическому анализу изображения в отличие от темнопольный или дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений. Проблема с кальцеиновой синего окрашивания является то , что спектр флуоресценции перекрывается с тетрациклин и демеклоциклина маркировки. Поэтому, если образец содержит эти минеральные этикетки, изображение метки в первом раунде визуализации предварительного окрашиванию кальцеиновой синим.
    1. Если эндогенные сигналы в ткани изображаются до этой стадии окрашивания, погрузить слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1xPBS, пока крышка проскальзывает не отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
    2. Готовят 30 мг / мл кальцеиновой синий раствор в 2% раствором NaHCO 3 (при растворении 2 г NaHCO 3 в 100 мл H 2 O и регулироватьИнг до рН 7,4 с помощью HCl). Алиготе и хранить раствор при -20 ° С.
    3. Погрузитесь слайдов в Коплин сосуд, содержащий 1X PBS в течение 15 мин, чтобы гидратировать секции, если они уже не гидратированных из предыдущего раунда.
    4. Удалить слайды и высушить заднюю часть и края с бумажным полотенцем.
    5. Применить 100 - 500 мкл кальцеиновой синий раствор на слайд и инкубировать в течение 10 мин в камере влажности при комнатной температуре.
    6. Промыть слайдов в 1x PBS в течение 10 мин с 3-х изменений.
    7. Применить ~ 200 мкл 50% глицерина в 1x PBS к каждому слайду и смонтировать покровное.
    8. Удалите излишки глицерина и высушить в нижней части слайдов.
  2. Тартрат устойчивостью кислой фосфатазы (TRAP) ферментативную активность окрашивания
    Примечание: TRAP выражается несколькими типами клеток в гемопоэтической линии, включая остеокласты. TRAP окрашивание , представленные здесь использует желтый кислой фосфатазы субстрат флуоресцентный. Некоторые флуоресцентные сигналы будут OVerlap с настраиваемой желтый набор фильтров, включая тетрациклина / демеклоциклина минерализацией этикетки, кальцеиновыми синий краситель, и DAPI контрастирующая.
    1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1x PBS до тех пор, пока крышка слипы отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
    2. Готовят буфер 1 путем растворения 9,2 г ацетата безводного натрия и 11,4 г дигидрата двухосновного тартрата натрия в воде и доведение до конечного объема 1000 мл. Доводят рН до 4,2 с концентрированной ледяной уксусной кислоты (~ 1,5 - 2 мл). Хранить раствор при температуре 4 ° C в течение до 12 месяцев.
    3. Подготовка буфера 2 путем растворения 40 мг нитрита натрия в воде и доведение до конечного объема 1 мл. Хранить раствор при 4 ° С в течение до 1 недели.
    4. В день окрашивания, готовят Реакционный буфер путем смешивания 7,5 мл буфера 1 и 150 мкл буфера 2.
    5. Нанести буфер реакции без субстрата на слайдес в течение 10 - 15 мин для уравновешивания ткани при более низком рН.
      Примечание: Типичный объем составляет ~ 200 мкл, но должен быть достаточно большим, чтобы охватить все разделы.
    6. Развести желтый флуоресцентный кислую фосфатазу субстрат между 1:50 и 1: 100 в буфере для реакции.
      Примечание: Разбавление будет диктоваться ТРАППОВОГО активности в образце.
    7. Налейте буфер реакции от слайдов и применять буфер реакции с желтым флуоресцентным субстратом к слайдам.
    8. Поместите слайды под черным светом УФ на ~ 5 мин, чтобы активировать субстрат.
      Примечание: Время инкубации может изменяться в зависимости от активности TRAP в образце.
    9. Промыть слайдов в 1x PBS в течение 10 мин с 3-х изменений.
    10. Применить ~ 200 мкл 50% глицерина в 1x PBS к каждому слайду и смонтировать покровное.
    11. Удалите излишки глицерина и высушить в нижней части слайдов.
      Примечание: Кислотный буфер TRAP будет декальцинировать секции. Дополнительным преимуществом decalcificaние в том , что некоторые цвета будут снова доступны для окрашивания вниз по течению (например, минерализация этикетки). Например, кальцеин синего окрашивания будут удалены в процессе Ловушку окрашивания. Поэтому DAPI контрастирующая могут быть отображены в данном канале в течение последующего раунда.
  3. Щелочной фосфатазы (AP) ферментативную активность окрашивания
    Примечание: Несколько типов клеток, связанные с минерализацией включая остеобласты и Минерализующая хондроциты выразить AP. Быстрый Красный субстрат, используемый в этом протоколе вызывает как флуоресцентный красный и пигментной красный сигнал светофора. Из-за этого хромогенного субстрата утолит флуоресцентные сигналы в тех регионах, где подложка выпадает в осадок. Поэтому, лучше всего сделать это после того, как пятно визуализации флуоресцентных сигналов, которые могут быть закаленных субстратом AP.
    1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1x PBS до тех пор, пока крышка слипы отпасть от слайдах. Remoве и высушить покровных стеклах.
    2. Готовят 1 М Трис путем растворения 12,1 г Трис в 100 мл воды. Регулировка рН до 9,5 с помощью 1 М NaOH.
    3. Готовят 1 М MgCl 2 гексагидрат растворением 20,33 г MgCl 2 в 100 мл деионизированной воды.
    4. Приготовьте 2 М NaCl, растворяя 11,68 г NaCl в 100 мл деионизированной воды.
    5. Готовят 100x (20 мг / мл) раствор быстропротекающих Red TR соль путем растворения 1 г порошка в 50 мл деионизированной воды. Сделайте 100 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.
    6. Готовят 100x (10 мг / мл) фосфатного запас нафтол AS-МХ раствор путем растворения 500 мг порошка в 50 мл N, N диметилформамида. Сделайте 100 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.
    7. В день окрашивания, подготовить буфер AP путем добавления 1 мл 1 М Трис, 0,5 мл 1 М MgCl 2, 0,5 мл 2 М NaCl и довести до конечного объема 10 мл с использованием деионизированной воды (конечные концентрации: 100 мм Трис, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl).
    8. Поместите AP бuffer на каждом слайде и инкубировать во влажной камере в течение 10 мин при комнатной температуре.
    9. Готовят буфер подложки AP путем разбавления 100X запасы Fast Red TR Соль и нафтол AS-MX до 1 раза в буфере AP.
    10. Налейте AP буфера от слайдов и заменить буфером AP подложки. Инкубируйте слайды в течение 5 - 10 мин в камере влажности при комнатной температуре.
      Примечание: Время инкубации будет диктоваться AP активности образца.
    11. Промыть 3 раза скользит в 1X PBS в течение 5 мин каждый.
    12. Установить крышку сползает с раствором DAPI counterstaining (1: 1000 разбавления DAPI в 50% глицерина в 1x PBS).
  4. Толуидиновый синий O (TB) хромогенная окрашивание
    Примечание: Поскольку все предыдущие шаги изображаются под временной водной монтажа в 50% глицерина / раствора PBS, хромогенного стадия также изображается в водных условиях. Тем не менее, красящий раствор может иметь тенденцию к выщелачиванию в течение долгого времени. Таким образом, предлагается к изображению толуидиновым синим как можно скорее после окрашивания.
    1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку , заполненную деионизированной водой до тех пор , пока крышка слипы отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
    2. После снятия крышки слипы, заменить свежей водой и инкубировать слайды в течение не менее 10 мин, так что соли из РФБ, в достаточной степени удалены из ткани.
    3. Готовят 0,025% раствора ТБТ в деионизированной воде.
    4. Поместите слайды в растворе ТБ в течение 1 - 5 мин.
      Примечание: Время инкубации зависит от предпочтений пользователя, но следует держать одинаковым во всех образцах.
    5. Место слайды в Коплин банку с деионизированной водой и мыть слайдов 3x в течение 5 минут каждый.
    6. Установить крышку скольжения с 30% глицерина , растворенного в деионизированной воде (НЕ 1x PBS , поскольку это приведет к пятно вымываться из ткани). Примечание: Глицерин гистологическая среда может быть замещена фруктозный сироп, который помогает предотвратить диффузию пятна из ткани. кподготовить фруктозный сироп, растворить 30 г фруктозы в 10 мл деионизированной воды и нагревают до 60 ° С до растворения.

6. Несколько раундов визуализации

  1. Загрузите слайды в микроскоп лотки (рис 3D).
    Примечание: Лотки подпружинены.
  2. Вставьте лотки в стек лоток слайд - сканирования микроскопа (рис 3Е).
  3. Нажмите на список профилей, чтобы загрузить профиль для каждого слайда с соответствующими экспозициями для каждого флуорофора. Нажмите на название слайд, чтобы назвать каждого слайда вручную или программное обеспечение чтения штрих-код, предусмотренный на этикетке слайд. Нажмите кнопку Предварительный просмотр сканирования начать принимать изображение для предварительного просмотра слайда.
  4. Установить регионы, представляющие интерес в мастере обнаружения тканей и сохранить их для последующих раундов визуализации. После того, как каждый слайд установки, запустите процесс сканирования, нажав на кнопку запуска сканирования.
    Примечание: Система может содержать до 100 SLIдез одновременно.
  5. После завершения формирования изображения, экспортировать изображения из каждого отдельного канала и формирования изображения круглыми, как .tif или .jpg файлы для сборки и анализа изображений.

7. Изображение Ассамблея

  1. Ручной метод с использованием Photoshop (или подобное программное обеспечение для редактирования изображений, способных производить многослойные изображения).
    1. Открыть каждого отдельного канала изображения с каждого раунда визуализации.
    2. Собрать отдельные изображения в виде слоев в пределах одного составного изображения. Для этого щелкните на слое в палитре слоев из одного изображения. Затем перетащите слой на другое изображение. Это операция перетаскивания создаст новый слой в изображении. Сделайте это для всех других изображений. В качестве альтернативы, используйте скрипт (Файл> Сценарии> Загрузить файлы в стек ...), чтобы автоматизировать этот процесс путем загрузки нескольких файлов изображений в качестве слоев в стеке изображений.
    3. После того, как каждое изображение в списке в качестве отдельного слоя в комбинированном изображении, дважды щелкните по имени слоя, чтобы переименовать лаYers по мере необходимости различать разные каналы.
    4. Для того чтобы увидеть через каждый слой и создать действительно составного изображения, измените режим смешивания для каждого слоя из "Normal" на "Screen" в палитре слоев.
      Примечание: Чтобы ускорить этот шаг, изменить один слой на экране, а затем щелкните правой кнопкой мыши на слое, выберите "стиль слоя копия", а затем выделить все остальные слои и выберите "Вставить стиль слоя", чтобы применить стиль экрана к другому слои.
    5. При желании уменьшить непрозрачность (изменить значение на 10 - 40%) хромогенного слоя (то есть, толуидиновым синим) , чтобы лучше визуализировать флуоресцентные сигналы через хромогенного слой.
      Примечание: плиточный сканирующий микроскоп используется в данном протоколе держит слайды на 3-х ребер, тем самым сводя к минимуму количество вращения, которое может произойти на слайд во время каждого раунда визуализации. Таким образом, это намного проще для пользователя, чтобы вручную выравнивать изображения без необходимости поворачивать изображения, полученныеиз различных этапов обработки изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общий рабочий процесс для высокой пропускной способности , Multi-Image Cryohistology

На рисунке 1 представлен общий рабочий процесс , используемый для этой техники. Она включает в себя несколько шагов от фиксации через несколько раундов визуализации и, наконец, изображения выравнивания / анализа. Этот процесс может занять всего лишь неделю, чтобы перейти от фиксации образца через 4 раундов визуализации, что меньше времени, чем требуется, чтобы накипь эти типы образцов. Порядок формирования изображения , как правило , начинается с эндогенных сигналов, которые уже находятся в образце (например, GFPS, минерализация этикетки и т.д.), затем мультиплексируются флуоресцентные иммунное с последующим флуоресцентных анализов ферментативной активности (например., TRAP, AP, и т.д.) и анализы клеточного цикла анализа (например, Edu) и , наконец , заканчивается хромогенного пятна (например, толуидиновым синим O, кромкаatoxylin, Safranin O и т.д.).

Представитель Пример из ювенильного голеностопного сустава 6

Целью данного конкретного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать корреляцию между экспрессией различных типов коллагена (например, COL1A1, Col2a1 и Col10a1) с минерализацией костная сухожилия-к-кости месте введения ахиллова (т.е. имплантация). Таким образом, тройной трансгенная флуоресцентный репортер мыши включая COL1A1-GFPTpz, Col2a1-CFP и Col10a1-mcherry использовали для идентификации клеток , экспрессирующих каждый трансген. Первый раунд визуализации был экспрессии эндогенного трансгенов из двух недельных мышей, что соответствует когда энтезиса минерализаторы в ахиллово сухожилие (рисунок 4B). Второй раунд визуализации Затем проводили намногофотонная микроскоп для получения изображений архитектуры коллагена с помощью генерации второй гармоники два фотона (SHG, рис 4C). Этот шаг был использован для идентификации клеток на основе коллагеновых волокон в энтезиса. Третий раунд визуализации был иммунным шаг для индийского ежа (IHH), который является одним из основных сигнальных лигандов , что способствует минерализации энтезиса (рис 4D). Четвертый раунд визуализации был AP окрашивание с использованием голубой набор субстрата щелочной фосфатазы, который вырабатывающий как Cy5 флуоресценцию и голубые хромогенные сигналы, чтобы визуализировать области активного минерального осаждения (рис 4Е). И, наконец, пятый раунд визуализации было окрашивание ТБ для визуализации анатомических особенностей , включая протеогликанов содержание в пределах костная (рис 4F). Все изображения были вручную выровнен в программу редактирования изображений. Были проведены пять раундов визуализации в течение периода 4-дневного, последовавшей 3дни обработки проб и секционирования (7 дней общего объема).

Представитель Пример из взрослых коленный сустав 11

Цель этого эксперимента заключалась в определении изменений минерализацию, которые происходят в энтезиса медиальной коллатеральной связки (MCL) коленного следующей совместной дестабилизации через рассечения передней крестообразной связки (ACL). Изменения Минерализация можно увидеть в MCL энтезиса уже через две недели после операции в этих 3-месячных мышей. Для того, чтобы контролировать минеральную аппозиция костная внутри энтезиса, минерал метка была дана мышам на день операции (демеклоциклина) и за день до жертву (кальцеина) через 2 недели после операции. Мыши также включены COL1A1-CFP и Col10a1-mcherry флуоресцентные репортеров контролировать экспрессию коллагена неминерализованного и минерализованной fibrochondrocytэс, соответственно. Первый раунд Визуализацию эндогенных сигналов, которые в данном случае соответствует флуоресцентных белков и флуоресцентных меток (минерализация Рисунок 5А). Второй тур включены TRAP окрашивание , чтобы продемонстрировать экспрессию этого фермента в минерализующих fibrochondrocytes в энтезиса, а также остеокластов в основной костного мозга (рис 5B). Третий раунд был AP окрашивания , чтобы продемонстрировать области активной минерализации fibrochondrocytes, а также остеобластов подстилающей кости (рис 5C). Наконец, окрашивание ТБ проводилось в течение четвертого раунда (рис 5D). Все изображения были вручную выровнен в программу редактирования изображений. Еще раз общее время от урожая ткани для выравнивания изображения составила 7 дней.

Представитель Пример губчатой ​​кости из дистального отдела бедренной кости

(фиг.3В). Этот процесс был проведен 8 самок и 8 самцов мышей на 3-х различных уровнях в костном мозге, что дает общее количество 12 слайдов. Опорные маркеры (микросферы) были применены в эпифизе и середине диафиза на сухих участках (рис 3C). Все 12 слайдов окрашивали FOг кальцеиновыми синий и отображены для накопленного минерала (кальцеин синим цветом) и минерализация этикеток (кальцеин и ализарин комплексона) во время первого раунда визуализации (6А). Слайды были затем отображены для TRAP активности (рис 6б) во втором туре и активности КФ (6С) в третьем раунде визуализации. И, наконец, слайды окрашивали толуидиновым синим в четвертом раунде (рис 6D). Опорные маркеры были обследованы во время каждого раунда визуализации, в том числе хромогенного раунда, и были приведены в соответствие с использованием специального программного обеспечения. Для того, чтобы дать представление о пропускной способности для этой процедуры, 32 костей (16 бедренные и 16 позвонков) были встроены в 8 блоков, 3 секции были взяты из каждого блока, секции были распределены по 12 слайдов, и 12 слайдов были обследованы 4 раза производя 96 композитных стеки изображений. Общее время для проведения этого эксперимента было 8 дней.


Рисунок 1. Типичный рабочий процесс для протокола. Общие шаги включают в себя : 1) фиксация тканей, 2) лента-стабилизированного cryosectioning, 3) адгезия заклеенными секций к стеклах, 4) применение опорных маркеров, 5) несколько раундов окрашивания и 6) визуализации и 7) сборка изображения, выравнивание и анализ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Высокая пропускная способность Встраивание и ленты , стабилизированной Cryosectioning. Из - за стабильности , как и cryotape обеспечивает множественные кости могут быть встроены рядом друг с другом (АВ) и секционного одновременно (CD). Кусок сухого льда используется во времяпроцесс встраивания жестко фиксировать кости в месте перед замораживанием весь крио-блок (B). Cryotape раскатывают на блок (C) и секция остается застрял на ленте во время секционирования (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Приверженность маркированной срезы в стеклах, применение опорных маркеров, и загрузка слайдов в Лоток слайд-сканирующего микроскопа. Проклеенные секции приклеен к поверхности предметные стекла с любым УФ-отверждения или клей на основе хитозана (A ). После отверждения или сушки, только тонкий, плоский слой клея остается между cryotape и стеклянной поверхностью (В). Ссылка марKERS применяются для сухих слайдам (C, стрелка указывает на падение из микросферы раствора). Слайды затем монтируется в микроскоп лотки (D) и загружается в микроскоп (E). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Пять раундов изображений из ахиллово сухожилие из двух-недельных мышей. Составной стек изображений (A) была создана из пяти раундов визуализации. Раунд 1 (B): эндогенная COL1A1-GFPTpz, Col2a1-CFP и трансгенная экспрессия Col10a1-mcherry. Раунд 2 (C): коллаген генерации второй гармоники (ГВГ) на два фотона микроскопа. Раунд 3 (D): иммунным для IHH. 4-й раунд(Е): ферментативная активность АР. Раунд 5: толуидиновым синим O (F). Эта цифра была изменена с Дымент и др., 2015 6. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Четыре раунда Визуализация MCL энтезиса следующие совместные дестабилизацией. Колени были дестабилизирована в течение трех-месячных мышей, что приводит к увеличению минерализации MCL энтезиса. Демеклоциклина минеральной этикетке был дан в день операции и минеральной этикетке кальцеиновой был дан накануне жертвоприношения. Раунд 1 (A): эндогенная COL1A1-CFP, Col10a1-mcherry трансгенная экспрессия с демеклоциклина и кальцеиновыми минеральных этикетках. Раунд 2 (B) </ Сильный>: TRAP ферментативную активность. 3 -й раунд (C): ферментативная активность AP. Round 4 (D): толуидиновым синим О. TRAP и сигнал AP был наложены поверх сигнала ТБ в панели BC. Желтый канал может быть использован повторно для TRAP, так как буфер TRAP decalcifies ткани, удаляя метку демеклоциклина. Эта цифра была изменена с Дымент и др., 2015 11. Шкала бар = 200 мкм. Dem: демеклоциклина, TRAP: тартрат устойчивостью кислой фосфатазы, AP: щелочной фосфатазы, MCL: медиальной коллатеральной связки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Четыре раунда визуализации в пределах дистальной части бедренной кости , содержащие Микросфера опорных маркеров. Трехмесячного старый микрофоне были даны кальцеиновыми и ализарин комплексона минеральные этикетки 1раунд (АА '):. эндогенные кальцеиновыми и alizarain комплексона этикетки в дополнение к кальцеиновыми синий окрашивание накопленного минерала Круглый 2 (ВВ.): TRAP ферментативная активность 3раунд (СС'). :. ферментативную активность AP Round 4 (DD '): толуидиновым синим О. зеленые микросферы были обследованы в течение каждого раунда (А'-D', стрелка обозначает ту же микросферы во всех изображениях). Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Хитозан клей УФ-отверждения клея
Клей механизм выпаривание ультрафиолетовыйполимеризация
время отверждения > 24 часа в сутки <20 мин
Могут быть удалены участки после того, как клейких лечений? да Нет
Вылечен клейкую растворимая? Да, в кислых растворах с низким значением рН Нет
Имеет ли выдержать клей извлечения тепла антиген? Нет да
Является ли клей автоматической флуоресцентный? Нет Минимальная в УФ диапазоне

Таблица 1. Сравнение между хитозана клеем и УФ-отверждения клея

Cryotape Tape-Transfer System
Возможность раздела минерализованной кости, используя эту систему? да Да, но куски минерализованной костине может передать полностью на слайд
Возможность раздела минерализованных соединений с использованием этой системы? да да
Возможно раздел мозга с помощью этой системы? Да, но ткань может упасть ленты после нескольких раундов визуализации да
Можно вырезать несколько образцов внедренные в одном блоке? да да
Возможно проведение нескольких раундов визуализации на одном участке? да да

Таблица 2. Сравнение между Cryotape системы и ленты переноса системы

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представили подробный протокол cryohistology к сотрудничеству локализовать и количественно оценить несколько биологических мер, совместив изображения с нескольких раундов окрашивания / визуализации на одном участке. Способ изложены с использованием cryotape особенно полезна , поскольку она поддерживает морфологию трудно раздела ткани (например, минерализованной костной и хрящевой ткани). Кроме того, секционного ткани плотно приклеивают к стеклу, что позволяет для нескольких циклов окрашивания / изображений одного и того же раздела; В отличие от традиционных методов, где последовательные секции каждый окрашивали другим протоколом обмена информацией. Использование серийных срезов может представлять проблему при попытке совместно локализовать сигналы между секциями, то, что это не проблема с отдельными участками, которые были окрашенными и визуализируют с помощью нескольких раундов.

Первая лента стабилизированной ткани секционирования продукт на рынке была система передачи ленты 16, 17. Он использует пластиковую пленку с покрытиемс холодной температуры клея, который помещается на поверхность cryoblock ткани. Когда порезы криостат лезвие под лентой, секция удаляется неповрежденной и прилипает к ленте. Затем лента помещается образцовую сторону вниз на предметные стекла, которые покрыты УФ-отверждения клея таким образом, что ткань становится жестко прикреплен к каретке. После того, как лента зазвенел от секции, ползун может быть обработан для любой флуоресценции или хромогенного гистологии. Фон флуоресценции клеев является низким, а также несколько раундов окрашивания и обработки изображений хорошо работает с большинством мягких тканей. Тем не менее с минерализованных участков, может быть потеря минеральных фрагментов при переносе ткани с клейкой ленты на предметные стекла. Кроме того, это относительно дорогая система для установки в криостат (> $ 8000) и расходные затраты высоки (> $ 2 / слайд).

Другая стратегия стабилизации лента, разработанная доктором Tadafumi Кавамото используетклей с покрытием поливинилиденхлорида пленку, чтобы захватить участок ткани. В своем протоколе, свежей замороженной ткани разрезали на ленту и немедленно фиксировали в PFA или этанол 18. В дальнейшем, лента окрашивали и затем монтируется на предметное стекло со стороной образца вниз для микроскопического исследования. Таким образом, каждый протокол окрашивания выполняется на другом тесьмой секции.

Мы модифицировали и добавили к протоколу Кавамото в ряде способов, включая фиксации образца в формалине до встраивания. Этот шаг имеет решающее значение для фиксации растворимого цитоплазматического GFP трансгенных животных в пределах ячейки. Мы использовали cryotape для широкого спектра типов тканей 5-13. Персонал лаборатории с ограниченным гистологического опытом может производить секции высокого качества с помощью этого метода. Основными преимуществами этого протокола являются относительная низкая стоимость (не специальные приборы, <$ 1.00 за слайд), без потери полезных ископаемых фрагментов,и возможность выполнения множества циклов окрашивания и обработки изображений на том же участке.

Поскольку визуализации те же регионы слайда несколько раз в повторение было бы неразумно для большого количества слайдов, даже с использованием моторизованных стадии, еще один важный шаг этого протокола является использование слайд-сканирующего микроскопа для повышения согласованности и пропускной способности. Микроскоп представляет собой цифровой слайд-сканер, который работает как под эпифлуоресцентной и проходящем свете. Он оснащен 10-позиционным моторизованной турели и как B & W и цветных камер. Истинная новизна системы, в наших руках, является то, что конкретные области интереса могут быть быстро и легко определяется пользователем или определяется автоматически с помощью программного обеспечения визуализации. Эти области интереса могут быть спасены от первого раунда изображения, а затем быстро перезагружается в течение последующих раундах. Таким образом, одни и те же области интереса изображаются во время каждого раунда визуализации. На основе пользователь-Определенные параметры в программном обеспечении, микроскоп будет автофокусировку и сканировать плиточные изображения, которые сшиты во время приобретения в регионах, представляющих интерес.

Порядок, с помощью которого пользователь выполняет несколько раундов окрашивания важно. Общий порядок изложен на рисунке 1. Число флуорофоров , которые могут быть в достаточной степени , отделенных с помощью флуоресцентной микроскопии является основным фактором , ограничивающим числом мер реагирования , которые могут быть приобретены на данном участке. Тем не менее, флуоресцентные каналы могут быть повторно использованы в некоторых случаях. Например, кальцеиновыми синий и демеклоциклина и испускают сильный сигнал в желтом канале, используемом для измерения активности TRAP. Это проступание избежать, хотя, так как буфер TRAP decalcifies раздел, тем самым удаляя минерал перед формирующим изображение Ловушку активности. Кроме того, DAPI контрастирующая будет излучать в желтом канале, а также. Тем не менее, пользователь может заменить DAPI с другим контрастирующая в гое красного или дальнего красного диапазона. Кроме того, антитела могут быть удалены и повторно окрашивали различными антителами с использованием тех же флуоресцентных каналов. Таким образом, этот метод является достаточно гибкой, чтобы увеличение числа ответных мер, которые могут быть записаны на данном участке.

Существуют определенные ограничения с представленным протоколом. 1) cryotape не может в достаточной степени прилипать к определенным тканям. Например, фиксированные формалином срезы головного мозга, как правило, падают с ленты после нескольких раундов окрашивания. Для тканей , таких как это, система передачи ленты может быть более подходящим , поскольку ткань приклеивают к поверхности стекла с помощью УФ-активированного клея (смотри таблицу 2 для сравнения между этими двумя способами). 2) Хитозан клей, обеспечивая при этом прозрачные оптические свойства, не выживают резких шагов обработки, которые включают высокие температуры или сильные кислоты. Таким образом, клей УФ-активированный является более подходящим для этих применений (смотри таблицу 1 Fили сравнение между этими двумя адгезивы).

В cryohistological протоколы, представленные здесь, также поддаются более высокой пропускной способности и автоматизации. Например, стабилизация ленты обеспечивается cryotape позволяет сравнительно начинающим пользователям вырезать несколько костей или суставов сразу в том же блоке, что значительно увеличивает пропускную способность. Использование автоматизированного сканера значительно сокращает техник время и затраты, связанные с изображениями, которая, как правило, является стадией, лимитирующей скорость в нашем опыте. Будучи в состоянии последовательно и надежно изображение той же области интереса несколько раз в течение короткого периода времени обеспечивает платформу для автоматизированного, объективного анализа тканей. На самом деле, наша группа разработала платформу для компьютерной автоматизированной выравнивания и гистоморфометрии кости. Во-первых, программное обеспечение выравнивает несколько раундов изображений на основе флуоресцентных опорных маркеров. Затем выровненные изображения подают в Гистоморфометрия трубопровод, где Computэр программное обеспечение определяет область интересов и объективно измеряет несколько статических и динамических измерений (смотрите на www.bonebase.org) 13. Эта платформа стало возможным из-за увеличения пропускной способности и последовательности, представленной cryotape секционирования, цифровой слайд-сканирующем микроскопе, и программного обеспечения пользовательского анализа. Этот протокол представляет собой значительный прогресс в высокой пропускной способности cryohistology и должна быть полезной для тех изображений трудно раздела тканей, таких как кости, а также тех, кто неопытных с секционирования ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5, (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7, (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2, (4), e61 (2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23, (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405, (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33, (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33, (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28, (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29, (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23, (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33, (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53, (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53, (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics