Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri

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Summary

Riportiamo una procedura raffinata del cloruro ferrico (FeCl 3) modelli trombosi -indotta sulla carotide e dell'arteria mesenterica così come la vena, caratterizzato in modo efficiente usando la microscopia intravitale per monitorare il tempo di occlusiva la formazione di trombi.

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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

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Abstract

Introduction

trombosi arteriosa (coagulo di sangue) è una complicanza comune di molte malattie sistemiche associate a infiammazione cronica, tra cui l'aterosclerosi, il diabete, l'obesità, cancro e patologie reumatologiche autoimmuni croniche. Trombi che si verificano nel gambo circolazione arteriosa da piastrine di attivazione inadeguato, l'aggregazione e successive meccanismi coagulatoria, e sono implicati in attacchi di cuore, ictus e perdita di estremità. La parete del vaso è un sistema complesso che comprende diversi tipi di cellule ed è influenzata da molteplici fattori estrinseci compreso sollecitazione di taglio, le cellule del sangue, ormoni e citochine, così come espressione di proteine ​​antiossidanti circolanti nella parete del vaso. In vitro esperimenti non possono replicarsi questo ambiente complesso e, pertanto, in studi in vivo su modelli animali sono fondamentali per consentire una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nei disordini trombotici.

I topi hanno dimostrato di avere simmeccanismi ili per gli esseri umani in termini di trombosi, arteriosclerosi, infiammazione e il diabete 1,2. Inoltre, i topi transgenici e knockout possono essere creati per testare la funzione di prodotti genici specifici in un fisiologico complesso o un ambiente patologico. Tali studi imitano patologia umana e possono fornire importanti informazioni relative al meccanicistico scoperta di nuovi percorsi e terapie, oltre a fornire dettagli importanti nel caratterizzare gli effetti della droga sulla trombosi.

Trombi arteriosi patologiche si verificano a causa di lesioni endoteliali strato o disfunzione e l'esposizione del flusso sanguigno alla matrice sottoendoteliale 3,4. Vari modelli trombosi sono stati sviluppati per indurre il danno endoteliale, come lesioni meccaniche, danno ossidativo composto fotoreattivo Rosa Bengala-based e lesioni a laser 5. In questo spettro, cloruro ferrico (FeCl 3) indotta danno vascolare è un modello ampiamente utilizzato di trombosi. Questo reagente quandoapplicata all'aspetto esterno delle navi induce danno ossidativo alle cellule vascolari 6-8, con perdita di protezione delle cellule endoteliali dalle piastrine e componenti della cascata della coagulazione circolante. Il modello di FeCl 3 è semplice e sensibile sia anticoagulanti e antipiastrinici farmaci, ed è stata eseguita su arterie carotidee e femorali, vene giugulari e mesenterici ed arteriole cremasterico e venule nei topi, ratti, cavie e conigli 6-15.

Un parametro misurabile in questo modello è il tempo trascorso da un infortunio per completare l'occlusione nave, misurata come la cessazione del flusso sanguigno con un misuratore di portata Doppler o sotto l'osservazione diretta con intravitale 6,7,9 microscopia. Una gamma di volte tra i 5 ei 30 minuti è stato riportato in diversi studi in topi C57Bl6 7-10,16, suggerendo che FeCl 3 concentrazioni, tipi di anestesia, tecniche chirurgiche, l'età del mouse, sfondo genomica, metodo di misurazione Bflusso lood, e di altre variabili ambientali hanno effetti significativi in ​​questo modello. Questa ampia variabilità rende difficile il confronto tra gli studi di diversi gruppi di ricerca e può rendere la rilevazione di sottili differenze difficile.

Con una visione per ridurre al minimo tali variabilità e stabilire un modo uniforme e riproducibile nel sistema modello in vivo, abbiamo affinato il modello dell'arteria carotide FeCl 3 indotta che rende i dati altamente riproducibili con minime variazioni 6-10,16-19. In questo lavoro descriviamo e condividere le competenze e riportiamo alcuni esempi rappresentativi sperimentali che possono beneficiare di questo modello.

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Protocol

Tutte le procedure e le manipolazioni di animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e utilizzo Comitati (IACUC) di The Cleveland Clinic in accordo con gli Stati Uniti la politica di servizio sanitario pubblico sulla cura umana e all'uso degli animali, e la Guida NIH per la cura e L'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione:

  1. Colorante fluorescente per l'etichettatura Piastrine
    1. Preparare rodamina 6G soluzione, 0,5 mg / ml, in soluzione fisiologica e sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtro.
  2. FeCl 3 Soluzione
    1. Fare un magazzino soluzione fresca del 30% FeCl 3 (anidro, è uguale a 1,85 m) in acqua pura, e filtrare con 0,45 micron filtro. Preparare 5 ml fresca FeCl 3 soluzione alla concentrazione desiderata [ad esempio, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) e 12,5% (0,771 M)] di diluendo la soluzione al 30% FeCl 3 con i waterna 6 centimetri piatto di coltura di tessuti e tenere il coperchio chiuso.
      NOTA: Usando il piatto cultura rende più facile per prendere la carta da filtro saturato con FeCl 3 soluzione che raccoglierlo da un contenitore stretto, come ad esempio una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. FeCl3 è estremamente pericolosa e che le precauzioni, come ad esempio indossare guanti e camice da laboratorio, ecc, dispositivi di protezione individuale, dovrebbe sempre essere presa.
  3. Carte da filtro
    1. Tagliare la carta da filtro a 1 mm x 2 mm Dimensioni. Impregna abbastanza pezzi di carta filtro taglia nella soluzione FeCl 3 nello stesso piatto.
  4. Papaverine cloridrato Soluzione
    1. Preparare la soluzione papaverina cloridrato (25 mg / ml) in acqua e sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtro.
  5. gel
    1. Preparare 2% gel in PBS o soluzione salina in 6-pozzetti di coltura tissutale, ~ 1 cm di spessore, e Cut a semicerchio con ~ 3 cm di diametro.

2. FeCl 3 Induced carotidea arteriosa Injury Trombosi Modello

  1. Procedure chirurgiche per il modello Trombosi
    1. Utilizzare 8 - 12 settimane di età topi C57Bl6 (o altri ceppi, se necessario). Anestetizzare topi con la miscela di ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. Confermare la profondità dell'anestesia per pizzicare punta.
      NOTA: Questa quantità di ketamina / xilazina è sufficiente a mantenere l'animale in anestesia stabile e nessun dolore (risposta alla punta pizzicamento) per almeno 1 ora.
    2. Rimuovere pelliccia sul collo e parte superiore del torace, con un piccolo tagliatore elettrico degli animali. crema depilatoria non è necessario. Applicare neutro unguento oculare petrolio sugli occhi per evitare la secchezza durante l'anestesia.
    3. Fissare il mouse in posizione supina sul coperchio di 15 cm di piastra di coltura tissutale. Utilizzare un nastro lungo (~ 10 cm) per garantire hind arti e inferiore del corpo, e due pezzi di nastro piccolo (2 centimetri x 0,5 cm) per garantire zampe anteriori. Utilizzare una sutura 4-0 per avvolgere gli incisivi, nastro le due estremità della sutura al coperchio per mantenere il collo del mouse diritta (Figura 2).
    4. Mettere piatto con la testa del mouse verso l'operatore sotto una fonte di luce chirurgica.
    5. Sterilizzare il sito chirurgico con tampone imbevuto di alcool. Utilizzare i Micro-Adson pinze per tenere la pelle e utilizzare un paio di forbici chirurgiche per fare una piccola incisione (2-3 mm).
    6. Tenere la pelle dell'incisione con la pinza e inserire forbici chirurgiche con ganasce chiuse nell'incisione. Spingere le forbici per via sottocutanea verso il manubrio o il mento, e quindi aprire le forbici per liberare la pelle dallo strato sottocutaneo.
    7. Tagliare la pelle con le forbici chirurgiche per fare una incisione mediana dal manubrio al livello di ioide (Figura 3A e 3B). Senza mezzi termini sezionare la fascia sottile (linea tratteggiata, in (Figura 3B e 3C; frecce blu).
      NOTA: Il manubrio (freccia nera nella figura 3C) e la trachea (T in Figura 3C) saranno visti dopo questo passo.
    8. Tenere il tessuto molle e la pelle visto alla destra del manubrio con la pinza Graefe, inserire il emostatico sotto la fascia verso la posizione ore 2 (gialla linea tratteggiata in figura 3C), aprire le ganasce della pinza emostatica per liberare la vena giugulare dal tessuto circostante.
    9. Tagliare la fascia, tessuti molli e la pelle verso la posizione ore 2 (Figura 3C) con le forbici chirurgiche per esporre la vena giugulare destra (Figura 3D, freccia).
    10. Disegnare sui 200-300 ml rodamina 6G soluzione utilizzando una siringa da 1 ml con 22 ago G, e quindi il cambiamentoal 30 ago G.
      NOTA: Questo protegge l'ago 30 G dai danni della sua punta fine. Direttamente disegnare la soluzione rodamina 6G con l'ago 30 G non danneggia la punta; tuttavia toccare la parete del contenitore accidentalmente causerà un danno, che può rendere iniezione difficile.
    11. Lavare l'ago 30 G lentamente spingendo fuori la soluzione rodamina 6G, assicurarsi che non rimangano bolle d'aria nella siringa o dell'ago. Tenere 100 ml rodamina 6G soluzione iniettabile.
    12. Bend 2 - 3 mm punta dell'ago ad un angolo di 90 ° con il porta-ago, che impedirà di inserire l'ago troppo profonda alla vena giugulare e rende l'iniezione più facilmente controllato (Figura 3D).
    13. Iniettare la soluzione rodamina 6G nella vena giugulare destra alle piastrine di etichette. Per stabilizzare la siringa e mantenere l'ago in posizione, tenere la siringa con una mano e l'ago con la pinza Graefe con un'altra mano durante il injection.Afiniezione ter, morsetto il sito di iniezione con la pinza Graefe per evitare il sanguinamento.
    14. Aprire le ganasce della pinza emostatica e inserirla sotto la pinza Graefe per bloccare la parete del vaso del sito di iniezione, e quindi legare il sito di iniezione con un 6-0 di sutura.
      NOTA: in alternativa di passo 2.1.15, applicando una pressione al sito di iniezione con un dito per 2 minuti si ferma l'emorragia; Tuttavia, questo metodo ha un rischio di causare ulteriori sanguinamento se il coagulo nel sito di iniezione viene rimossa accidentalmente.
    15. Senza mezzi termini sezionare il tessuto molle e la fascia intorno alla ghiandola sottomascellare sinistra con la pinza emostatica e la pinza Graefe e tirare la ghiandola verso la posizione delle ore 7 (Figura 3E) per esporre il muscolo sternocleidomastoideo sinistra (freccia blu in figura 3E).
    16. Senza mezzi termini sezionare la fascia (Figura 3E, linea tratteggiata) tra il muscolo sternocleidomastoideo a sinistra e il muscolo omoioideo o sternohymuscolare OID (Figura 3E, freccia verde) che si trova sul sito di sinistra della trachea con la pinza emostatica.
    17. Passare un ago con 6-0 sutura di seta (circa 15 cm) sotto il centro del muscolo sternocleidomastoideo (freccia blu nella Figura 3E), inserire le due estremità della sutura ed estrarre la sutura lateralmente verso la posizione ore 10 .
      NOTA: Questa procedura deve essere eseguita con cura per evitare lesioni della vena giugulare sinistra, che si trova al di fuori del muscolo sternocleidomastoideo.
    18. Senza mezzi termini separare il sottile muscolo sternoioideo e / o muscolo omoioideo per esporre l'arteria carotide (CA) (Figura 3F freccia) dopo aver tirato via il muscolo sternocleidomastoideo. Tagliare il muscolo sternoioideo e / o muscolo omoioideo se necessario. Utilizzare la pinza emostatica per separare i tessuti molli dal CA senza toccare il CA.
      NOTA: CA è accompagnata dal nervo vago, la struttura bianca visto in figura 3F).
    19. Utilizzare una pinza sottile punta a raccogliere la fascia laterale intorno al CA, evitando il nervo vago e CA. Utilizzare un altro pinze punta fine per fare un buco sulla fascia tra la CA e il nervo vago.
    20. Passare il gancio attraverso il foro e sollevare delicatamente il CA, e quindi posizionare le pinze punta fine sotto la CA. Spostare il gancio e pinze in direzioni opposte lungo il CA per mettere a nudo i tessuti molli avventiziale. Libero di almeno ~ 5 mm di lunghezza di CA (Figura 3H, freccia blu) dal tessuto circostante.
    21. Per bloccare fluorescenza di fondo, premere l'estremità di un nero di plastica del caffè agitatore piatta, crosscut l'agitatore caffè in un pezzo a 3 mm, e poi tagliare longitudinalmente lungo i bordi piega per ottenere due pezzi di "U" in plastica di forma (Figura 3H, verde freccia).
    22. (Figura 3H, freccia verde). Applicare immediatamente 2-3 gocce di soluzione salina per evitare l'essiccamento CA.
  2. Il video in tempo reale di registrazione
    1. Trasferire il coperchio del mouse e la piastra insieme al palco microscopio e posto in una posizione appropriata sotto la lente d'acqua 10X. Riempire lo spazio tra la lente 10X e il CA con soluzione salina.
    2. Avviare l'applicazione software digitale di registrazione video, e lanciare un nuovo file e il nome di conseguenza. Registrare le immagini dei vasi normali e annotare il numero di frame quando la registrazione video viene interrotta.
      NOTA: Fare riferimento al software di registrazione video nel computer per la registrazione. Usiamo software di registrazione video digitale e le seguenti descrizioni sono basati su questa applicazione.
      NOTA: Dal momento Tra meccanicouma può danneggiare l'endotelio e portare alla formazione di trombi 20, è necessario confermare che non vi è alcun pregiudizio chirurgica alla parete del vaso prima dell'incidente FeCl 3. È anche necessario confermare che non rimane tessuto intorno alla CA, che può formare una barriera ed attenuare l'effetto di FeCl 3 lesioni indotta. Annotare il numero di telaio dei record renderà più facile per analizzare i video secondo tempi trascorsi in seguito.
    3. Spostare il mouse con il coperchio piatto fuori della lente 10X. Piegare un angolo di un tovagliolo di carta per fare una punta sottile e fine e usarlo per cancellare con attenzione la soluzione salina in tutto il CA (evitare di toccare CA), così come in altri luoghi nel campo chirurgico. Questo è importante per evitare la diluizione della soluzione di FeCl 3 utilizzati.
    4. Utilizzare una pinza sottile punta e prendere un pezzo di carta da filtro saturato con FeCl 3 soluzione e posizionarlo direttamente sul CA e tenerlo in loco per 1 min.
      NOTA: To visualizzazione ausilio di sangue e raccolta dati precisi, posizionare la carta da filtro in prossimità dell'estremità distale del esposto CA (Figura 3I) e lasciare un breve segmento nella sede prossimale (freccia verde in figura 3I) per osservare il flusso di sangue al fine fase (vedi sotto).
    5. Rimuovere la carta da filtro (questo punto di tempo viene definito come l'inizio di "dopo la lesione") e sciacquare il CA con soluzione salina (almeno 2 ml).
    6. Mettere il mouse con piastra di coperchio posteriore alla lente 10X; osservare la nave e iniziare a immagini video record. Annotare il numero di frame video alla fine del primo minuto di registrazione.
      NOTA: La formazione del trombo è identificato da accumulo di piastrine fluorescenti, che si osserva nelle immagini video in tempo reale sullo schermo del computer o al microscopio. immagini registrare video subito dopo aver messo il mouse di nuovo sotto il microscopio. Mantenere registrazione alla fine del primo minuto dopo aver rimosso la fcarta Ilter. Osservare l'intero vaso dal distale ai siti prossimali per ottenere informazioni sulla ferita, e poi concentrarsi sulla zona di interesse (di solito è il centro della zona lesa) per ulteriore imaging.
    7. Immagini video record per 10 secondi ogni minuto per i primi 10 min (ad esempio, 2:55-03:05) e quindi 10 secondi ogni minuto fino alla fine dell'esperimento. Scrivi i numeri di telaio quando ogni registrazione viene arrestata.
      NOTA: i punti finali del modello sono: 1) quando il flusso di sangue è cessato per> 30 sec; o 2) se l'occlusione non è visto in 30 min dopo la lesione. In questo caso, utilizzare 30 min per l'analisi statistica. Tempo di esposizione impostato del record video come 10 msec all'inizio, quindi sarà facile osservare il flusso di sangue nel trombi. Quando i trombi diventano grandi e la fluorescenza satura sensore della fotocamera, diventa difficile individuare il flusso di sangue nel corso trombi. Per risolvere questo problema, spostare l'ce l'imagingnter al sito illeso prossimale (Figura 3I, freccia verde), dove il flusso di sangue può ancora osservare chiaramente. Aumentiamo anche la Esporre tempo di 15 o 20 msec quando concentrandosi sul prossimale un site-feriti, in modo che il flusso di sangue può essere osservato più chiaramente. Quando il flusso di sangue cesserà, numerose cellule più grandi (leucociti) cominciano a rotolare sulla parete del vaso nel sito prossimale del trombo. Flusso arresta solitamente entro 2 - 3 min dopo la comparsa delle grandi cellule. Annotare il Esporre tempo sul foglio di registrazione se è cambiato. Richiede solitamente circa 30 minuti dall'anestesia alla fine dell'esperimento, se sono stati utilizzati i normali topi wild type C57BL6.
      ATTENZIONE NOTA: non utilizzare il bianco coagulo di piastrine aggregate come il segno della cessazione del flusso sanguigno, che non darà un dati accurati ed è influenzato dal tempo di esposizione. Il coagulo bianco coperto lume del vaso non significa flusso di sangue cessato (vedere il video rappresentante 1).

3. FeCl 3 Induced mesenterica / trombosi venosa modello

  1. Anestetizzare 8-12 settimane di età topi C57Bl6 come indicato nella sezione 2.1.1. Applicare veterinario pomata sugli occhi per evitare la secchezza durante l'anestesia.
  2. Iniettare la soluzione Papaverine (totale 0,4 mg / topo) per via intraperitoneale per inibire peristalsi intestinale.
  3. Rimuovere pelliccia sul collo e l'addome con un tagliatore elettrico degli animali. crema depilatoria non è necessario.
  4. Fissare il mouse in posizione supina sul coperchio di 15 cm di piastra di coltura tissutale. Utilizzare quattro pezzi di nastro piccolo (2 centimetri x 0,5 cm) per garantire tutte le gambe. Utilizzare una sutura 4 -0 per avvolgere gli incisivi, nastro le due estremità della sutura al coperchio per mantenere il collo dritto (Figura 2).
  5. Seguire le procedure 2.1.4 -2.1.15 Per esporre la vena giugulare per l'iniezione di rodamina 6G alle piastrine di etichette.
  6. Eseguire un'incisione mediana attraverso la pelle dal xifoide al basso addome con le forbici chirurgiche (Figura 4A). Sollevare il peritoneo centrale (chiamata anche linea alba, 4A, freccia) con una pinza Graefe, che è chiaro e non ha vasi sanguigni, sollevare circa 2 - 3 mm, confermare senza intestino sotto la linea di taglio, e tagliare il peritoneo aperto longitudinalmente fini forbici (Figura 4B).
  7. Re-proteggere i topi alla posizione laterale destro. Porre il gel di agarosio semicerchio vicino all'addome e esteriorizzare delicatamente l'intestino e distribuirlo sulla sommità del gel con la pinza Graefe (Figura 4C). Utilizzare il secondo rami per l'esperimento trombosi (Figura 4C, freccia).
    NOTA: Utilizzare la pinza emostatica o pinze Micro-Adson per contribuire a esteriorizzare l'intestino. Evitare di danneggiare ilintestinale e la nave.
  8. Posizionare 5 - 6 gocce di soluzione salina per mantenere l'umidità dell'intestino e vaso. Trasferire il mouse con il coperchio piatto insieme al palco microscopio e mettere in posizione appropriata sotto la lente a secco 10X.
    NOTA: utilizzare una lente asciutta perché la membrana digiuno-ileale non può tenere soluzione salina. Assicurati di cadere soluzione salina sui tessuti esposti a mantenerli umidi.
  9. Tamponare la soluzione salina intorno all'arteria mesenterica e la vena prima del trattamento.
  10. Utilizzare una pinza sottile punta a raccogliere un pezzo di carta da filtro saturato con il 12,5% FeCl 3 soluzione e posizionarlo direttamente sul mesenterica e la vena per 1 min (Figura 4D). Rimuovere la carta da filtro (questo punto di tempo viene definito come l'inizio di "dopo la lesione") e risciacquare l'arteria mesenterica feriti e vena con soluzione salina (almeno 2 ml).
  11. Mettere il mouse con piastra di coperchio posteriore sotto la lente a secco 10X; osservare i vasi e iniziare a recimmagini video ord come indicato al punto 2.2).
    NOTA: I punti finali di questo esperimento sono: 1) quando il flusso sanguigno è cessata da> 30 sec; o 2) se l'occlusione non è visto in 30 min dopo la lesione, e in questo caso utilizzare 30 minuti per l'analisi statistica.
  12. Alla fine dell'esperimento, i topi eutanasia mediante overdose di ketamina / xylazina (200/20 mg / Kg), seguita da dislocazione cervicale dopo non respiro e battito cardiaco sono confermate.

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Representative Results

Carotide Trombosi Modello
Nei topi con C57BL6 sfondo, si consiglia di utilizzare 7,5% FeCl 3 per trattare il vaso per 1 min come punto di partenza. Sotto trattamento del 7,5% FeCl 3, i confini della zona feriti e parete dei vasi normali sono facilmente identificabili al microscopio (vedi video in linea 1), suggerendo che lo strato endoteliale è stata significativamente danneggiata. Il trombi formata subito dopo FeCl 3 trattamento, e siano rispettati in tutte WT C57BL6 topi 1 minuto dopo l'infortunio. I trombi si formano inizialmente sono instabili e parti di essi sono di solito lavato via dal flusso sanguigno, in modo che i trombi si formano diventano più piccoli a 2 - 3 minuti dopo l'infortunio. Trombi cominciano a ingrandire 3-4 minuti dopo aver rimosso la carta da filtro e questi trombi poi formate sono stabili e di solito non vengono lavati via. Il tempo medio occlusiva è di 11,3 ± 3,16 min nei topi C57BL6 (n = 14), quando 7,5% FeCl 3 è usato 6,7,19 (Figura 5A e video online 1). Negli studi precedenti abbiamo dimostrato che sia ridurre sia aumento di FeCl 3 concentrazioni diminuiscono la differenza tra un ceppo di topo anti-trombotica e topi WT 6; Dalla nostra esperienza, trattamento della carotide con 7,5% FeCl 3 per 1 min è sufficiente a soddisfare tutti i nostri scopi. Oltre a testare la funzione dei geni specifici utilizzando topi knockout 7,8,16,19,21, seguono sono quattro esperimenti rappresentativi che utilizzano questo modello:

Perfusione endovenosa di tessuti di tipo plasminogeno Mediated trombolisi
Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) è uno dei farmaci approvati dalla FDA per il trattamento trombolisi negli Stati Uniti 22. Abbiamo quindi osservato la trombolisi tPA mediata nel modello di trombosi dell'arteria carotide. trombosi erainiziato con 7,5% FeCl 3 e lasciata formare per 5 minuti prima tPA (1 mg / Kg di peso corporeo) è stato perfuso con un catetere giugulare (22GA). Come mostrato in Figura 5B e video online 2, il trombo continuamente ingrandita e occupa circa il 50% del lume 5 min dopo la lesione. Il trombi continuato per ingrandire dopo tPA perfusione suggerendo che tPA non pregiudica l'attivazione piastrinica e l'aggregazione. La trombolisi iniziato circa 4 minuti dopo l'iniezione tPA. Il trombi formata stati trovati a subire ripetutamente variazioni dimensionali durante il periodo di osservazione di 30 minuti e senza occlusione di vasi successo in questo caso. Questi dati hanno mostrato chiaramente che tPA non può inibire completamente la formazione di trombi piastrinica mediata, anche se porta a trombolisi. Pertanto, prevediamo che futuri esperimenti utilizzando il modello indotta FeCl 3 trombosi arteriosa possono essere utilizzati per valutare trombolitica e altre terapie aggiuntive che possono avere un prev prominenteeffetto entative sulla formazione di trombi.

Perfusione di PAR4 anticorpo nei topi inibisce la trombosi
Proteasi recettore attivato 4 (PAR4) è una proteina recettore accoppiato G (GPCR) sulle piastrine che viene attivato per scissione proteolitica del suo exodomain N-terminale 23 e successivamente porta a passi in attivazione piastrinica. Il laboratorio Nieman ha generato una capra policlonale PAR4 anticorpi (CAN12) che gli obiettivi del gruppo anionico di PAR4, e ritarda PAR4 scissione, interessando così un passo fondamentale per PAR4 mediata attivazione piastrinica 24. Con perfusione di 1 mg / Kg di questo anticorpo ai topi C57BL6, abbiamo trovato che l'inibizione di PAR4 scissione prolunga significativamente volte per occlusivi formazione di trombi nel FeCl 3 carotidea indotta modello arteria trombosi 7,5% (Figura 5C e video online 3). Questo dimostra che il FeCl 3 indotta modello trombosi cun essere utilizzati per valutare gli effetti degli agenti anti-piastrinici e caratterizzare potenziali strategie terapeutiche.

Targeting specifici trombi nanoparticelle-mediata
Rapid coagulo di rimozione di ristabilire il flusso di sangue è fondamentale nel trattamento di malattie vascolari occlusivi tra cui ictus ischemico e infarto del miocardio. consegna sistemica di trombolitico, come tPA mostrato sopra, può lisare i trombi formata, ma non può impedire completamente l'attivazione piastrinica e riaggregazione / occlusione. Inoltre, la consegna diretta sistemica di tali agenti serina proteasi può portare a indiscriminata azione fuori bersaglio, portando ad effetti collaterali, tra cui emorragia. Il laboratorio Sen Gupta ha progettato veicoli di consegna di sintesi di nanoparticelle a base di piastrine di ispirazione che possono legarsi alle piastrine e le proteine ​​attivate coagulo-associata in emodinamica flusso di taglio 25-27. Abbiamo quindi esaminato se queste nanoparticelle possonolegarsi ai trombi che formano attivamente in un'arteria.

Come menzionato in esperimento tPA perfusione, un catetere è stato inserito nella vena giugulare e connessa ad una pompa di iniezione per l'iniezione di nanoparticelle a portata uniforme. In questo esperimento, nessun colorante fluorescente è stato iniettato nel mouse per etichettare piastrine. Invece, le nanoparticelle sono stati etichettati con Rohdamine B; quindi erano in grado di essere osservati al microscopio intravitale. La trombosi è stato avviato con 7,5% FeCl 3 trattamento per 1 min come menzionato in precedenza. Poiché in topi WT, una quantità significativa di trombi è stato trovato per formare 5 min dopo la lesione, abbiamo selezionato questo punto di tempo per l'iniezione di nanoparticelle di rilevare se le nanoparticelle si legano efficacemente ai trombi formatura attivamente. Come mostrato in Figura 5D e video online 4, dopo l'iniezione di nanoparticelle fluorescenti, siamo stati in grado di identificare una forma di montagnatrombo che ha ottenuto progressivamente nella particelle fluorescenti. Questi studi dimostrano l'utilità del modello di indotta FeCl 3 trombosi per valutare la capacità di targeting (e conseguente efficacia terapeutica) dei sistemi di drug delivery particolato coagulo mirati.

Ruolo di globuli rossi diversi Piastrine in formazione di trombi.
Recenti studi hanno suggerito che i globuli rossi (RBC) giocano un ruolo importante nella FeCl 3 indotto modello di trombosi 28 e sono il primo componente del sangue aderente alla parete del vaso feriti 29,30. Per esplorare questo fenomeno, abbiamo etichettato globuli rossi con 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perclorato (Dil, 10 mM concentrazione finale). I globuli rossi Dil marcate sono state lavate due volte con PBS e risospese in soluzione salina al 35% di ematocrito. La sospensione RBC Dil marcato (100 ml per il mouse) è stato iniettareed in topi trombocitopenici che sono stati letale irradiati 5 giorni prima dell'esperimento 19. Questi topi trombocitopenia hanno una significativa riduzione delle piastrine, che consentirà di aumentare la possibilità di RBC aspettando alla parete del vaso, se lo fanno. In contrasto con gli esperimenti utilizzando piastrine fluorescenza marcata (Figura 5), nessun accumulo evidente di cellule fluorescenti stato trovato sulla parete del vaso dopo danno vascolare (Figura 6A, linea v ideo 5). Tuttavia, con la formazione di trombi ricco di piastrine, globuli rossi iniziato ad accumularsi nel trombo che illustra la forma del coagulo (Figura 6A). Immunofluorescenza della carotide feriti dimostrato che i principali cellule aderito alla parete del serbatoio sono piastrine (CD41 positivo, verde), mentre i globuli rossi Dil-marcati sono intrappolati principalmente ai trombi (Figura 6B e C). Questi studi dimostrano che laFeCl 3 modello di trombosi indotta può essere utilizzato nel guadagnare la comprensione meccanicistica su componenti cellulari e molecolari e gli eventi spazio-temporali in formazione di trombi.

Mesenterica Trombosi Modello
Per il modello di trombosi mesenterica, un'alta concentrazione di FeCl 3 (10 - 12.5%) è raccomandato come i vasi sono generalmente circondati da tessuto adiposo, che può ostacolare il FeCl 3 diffusione verso la parete del vaso e quindi impedisce nave dalla FeCl 3 indotta lesioni 7. Questo modello è più adatto per lo studio trombosi venosa. Come mostrato in video linea 6, trombo è stato visto intorno ~ 15 sec nella vena mesenterica dopo l'applicazione topica della carta da filtro saturata con il 12,5% 3 soluzione FeCl, ma la formazione di trombi è drammaticamente ritardata nel mesenterica. Il tempo medio di formazione del trombo occlusivo è ~ 17 ± 7.2 min (n = 11) in m vena esenteric e circa 23 ± 9,9 min (n = 10) in mesenterica quando 12,5% FeCl 3 è utilizzato 7.

Figura 1
Figura 1. Strumenti di intervento chirurgico. Gli strumenti necessari minimi per la chirurgia del mouse sono mostrati. Vedi l'elenco dei materiali per informazioni più dettagliate. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. mouse di fissaggio per la chirurgia. Fissare il mouse sul 15 centimetri cultura piatto coperchio per il modello di trombosi dell'arteria carotide o per l'iniezione di colorante rodamina 6G per il modello di trombosi mesenterica.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. carotide Trombosi modello. Le procedure per esporre la vena giugulare, l'iniezione di rodamina 6G fluorescenti colorante nel sistema sanguigno e l'esposizione della carotide sinistra sono mostrati. In (A), la linea indica l'incisione dal manubrio al livello dell'osso ioide; a (B), le frecce blu indicano le ghiandole sottomascellari e giallo linee tratteggiate rappresentano la fascia tra le ghiandole sottomascellari; in (C), frecce blu indicano ghiandole sottomascellari, freccia nera indica manubrio, e linea gialla tratteggiata indica la posizione di tagliare per esporre la vena giugulare; a (D), freccia blu indica vena giugulare; a (E), freccia gialla indica sinistra della ghiandola sottomascellare, freccia blu indicates sinistra muscolo sternocleidomastoideo, linea gialla tratteggiata indica la fascia, e la freccia verde indica il muscolo omoioideo o il muscolo sternoioideo; a (F), freccia blu indica carotide, le linee tratteggiate gialle mostrano la sottile muscolo sternoioideo e / o il muscolo omoioideo; a (G), la freccia blu indica carotide e la freccia verde indica nervo vago; a (H), la freccia blu indica carotide e la freccia verde indica la plastica "ferro di cavallo" caffè agitatore; e (I), la freccia blu indica la carta da filtro situato con FeCl 3 soluzione e freccia verde indica l'arteria carotidea. T indica trachea. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. mesenterica e trombosi venosa modello. L'esposizione di vasi mesenterici nonché FeCl 3 trattamento. In (A), la freccia blu indica linea alba, il tessuto fibroso bianca senza nave; In (B), una incisione tagliato da solo è stato mostrato la linea alba; in (C), le frecce blu indicano il secondo arco delle arterie e le vene mesenteriche; a (D), la freccia blu indica la carta da filtro situato con FeCl 3 soluzione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Gli esperimenti rappresentativi utilizzando l'arteria carotide Trombosi modello. (A). La formazione del trombo in theC57Bl / 6 del mouse trattati con 7.5% FeCl 3. (B). TPA mediato effetto trombolitico. (C). L'iniezione di anticorpi mira recettore del mouse trombina PAR4 sulla trombosi è stato mostrato. (D). Trombo-targeting per sito nanovehicles si legano specificamente alla formazione di trombi attivamente è stato mostrato . Inj. P indica iniezione di particelle; e Peak B indica picco bande di particelle al trombi. Tutte le immagini sono state prese sotto lo stesso ingrandimento. Scala bar = 300 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Ruolo RBC sulla formazione di trombi. (A) i topi che hanno ricevuto trombocitopenica perfusione di globuli rossi Dil-marcati sono stati sottoposti a l'arteria del modello e le immagini trombosi carotidea dopo 7,5% FeCl (B & C) Le arterie carotidi feriti sono state raccolte, e sezioni congelate sono stati preparati. Le piastrine sono state colorate con CD41 (verde) e globuli rossi sono stati mostrati in rosso (Dil). I nuclei sono state colorate con DAPI. Vasi mostrati in (B e C) sono stati da due topi diversi. Barre di scala = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: Video Rappresentante della carotide modello di trombosi nei wild-type (WT) topi. (Tasto destro del mouse per scaricare.) Questo video mostra la formazione di trombi rappresentante nella carotide di topi WT indotta dalla carta da filtro topica applicando situato7.5% FeCl 3 soluzione. Le piastrine sono stati etichettati per iniezione endovenosa di rodamina 6G, e il video è stata presa in modalità monocromatica. La massa bianca è piastrine coagulato.

Video 2
Video 2: attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) mediato effetto trombolitico rilevato dal modello di trombosi dell'arteria carotide. (Tasto destro del mouse per scaricare.) L'etichettatura delle piastrine e la formazione di trombi sono stati avviati come detto in video 1, e tPA è stato iniettato per via endovenosa 5 minuti dopo l'7,5% FeCl 3 lesioni.

Video 3
Video 3: farmaci antiaggreganti, na Mely anti-proteasi activated receptor 4 (PAR4) anticorpo, mediata effetto anti-trombotico rilevata dal modello di trombosi dell'arteria carotide. (Tasto destro del mouse per scaricare). In questo esperimento, i topi hanno ricevuto anticorpi PAR4 e rodamina 6G iniezione 10 minuti prima formazione di trombi è stato avviato mediante l'applicazione topica carta da filtro situato con 7,5% FeCl 3.

Video 4
Video 4: Nanoparticle-mediata specifici trombi targeting. (Tasto destro del mouse per scaricare). In questo esperimento, carotide formazione di trombi è stato avviato con il 7,5% FeCl 3 senza etichettatura delle piastrine. Nanoparticelle è stato marcato con rodamina B e per via endovenosa iniettato il mouse 5 minuti dopo l'infortunio.

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Video 5: Il legame di globuli rossi rilevati dal modello di trombosi dell'arteria carotide. (Tasto destro del mouse scaricare.) Globuli rossi (RBC) sono stati etichettati con 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perclorato (Dil, 10 mM concentrazione finale), e 100 ml di globuli rossi Dil-etichettati (35% ematocrito) sono state iniettate in topi trombocitopenici. No etichettatura delle piastrine è stata eseguita in questo esperimento. Trombo è stato avviato come detto sopra with7.5% FeCl 3.

Video 6
Video 6: Video Rappresentante del arteria e vena modello trombosi mesenterica su topi WT. (Destro click per scaricare.) Le piastrine sono stati etichettati per iniezione endovenosa di rodamina 6G, e trombo è stato avviato per via topica dopo l'applicazione di un pezzo di carta da filtro con il 12,5% 3 soluzione FeCl per 1 min. La nave è stata osservata in 10 volte più lente a secco.

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Discussion

Il modello di FeCl 3 indotta è uno dei modelli più utilizzati trombosi, che possono non solo fornire preziose informazioni modificazioni genetiche sulla funzione piastrinica e la trombosi 7,8,16,19,31-33, ma può anche essere uno strumento prezioso per la valutazione di composti terapeutici e strategie per il trattamento e la prevenzione delle malattie aterotrombotici 11,17,34-37. Qui abbiamo dimostrato le nostre modifiche e perfezionamenti di questo modello e ha mostrato ulteriori prove dell'utilità di questa tecnica, che è sufficientemente sensibile per determinare gli effetti di anticoagulante (tPA) e farmaci anti-piastrinici (anticorpi PAR4). Oltre allo studio meccanicistica di trombosi, il modello può anche essere utilizzata per studiare nanotecnologie basati, trombi mirati drug delivery. Può anche essere utilizzato per il rilevamento di formazione parete vasale specie reattive dell'ossigeno (ROS) mediante iniezione di fluorescenza indicatore ROS 21.

meticolosotecniche sono necessarie per eseguire tali modelli. L'operatore deve avere competenze chirurgiche sufficienti, nonché una profonda comprensione della biologia delle cellule vascolari e sangue. Numerosi punti chiave del carotidea indotta modello di FeCl 3 arteria trombosi sono 6: (1) esporre sufficiente lunghezza dell'arteria carotidea (~ 5 mm) per consentire l'applicazione della carta da filtro e lasciare uno spazio per osservare il flusso di sangue al microscopio intravitale in fase tardiva ; (2) striscia chiaramente il tessuto molle avventiziale intorno carotide per consentire la carta da filtro per contattare la parete del vaso direttamente e produrre un ancora pregiudizio; (3) confermare alcun danno meccanico alla parete del vaso e nessuna formazione di trombi prima dell'applicazione di FeCl 3 carta da filtro saturi; (4) soggiacciono carotide con un pezzo di "U" plastica nera sagomato per separare l'arteria dal tessuto circostante, per bloccare fluorescenza di fondo, e per prevenire FeCl 3 diffusione. Con queste strategie, abbiamo generato altamentedati riproducibili con la wild-type topi C57BL / 6, e in questo ceppo di topi 7,5% FeCl 3 tempo trombosi indotta è 11.3 ± 3.16 min (n = 14) 6,7,19. La vena giugulare iniezione di rodamina 6G per etichettare le cellule circolanti può essere impegnativo. In alternativa, una iniezione vena della coda può essere eseguita prima di fissare il mouse sul coperchio piatto 15 cm. In confronto al modello carotide, il modello arteria e vena mesenterica è più facile e meno chirurgicamente intensiva. Tuttavia, come menzionato nella sezione Risultato, a causa della copertura dei vasi di tessuto grasso, il modello di trombosi mesenterica è migliore per studiare la trombosi venosa, ma richiede un campione più grande per minimizzare l'errore tra diversi topi.

La limitazione di questo modello è che il meccanismo non è chiaro e ancora controversa. Inizialmente, il meccanismo di questo modello è creduto essere quello di FeCl 3 generato ROS indotta denudation delle cellule endoteliali, e subsequently portato all'esposizione di componenti del sangue al subendothelium protrombotico, per rendere adesione piastrinica, l'aggregazione e la formazione di trombi 6,11. Con ricostituzione delle piastrine pre-trattate con anticorpi GPVI ai topi di trombocitopenia, abbiamo dimostrato che il modello FeCl 3 dipende GPVI piastrine, e bloccando GPVI piastrinica notevolmente inibita FeCl 3 indotta la formazione di trombi 19. Questo risultato è in linea con le precedenti relazioni 38 e suggerisce che il modello di FeCl 3 può essere più propensi a imitare la fisiopatologia della rottura della placca aterosclerotica umana trombosi 6 mediata. Tuttavia, numerosi studi recenti hanno proposto nuovi meccanismi tra cui l'adesione dei globuli rossi alla parete del vaso e effetto fisiochimica di FeCl 3 aggregazione indotta delle proteine ​​plasmatiche e globuli 29,30. Queste nuove intuizioni suggeriscono i potenziali meccanismi di questo modello può essere più complesso.

Con la perfusione di globuli rossi Dil-etichettati nei topi trombocitopenici e quindi indurre FeCl 3 -triggered lesioni alla carotide con il 7,5% FeCl 3, abbiamo scoperto che le principali cellule che aderiscono alle pareti dei vasi feriti sono piastrine (Figura 6 e 5 video online ). Non abbiamo trovato evidente adesione globuli rossi, e l'accumulo di globuli rossi nel trombi sembrava più probabile che sia il risultato di cattura. I nostri risultati corrispondono i concetti di emostasi primaria e secondaria 39. La differenza della nostra osservazione dalle relazioni precedenti può essere da ipossia e il cambiamento emodinamica, come nello studio di Barr e colleghi 30, dove i FeCl 3 arterie carotidi feriti per l'esame microscopia elettronica a scansione sono stati preparati nei topi che avevano il ventricolo sinistro in precedenza esposto, senza assistenza di un ventillation meccanica. la concentrazione di ossigeno nel sangue e l'emodinamica saranno drasticamente diminuita sia come polmonare ela funzione cardiaca sarà influenzato immediatamente dopo il torace è aperto senza ventilazione meccanica. La privazione di ossigeno è stato a lungo associato con l'attivazione del pathway procoagulante e trombosi 40 e può anche migliorare l'adesione RBC. Un'altra pubblicazione recente ha dimostrato che il trattamento della carotide con una concentrazione molto elevata di FeCl 3 (20%) per 5 o 10 min porta ad una concentrazione di stato stazionario di FeCl 3 a ~ 50 mM nel lume del vaso danneggiato 29 . Essi quindi infuse direttamente 50mM FeCl 3 in varie componenti del sangue e hanno esaminato l'effetto di FeCl 3 sull'aggregazione ex vivo, che li ha portati a proporre un nuovo meccanismo, 2 fasi per l'azione di FeCl 3 in formazione di trombi 29. Anche se abbastanza interessante, i risultati di questo studio devono essere interpretati con cautela, in quanto non rappresenta il modello di FeCl 3 comunemente usato. In contrasto con l'elevata concentrazione di FeCl 3 (20%, 1 M come indicato nella carta) e trattamento a lungo (5 o 10 minuti), i nostri studi precedenti nonché Barr et al. hanno dimostrato che il 10% FeCl 3 trattamento per 1 min è sufficiente per indurre una rapida formazione occlusiva trombo nella carotide entro 7 min 6,30. Inoltre, nella maggior parte degli esperimenti utilizzando il modello FeCl 3, un ulteriore bassa concentrazione di FeCl 3 (5 - 7,5%) viene utilizzato.

Un'altra limitazione di questo modello è che a causa della grave danno ossidativo all'endotelio nonché endoteliale denudazione post-FeCl 3 trattamento, questo modello non può essere uno strumento adeguato per studiare l'infiammazione endoteliale trombosi associata. Tuttavia, utilizzando queste tecniche per preparare l'arteria carotidea in combinazione con perfusione di leucociti fluorescente, possiamo testare l'adesione e rotolamento dei leucociti sull'endotelio infiammatoria 41.

in summary, abbiamo affinato e standardizzato il indotta modello di FeCl 3 danno vascolare per produrre una lesione altamente riproducibili sulla carotide e quantificare il flusso di sangue tempo cessazione accuratamente al microscopio intravitale. Questo modello è sufficiente e sensibile per testare l'anticoagulante e antiaggreganti piastrinici, ed è adatto anche per gli studi di nanomedicina trombi mirati. In combinazione con il trapianto di midollo osseo, l'infusione di piastrine nei topi trombocitopenia o iniezione intravascolare diretta dei farmaci candidati, abbiamo dimostrato che questo è uno strumento utile, semplice e sensibile per studiare in vivo la trombosi 7-10,16,19,42,43 .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

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