Développement d'un plus sensible et spécifique chromogénique Agar moyen pour la détection de

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Yeung, M., Thorsen, T. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (117), e54493, doi:10.3791/54493 (2016).

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Abstract

Les infections d'origine alimentaire aux États - Unis causée par les espèces de Vibrio ont montré une tendance à la hausse. Dans le genre Vibrio, V. parahaemolyticus est responsable de la majorité des infections -Associated Vibrio. Ainsi, la différenciation précise entre les Vibrio spp. et la détection de V. parahaemolyticus est d'une importance cruciale pour assurer la sécurité de notre approvisionnement alimentaire. Bien que les techniques moléculaires sont de plus en plus commun, des méthodes de culture-fonction sont toujours systématiquement fait et ils sont considérés comme des méthodes standard dans certaines circonstances. Par conséquent, un nouveau milieu de gélose chromogène a été testé avec le but de fournir une meilleure méthode pour l' isolement et la différenciation des Vibrio spp cliniquement pertinente. Le protocole par rapport à la limite de sensibilité, de spécificité et de détection pour la détection de V. parahaemolyticus entre le nouveau milieu chromogène et un milieu classique. Divers V. souches parahaemolyticus (n = 22) représentant divers sérotypes et source d'origine ont été utilisés. Ils ont déjà été identifiés par la Food and Drug Administration (FDA) et des Centers for Disease Control and Prevention (CDC), et en outre vérifié dans notre laboratoire par tlh -PCR. Au moins quatre essais séparés, ces souches ont été inoculées sur l'agar et du thiosulfate citrate sels biliaires chromogènes-saccharose (TCBS) d'agar-agar, ce qui est le support recommandé pour la culture de cette espèce, suivie d'une incubation à 35-37 ° C pendant 24 -96 h. Trois V. souches parahaemolyticus (13,6%) ne se développent pas de façon optimale sur TCBS, néanmoins exposées colonies vertes s'il y avait une croissance. Deux souches (9,1%) n'a pas donné les colonies cyan attendus sur la gélose chromogène. V. Non- souches parahaemolyticus (n = 32) ont également été testés pour déterminer la spécificité de la gélose chromogénique. Parmi ces souches, 31 ne poussent pas ou présentaient d'autres morphologies de colonies. La récupération moyenne de V. parahaemolyticus sur le chromogenic agar était d'environ 96,4% par rapport à la gélose trypticase soja complémenté avec 2% de NaCl. En conclusion, le nouveau gélose chromogénique est un moyen efficace pour détecter V. parahaemolyticus et pour le différencier des autres vibrions.

Introduction

En tant que membre du genre Vibrio, V. parahaemolyticus est une, courbe, bactérie en forme de bâtonnet à Gram négatif, non sporulé. Il présente une grande mobilité dans les deux milieux liquides et semi-solides. La plupart V. souches parahaemolyticus sont non pathogènes pour l' homme, mais les sous - types pathogènes ont provoqué des épidémies et des pandémies, d' où cette espèce est considérée comme une importante pathogène d'origine alimentaire dans de nombreux pays 1,2. L'incidence de l' infection par Vibrio aux États - Unis a montré une tendance à la hausse depuis 2000 3. Parmi Vibrio spp., V. parahaemolyticus est l'espèce la plus fréquemment rapportés causant des maladies aux États - Unis 4,5. D' autres espèces cliniquement pertinentes comprennent V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Un petit pourcentage des maladies est due à la fois par de multiples espèces.

V. parahaemolyticus est un i naturelnhabitant de l'eau de mer et donc largement distribué dans les eaux marines à travers le monde, y compris les estuaires. L'espèce a été découverte en 1950 suite à une épidémie d'intoxication alimentaire au Japon. Aux Etats - Unis, l'espèce a été isolée d' abord dans l' eau de mer, des sédiments et des mollusques dans la région de Puget Sound 6,7. Filtreurs dans les habitats marins, tels que les mollusques bivalves, peuvent abriter V. parahaemolyticus dans le cadre de leur flore naturelle 8. En tant que tel, V. infections parahaemolyticus chez l' homme sont souvent liés à la consommation de fruits de mer contaminés, en particulier les fruits de mer crus ou pas assez cuits. Un itinéraire moins commun d'entrée se produit lorsque plaie ouverte est exposée à l'eau de mer, ce qui conduit à une infection de la peau. La plupart V. souches parahaemolyticus ne causent pas la maladie humaine, mais certains sous - types hébergeant des facteurs de virulence tels que hémolysine directe thermostable (TDH) sont pathogènes. Les symptômes les plus fréquents de V. d' origine alimentaire infection parahaemolyticus sontla diarrhée et des douleurs abdominales, suivie par des nausées, des vomissements et de la fièvre. Maux de tête et des frissons sont également signalés. La période d'incubation moyenne est de 15 heures, mais peut aller jusqu'à 96 heures après la consommation d' une quantité suffisante de souches pathogènes 9. La maladie dure de deux à trois jours. Les symptômes de gastro - entérite causée par V. parahaemolyticus sont en grande partie auto-limitation et le traitement spécial donc est pas nécessaire. Des cas bénins de la gastro-entérite peuvent être traités efficacement par réhydratation orale. Plus graves maladies peuvent être traitées par des antibiotiques tels que la tetracycline ou la ciprofloxacine 10. Le taux de mortalité est d'environ 2% pour les cas de gastro-entérite, mais peut être aussi élevé que 29% pour ceux qui développent une infection sanguine ou une septicémie. Toute personne qui consomme des fruits de mer ou a une plaie ouverte exposée à l' eau de mer est à risque de V. infection parahaemolyticus. La forme la plus grave des maladies, la septicémie mortelle, est plus fréquente chez une sous-population avec co médicale sous-jacentenditions 11, qui comprennent l' alcoolisme, une maladie hépatique, le diabète, une maladie rénale, une affection maligne, et d' autres conditions conduisant à une réponse immunitaire affaibli. Notamment, ce groupe de personnes est également à un risque plus élevé de contracter des maladies graves causées par V. vulnificus, qui peut être trouvé dans les habitats naturels similaires à V. parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus est régulièrement isolé en utilisant des sels-saccharose thiosulfate-citrate-biliaires (TCBS) agar comme milieu sélectif et différentiel. Enrichissement en eau peptonée alcaline peut précéder l'isolement sur gélose TCBS. Les colonies sur TCBS sont ensuite testés dans une gamme de tests biochimiques et / ou des tests moléculaires ciblant la présence de gènes spécifiques à l'espèce. Les méthodes basées sur la PCR sont souvent utilisés pour confirmer l'identité de V. parahaemolyticus en amplifiant le gène hémolysine thermolabile, tlh 12.

Quelle que soit la choix des méthodes de confirmation, il est important de disposer d' un moyen efficace pour isoler et de différencier V. parahaemolyticus d'autres vibrions marins en premier lieu. TCBS a régulièrement été utilisé pour différencier les espèces dans le genre Vibrio selon leurs capacités à fermenter le saccharose 12. Réaction de fermentation positive est accompagnée par un changement de couleur de l'indicateur de pH bleu de bromothymol. V. colonies parahaemolyticus sont assez distinctif sur TCBS, présentant le bleu à la couleur verte. Cependant, ce moyen ne peut pas différencier facilement V. alginolyticus et V. cholerae. Proteus sucrose-fermentation peuvent produire des colonies jaunes ressemblant à V. cholerae ou V. 13 alginolyticus. Sur l' isolement initial sur TCBS, V. parahaemolyticus peut également être mal identifié comme Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides et Pseudomonas spp 14. Les souches avec un retard ferm saccharoseentation peut être confondue avec d' autres saccharose fermentant Vibrio 13, qui comprennent V. parahaemolyticus. TCBS a été jugée non sensible contre Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, entre autres. Plusieurs autres espèces donnent vert à des colonies grises qui sont potentiellement confondus avec V. parahaemolyticus ou V. vulnificus 15. Par conséquent, il est souhaitable de développer des milieux de culture alternative avec une meilleure sensibilité et une spécificité envers la détection et l' isolement de V. parahaemolyticus et d' autres espèces étroitement apparentées.

Plusieurs alternatives des médias ont été récemment mis au point. En plus de l'incorporation d'agents sélectifs, la plupart incorporent des substrats chromogènes pour différencier les espèces en fonction de leurs activités enzymatiques différentielles. Par exemple, l' indoxyl-β-glucoside et le β-indoxyl galactoside ont été utilisés comme substrats chromogènes pour différencier V. paracolonies de haemolyticus (qui apparaissent bleu-vert) à partir de ceux de V. cholerae (violet) en raison de leurs capacités différentielles pour produire β-glucosidase et β-galactosidase 16. Différentes formulations de gélose chromogène développées par plusieurs groupes ont été évalués et ont été signalés à effectuer comparable ou supérieure à TCBS 17,18,19. Un avantage d'utiliser un milieu chromogène est que la coloration du milieu environnant est minime, ce qui facilite l'isolement de colonies particulières. Dans cette étude, nous avons évalué la capacité d'un milieu chromogénique nouvellement formulé pour détecter et isoler V. cholerae, V. parahaemolyticus, et V. vulnificus; avec un accent particulier sur sa capacité à différencier V. parahaemolyticus provenant d' autres espèces.

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Protocol

1. Médias et culture des souches microbiennes

NOTE: Utiliser des techniques aseptiques dans toutes les expériences. Utiliser des matériaux stériles. Stériliser tous les conteneurs, les outils et réactifs avant utilisation. Autoclave tous les déchets avant leur élimination, car ils sont considérés comme un risque biologique. la température et le temps Autoclave combinaison est ≥121 ° C x ≥15 min pour toutes les procédures suivantes.

  1. Pour faire ~ 1-L de gélose trypticase soja (TSA), ajouter d'abord 1 L d'eau déminéralisée dans un 2-L Erlenmeyer contenant un barreau d'agitation magnétique. Utiliser un flacon qui est au moins deux fois plus grand que le volume final. Ajouter 30 g de poudre de bouillon trypsique de soja et 20 g d'agar granulés dans le ballon.
    REMARQUE: Utiliser 2% de gélose au lieu de 1,5% pour limiter l' essaimage de certains Vibrio spp.
    1. Bien mélanger en tournant sur l'agitateur. Tout en agitant, allumer la chaleur pour faire bouillir le mélange. Retirer le ballon de l'appareil de chauffage dès que le mélange commence à bouillir. Couvrir légèrement the flacon avec une feuille d'étain. Collez la feuille pour le fixer dans le ballon avant de l'autoclave.
    2. Pour faire du bouillon de soja tryptique (TSB), omettre l'agar de la recette à l'étape 1.1.
      NOTE: Peut utiliser des bouteilles au lieu de Erlenmeyer de.
    3. Pour faire de la gélose trypticase soja complémenté avec du chlorure de sodium à 2% et du NaCl (TSAS), ajouter 20 g de NaCl dans le mélange avant l'agitation et le chauffage. Pour rendre le bouillon trypticase soja complémenté avec 2% de NaCl (TSBS), omettre la gélose, ajouter 20 g de NaCl dans le mélange avant l'agitation et le chauffage.
  2. Pour perfusion cardiaque du cerveau (BHI) agar, suspendre 37 g de poudre BHI et 15 g granulés de gélose dans 1 litre d'eau purifiée. Chauffer en agitant fréquemment pour dissoudre la poudre. Autoclave. Omettre la gélose à faire du bouillon BHI.
  3. Pour rendre la gélose TCBS, suspendre 89 g de la poudre TCBS dans 1 litre d'eau purifiée. Chauffer en agitant fréquemment et faire bouillir pendant 1 min pour dissoudre complètement la poudre. Ne pas autoclaver.
  4. Pour tous les médias agar, refroidir l'agar chaud pour 45-50 ° C dans un bain d'eau. Disposez vides boîtes de Petri dans des piles de cinq à six plaques. En partant du bas de la pile, verser la gélose fondue dans chaque boîte de Petri pour atteindre environ la moitié. Fermer le couvercle de boîte de Pétri après la coulée. Laisser la gélose se solidifier en laissant les plaques sont assis à la température ambiante.
    1. Utilisez les plaques d'agar le lendemain ou après 12 h. Stocker les plaques inutilisées dans un réfrigérateur jusqu'à deux semaines. Avant utilisation, enlever les plaques du réfrigérateur et équilibrer les à température ambiante pendant au moins 15 min.
      REMARQUE: Un litre d'agar fait ~ 45 plaques de gélose. Laisser les plaques de gélose à sécher suffisamment le jour de leur préparation, et leur équilibrent à la température ambiante après un stockage à froid pour réduire efficacement la propagation des colonies.
  5. Obtenir des plaques de gélose chocolat et chromogénique et équilibrer les à température ambiante avant chaque expérience.
  6. Repiquer les 54 souches microbiennes indiquées dans le tableau 1 tout petit nombre days.
    1. Utilisez une boucle d'inoculation stérile pour transférer les cultures à partir d'un stock congelé ou un lot précédent aux médias non sélectifs tels que BHI, TSB / TSA ou gélose chocolat. Cultivez halophile Vibrio spp. sur TSBS / TSAS.
    2. Pour vérifier la pureté de la culture, strie toutes les souches dans un modèle qui permettrait l'observation des colonies isolées. Par exemple, utiliser un motif de stries en trois phases pour diluer une grande quantité de bactéries plus petite quantité, donnant finalement des colonies isolées.
  7. Incuber les plaques à l'envers à 35-37 ° C pendant jusqu'à 48 heures. Pour Campylobacter spp., Incuber des tubes ou des plaques dans un bocal couvercle fermé contenant une poche de gaz pour produire un environnement microaérophile. Observez la morphologie des colonies après incubation. Les cultures pures devraient produire des colonies qui présentent une colonie semblable morphologie.
    REMARQUE: Incuber les plaques à l'envers pour empêcher des gouttelettes d'eau condensée formée sur la face inférieure du couvercle de tomber sur le colOnies.

2. Espèces Détermination par PCR

  1. Mener tlh -PCR pour confirmer l'identité de V. souches parahaemolyticus. Utilisez amorces Tlh -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') et tlh -R (5 'GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') pour amplifier un fragment de 450 pb du gène thermolabile hémolysine 20 .
    1. Utilisez une boucle d'inoculation stérile pour transférer quelques colonies isolées de chaque V. souche parahaemolyticus de TSAS à 5 ml de TSBS. On incube à 35-37 ° C pendant 16-24 h.
    2. cultures Centrifugeuse à 14.000 xg pendant 1 min. Retirer le surnageant et on lave le culot deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS). Faire bouillir la suspension pendant 3 min pour obtenir un lysat cellulaire.
      NOTE: V. parahaemolyticus est facile d'être lysées. Par conséquent, le réactif de lyse est pas nécessaire. Il est également possible d'utiliser un peu de colonies directement comme matrice.
    3. Faire la PCR dans une réaction de 25 ul volume. Préparer un mélange réactionnel contenant une concentration finale de 1 x tampon PCR, MgCl2 1,5 mM, 100 uM de chaque dNTP, 1 pM de chaque amorce, 1 U de Taq polymérase et 1 pi de lysat cellulaire. Après une pré - incubation à 94 ° C pendant 5 min, course de 35 cycles d'amplification à 94 ° C pendant 30 secondes, 58 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 60 s 21.
    4. aliquotes de charge de amplicon 5 pi à 1,5% de gels d'agarose. Allumez l'alimentation pour démarrer l'électrophorèse. Visualiser la présence ou l'absence d'amplicons sous illumination UV après coloration au bromure d'éthidium.

3. Croissance sur sélectif et différentiel des médias

  1. Deux à quatre jours avant l'expérience, strie toutes les souches microbiennes indiquées dans le tableau 1 sur un milieu non sélectif (TSAS, BHI ou gélose chocolat) pour l' isolement de la colonie. Incuber les plaques à 35-37 ° C pendant 48 heures. Vérifiez la pureté des cultures en observant la morphologie des colonies après incubation. Les cultures pures devraient produire des colonies qui présentent une colonie semblable morphologie.
  2. Transfert quelques colonies isolées de l'étape 3.1 dans 5 ml de bouillon. Incuber les tubes à 35-37 ° C pendant 16-24 h.
    NOTE: Utiliser les jeunes colonies, qui sont âgés de moins de quatre jours, pour préparer cultures d'une nuit dans toutes les expériences.
  3. Streak une anse de cultures d'une nuit sur les médias sélectif et différentiel (TCBS et gélose chromogénique) pour l'isolement de la colonie. Incuber les plaques à 35-37 ° C pendant jusqu'à 96 heures.
  4. Notez la croissance globale de toutes les souches en examinant à la fois la densité de la culture sur la plaque et la taille des colonies isolées. Notez la couleur des colonies sous la lumière ambiante et / ou UV. Notez d'autres caractéristiques de colonie isolée tels que l'élévation, la marge et la forme.

4. Essai de récupération

  1. Sélectionnez un sous - ensemble représentatif de V. souches parahaemolyticus (n = 14) qui englobent les différents sérotypes d'isolement et d' origines
  2. Procéder à une méthode de comptage sur plaque standard des cultures d'une nuit comme décrit ci-dessous.
    1. Vortex à bien mélanger les cultures d'une nuit. Faire un facteur 10 ou 10 -1 dilution en transférant 100 pl de la culture pendant une nuit dans un tube contenant 900 ul de PBS. Vortex pour bien mélanger.
    2. Utiliser un nouvel embout de pipette pour transférer 100 ul du tube 10 -1 de dilution dans un autre tube contenant 900 ul de PBS. Vortex pour bien mélanger. Ceci constitue 10 -2 dilution. Répétez la séquence de processus pour obtenir 10 -7 dilution.
    3. En utilisant les 10 -4 à 10 -7 tubes de dilution, la plaque 100 ul chacun sur les, des TCB et TSAS plaques d' agar chromogènes.
      NOTE: Le facteur de dilution (DF) sur la plaque devient 10 -5 à 10 -8, respectivement.
    4. Répartir les aliquotes uniformément sur til Agar surface.
      NOTE: Il est bon d'utiliser la même épandeur par souche sur le même milieu, aussi longtemps que la partie aliquote plus diluée est répartie en premier (ie, de 10 -8 à 10 -5). Ne pas utiliser le même épandeur pour différents médias.
    5. Incuber les plaques à 35-37 ° C pendant jusqu'à 96 heures. Compter les colonies sur les plaques. Ignorer les plaques portant les colonies qui sont trop nombreuses pour être comptées (incomptable) ou inférieur à 25. Calculer CFU / ml selon les critères suivants:
      L'équation 1

      N = le nombre de cellules dans le tube non dilué, exprimé en UFC / ml ou UFC / g
      C = le nombre total de colonies comptées sur des plaques qui portent 25-300 colonies
      n 1 = le nombre de plaque (s) où les colonies sont comptées à partir de la df inférieure
      n 2 = le nombre de plaque (s) où les colonies sont comptées à partir de la dilution de 10 fois ultérieur
      f = le facteur de dilution plus faible ( par exemple, une dilution plus concentrée)
  3. Comparer UFC / ml entre les différents médias. Utilisez UFC / ml sur TSAS 100%, calculer la récupération% de V. parahaemolyticus cultivé sur la gélose chromogène et TCBS.

5. Concurrence Assay

  1. Choisissez un sous-ensemble des souches qui présentent des morphologies différentes de colonies sur la gélose chromogène et TCBS.
    NOTE: De cette façon, il sera possible de compter les colonies provenaient de V. parahaemolyticus que, malgré la présence d'autres espèces dans l'inoculum.
    1. Choisissez un V. souche parahaemolyticus qui donne les turquoises et cyan colonies attendues sur TCBS et la gélose chromogène, respectivement.
    2. Choisissez un V. non parahaemolyticus et un non - espèces de Vibrio qui ne poussent pas sur l' un de ces supports, ou présentent une couleur différente de la colonie.
      NOTE: Par exemple, V. metschnikovii croît très faiblement on TCBS et n'a pas grandi sur la gélose chromogène. Shigella sonnei ne pousse pas sur TCBS mais donne des colonies magenta sur la gélose chromogène.
  2. Après sélection des souches ci-dessus, de préparer des bouillons de culture d'une nuit en utilisant des colonies isolées cultivées sur des milieux non sélectifs.
    1. Faire cultures d'une nuit de V. parahaemolyticus et V. metschnikovii en transférant quelques colonies isolées à partir TSAS à 5 ml de TSBS. On incube à 35-37 ° C pendant 16-24 h.
    2. Faire cultures d'une nuit de Shigella sonnei en transférant quelques colonies isolées de gélose BHI à 5 ml de bouillon BHI. On incube à 35-37 ° C pendant 16-24 h.
  3. Pour chaque souche, effectuer une série de dilution similaire aux étapes 4.2.1 et 4.2.2. Plaque des dilutions appropriées sur TSAS ou BHI pour déterminer UFC / ml de la culture pendant une nuit, en utilisant l'équation illustrée à l'étape 4.2.5.
    NOTE: En règle générale, 100 ul de la 10 -5 à 10 -7 dilutiontubes fonctionne pour la plupart des cultures. Utilisez les valeurs / ml UFC à dos calculer le montant exact des cellules utilisées dans l'étape suivante. Les valeurs UFC / ml calculées sont obtenues après incubation, bien que les étapes suivantes sont exécutées à la même date que dans l'étape 5.3.
  4. En utilisant les cultures de la nuit et les tubes de dilution dans les étapes 5.2 et 5.3, mélanger différentes quantités d'un V. souche parahaemolyticus et V. non espèces parahaemolyticus. Par exemple, mélanger 500 pi du tube 10 -5 dilution de V. parahaemolyticus avec 500 pi des cultures d'une nuit de V. metschnikovii.
    NOTE: Ce mélange simule un bruit de fond de la microflore. Pour simuler un faible bruit de fond de la microflore, mélanger 500 pi de chacun des tubes 10 -5 dilution de ces deux espèces.
  5. Étaler 100 pi du mélange chacun des, des TCB et TSAS plaques d'agar chromogènes.
  6. Après incubation à 35-37 ° C pendant jusqu'à 96 heures, compter les colonies de V. parahaemolyticus et non V. espèces parahaemolyticus en fonction de leur différence dans la croissance et la morphologie des colonies sur la gélose chromogène et TCBS.
    NOTE: Par exemple, si le V. non espèces parahaemolyticus ne poussent pas sur la gélose chromogène et TCBS, toutes les colonies seront de V. parahaemolyticus. V. Si la non - espèces parahaemolyticus pousse sur les médias, que les colonies de turquoise sur TCBS et cyan colonies sur gélose chromogène seront de V. parahaemolyticus. V. non espèces parahaemolyticus peuvent ou non présenter une colonie semblable à la morphologie V. parahaemolyticus sur TSAS.
    1. V. Si la non - les espèces parahaemolyticus croît de manière similaire à V. parahaemolyticus sur ce milieu non sélectif, diviser le nombre de colonies par deux pour obtenir des numéros pour V. parahaemolyticus seulement. Comparez le nombre de colonies réelle avec le nombre attendu dérivé de l'étape 5.3.

6. Effète de Oyster homogénats

  1. Peser ≥50 g huîtres viande de ≥12 mollusques, y compris la viande et l'alcool.
    1. Ajouter quantité égale de PBS à la viande d'huître et de la liqueur. Mélanger le mélange à grande vitesse pendant 90 secondes. Ceci constitue 2 -1 dilué homogénat d'huîtres.
    2. Ajouter 100 g de 2 -1 dilué homogénat d'huîtres à 400 g de PBS. Utilisez une échelle pour mesurer le poids, pas de volume. Mélanger le mélange à grande vitesse pendant 1 min. Autoclave le broyat d'huîtres.
      NOTE: Ce sera le broyat d'huîtres utilisé pour dopage.
  2. Répétez le test de récupération (étape 4) en présence d'huîtres homogénat.
    1. Après les 500 g huîtres homogénat refroidit, ajouter 100 pi de V. parahaemolyticus cultures d'une nuit cultivées dans TSBS à elle. Déterminer le montant réel de V. cellules parahaemolyticus dans l'inoculum en effectuant les procédures de comptage des plaques standard décrites à l' étape 4.2.
  3. Représentantmanger le dosage de la concurrence (étape 5) en présence d'huîtres homogénat.
    1. Après les 500 g huîtres homogénat refroidit, ajouter 100 ul chacune des cultures d'une nuit de V. parahaemolyticus et V. non parahaemolyticus à elle. Déterminer la quantité réelle de bactéries cellules dans l'inoculum en effectuant les procédures de comptage des plaques standard décrit dans l'étape 4.2
  4. Mélanger les cellules bactériennes avec des huîtres homogénat bien à l'aide d'un homogénéisateur.
    NOTE: Après le mélange, le broyat d'huîtres contenant les cellules ajoutées intentionnellement est appelé à pointes huîtres homogénat.
  5. Faire des dilutions de l'huître homogénat à pointes pour obtenir 10 -1 à 10 -3 tubes de dilution selon les procédures décrites à l' étape 4.2.2. Étaler 100 pi de chaque dilution sur le, TCBS et TSAS agar chromogène. Incuber les plaques à 35-37 ° C pendant jusqu'à 96 heures.
  6. Comparez le nombre de colonies réelle sur gélose chromogène et TCBS avec l'exinatten- comptage des colonies déduit étapes 6.2.1 et 6.3.1.
    NOTE: Par exemple, si un tube de V. culture d'une nuit parahaemolyticus contient 10 8 CFU / ml, un inoculum de 100 ul signifie que 10 7 cellules sont ajoutés à 500 g d'homogénat huître, ce qui donne 5 x 10 4 cellules / g. Après dilution et le placage, la plaque ayant df = 10 -2 devrait donner 500 colonies; tandis que d' avoir df = 10 -3 devrait produire 50 colonies. Ce sont les comptes de colonies attendues.

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Representative Results

Dans cette étude, 54 souches microbiennes ont été assemblés, qui comprenait 22 souches dans le V. espèces parahaemolyticus, 19 autres espèces de Vibrio et 13 espèces de Vibrio non (tableau 1). La plupart V. souches parahaemolyticus ont été soit reçu de la FDA, le CDC ou d' autres services de santé de l' Etat. Ils représentent divers sérotypes et sources d'isolement. Ces souches ont été identifiées précédemment par les organismes de réglementation. Nous avons en outre confirmé l'identité de ces V. parahaemolyticus en menant une tlh -PCR 21,22.

Espèce Nombre de souches testées La croissance et la couleur des colonies
TCBS Cmoyen hromogenic
Aeromonas hydrophila 2 Pas de croissance 1 souche aucune croissance;
1 souche couleur magenta
candida albicans 1 Faible croissance, jaune Pas de croissance
campylobacter jejuni 1 Pas de croissance Pas de croissance
Escherichia coli 1 Pas de croissance Faible croissance, magenta
Proteus mirabilis 1 Pas de croissance Pas de croissance
Pseudomonas aeruginosa 2 Turquoise Jaune
Staphylococcus aureus 1 Faible croissance, jaune Pas de croissance
Salmonella choleraesuest 1 Pas de croissance Pas de croissance
Shigella boydii 1 Pas de croissance Pas de croissance
shigella flexneri 1 Pas de croissance Pas de croissance
Shigella sonnei 1 Pas de croissance Faible croissance, magenta
Vibrio alginolyticus 3 Jaune ou turquoise Jaune
V. cholerae 4 Jaune ou turquoise Magenta
V. damsela 1 Turquoise Cobalt
V. fisheri 1 Faible croissance, jaune Pas de croissance
V. fluvialis 1 Turquoise Cobalt
V.furnissii 1 Jaune Jaune
V. hollisae 1 Turquoise Jaune
V. metschnikovii 1 Pas de croissance Pas de croissance
V. mimicus 1 Turquoise Magenta
V. parahaemolyticus 22 La plupart des souches turquoise La plupart des souches cyan; quelques-uns clair
V. proteolyticus 1 Turquoise Cobalt
V. vulnificus 4 Turquoise ou clair Magenta

Tableau 1. espèces microbiennes utilisées dans cette étude et leurs caractéristiques de croissance sur le milieu sélectif et différentiel. Appel de couleur était based sur une roue de couleur. Cyan est similaire à sarcelle; magenta est similaire à la lavande rose, turquoise est similaire au vert, jaune englobe olive et marron.

Quatre essais séparés ont été effectués pour déterminer la croissance et la morphologie des colonies de ces souches sur le support sélectif et différentiel - TCBS et la gélose chromogène. TCBS est le moyen classique utilisé pour l'isolement de certaines espèces de Vibrio, y compris V. cholerae et V. parahaemolyticus 12. La variation de couleur des colonies cultivées sur TCBS était jaune, turquoise (vert) ou clair (Figure 1).

Figure 1
Figure 1. La morphologie des colonies de Vibrio spp. sur TCBS agar. V. parahaemolyticus (turquoise), V. cholerae (jaune), et am l' inoculation ixe des deux espèces (a). Colonies de V. parahaemolyticus semble turquoise, avec une circulaire, entier, et la morphologie convexe (b). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La capacité d'un nouveau milieu chromogène pour sélectionner des espèces Vibrio cliniquement pertinentes des échantillons alimentaires et environnementaux a été testé. En outre, la capacité de ce moyen à la fois de distinguer ces espèces de l'autre a été évaluée. Couleur de colonie observée sur la gélose chromogène étaient cobalt, cyan, magenta, jaune ou clair (Figure 2). Comme on le voit dans le tableau 1, à la fois , et la gélose TCBS chromogènes présentent un certain degré de sélectivité contre les microorganismes non Vibrio.

1 "> Figure 2
Figure 2. La morphologie des colonies de Vibrio spp. sur la gélose chromogène nouvellement développé. V. parahaemolyticus (cyan), V. cholerae (magenta) et une inoculation mixtes des deux espèces (a). Colonies de V. parahaemolyticus semble cyan, avec une circulaire, entier, et la morphologie convexe (b). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Conformément à la méthode de comptage sur plaque standard sur les cultures durant la nuit, les colonies de V. parahaemolyticus ont été observées sur les plaques d' agar chromogènes recevant le facteur le plus élevé de dilution (ie, df = 10 -8). Ces résultats sont comparables à celles d'un milieu non sélectif (TSAS). Ceci suggère que la limite de détection du milieu chromogénique est similaire à un milieu non sélectif, qui est d'environ 10 cellules ou moins en l'absence de matrice alimentaire. La capacité de détection pour d' autres espèces de Vibrio telles que V. alginolyticus, V. fluvialis et V. damoiselle était aussi correct par rapport au milieu non sélectif. Cependant, certaines souches de V. cholerae, V. vulnificus et V. mimicus a abouti à 10 à 100 fois moins CFU sur la gélose chromogène. Les agents sélectifs utilisés dans les milieux sélectifs chromogènes ou autres inhibent inévitablement certaines cellules. cellules blessées, par exemple, pourraient ne pas récupérer dans des milieux sélectifs. Néanmoins, la capacité de détection légèrement moins est un non-problème dans la plupart des procédures de routine qui emploient une étape d'enrichissement. Une petite quantité de micro-organismes dans les aliments ou de l'échantillon de l'environnement multiplierait à un niveau élevé dans le bouillon d'enrichissement, dépassant la limite de détection. Enrichissement en eau peptonée alcaline est often fait pour déterminer la prévalence des espèces de Vibrio dans les échantillons environnementaux 12.

En présence d'homogénat huître, la gélose chromogène a continué d'afficher un bon degré de récupération. En d' autres termes, une forte proportion (> 70%) de V. les cellules parahaemolyticus sont capables de croître sur la gélose chromogénique, non affecté par la présence de la matrice d'huître (figure 3a). La croissance et la reprise de V. cellules parahaemolyticus a également été pas affectée par la présence d' une autre espèce Vibrio (Figure 3b). Ceci est un attribut important parce que les échantillons environnementaux sont liés à contenir différentes espèces de Vibrio, qui sont au nombre élevé surtout après une procédure d'enrichissement.

Figure 3
La figure 3. Le pourcentage de récupération d'un V. souche parahaemolyticus dans les huîtres homogénat avec et sans un concurrent bactérien. Recovery (moyenne ± écart-type) a été calculée en fonction de l'observé vs le CFU attendu compter sur les plaques d'agar. le nombre de CFU attendu est calculé en fonction de la charge bactérienne dans l'inoculum. Haute récupération d'un V. souche parahaemolyticus a été observée sur tous les médias sans concours (a). Niveau similaire de récupération a été observée lorsque les niveaux élevés de V. cellules metschnikovii était présent (b). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour comparer davantage la gélose chromogène et TCBS, la sensibilité et la spécificité ont été calculées. Le tableau 2 montre la capacité de ces médias à ACCUrément identifier V. parahaemolyticus. La sensibilité est liée au pourcentage de vrais positifs, ce qui signifie V. souches parahaemolyticus ont donné la morphologie des colonies attendu sur les médias. La spécificité est liée au pourcentage de vrais négatifs, ce qui signifie non V. souches parahaemolyticus doivent présenter pauvres à aucune croissance, ou une morphologie de colonie différente de V. parahaemolyticus. La sensibilité et la spécificité pour TCBS d'identifier V. parahaemolyticus était de 86,4% et 71,8%, respectivement. A titre de comparaison, la sensibilité et la spécificité du milieu chromogénique étaient de 90,9% et 96,9%, respectivement.

une)
agar TCBS V. parahaemolyticus Non-V. parahaemolyticus
Bonne croissance et turquoise colonies 19 9
colonies pauvres de croissance ou de non-turquoise 3 23
b)
agar chromogénique V. parahaemolyticus Non-V. parahaemolyticus
colonies de bonne croissance et cyan 20 1
colonies pauvres de croissance ou de non-cyan 2 31

Tableau 2. Sensibilité et spécificité des TCBS (a) et chromogène (b) de l' agar pour la détection de V. parahaemolyticus. Les identités de V. parahaemolyticus ont été déterminées précédemment par des tests biochimiques et PCR tlh-.

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Discussion

Cette étude se concentre sur le développement et l'évaluation des milieux de culture. Classiquement, TCBS est sélectif et différentiel moyen utilisé pour isoler et détecter V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus 12. Cependant, les limites ont été rapportées pour ce milieu, comme l'incapacité de différencier V. cholerae d'autres espèces de Vibrio. Le saccharose et un indicateur de pH sont les agents de différenciation de TCB. Ainsi, la production d'acide par fermenteur sucrose provoque un changement de couleur du milieu. La coloration du milieu est un inconvénient de TCBS, car il peut masquer l'observation de la morphologie des colonies. Le milieu chromogène nouvellement développé utilise un pH élevé et la salinité pour supprimer la croissance des espèces non Vibrio trouvés dans de nombreux échantillons marins. Le nouveau milieu chromogène a un pH final de 8,6 ± 0,2. Par litre d'eau déminéralisée, elle est constituée de 10 g de peptone, 10 g de sel de mer mélange, 10 g de bile de bœuf, 10 g de sodiumthiosulfates, 5 g d'extrait de levure, 5 g de citrate de sodium, 2,2 g de carbonate de sodium, 2 g de lactose, 0,5 g de pyruvate de sodium, 0,3 g d'un mélange chromogène et 15 g d'agar-agar. Le mélange chromogène permet la différenciation entre les Vibrio spp. selon leurs capacités différentielles pour produire certaines enzymes. Au lieu de modifier la couleur du milieu de gélose TCBS différent Vibrio spp. présenterait une couleur différente de la colonie sur le nouveau milieu chromogène. En comparaison, un milieu chromogène disponible dans le commerce contenant 15 g d'agar-agar, 8 g de peptone et d'extrait de levure, 51,4 g de sel, 0,3 g d'un mélange chromogène et un pH final de 9,0 ± 0,2.

La robustesse d'une évaluation de dosage dépend de la taille de l'échantillon. Depuis cette étude met l' accent sur l'efficacité du nouveau milieu chromogène pour isoler et détecter V. parahaemolyticus, il est important d'accumuler un grand nombre varié V. souches parahaemolyticus. Des études antérieures comparant TCBS etnouveaux milieux de culture souvent impliqué des échantillons environnementaux ou alimentaires contenant des types inconnus et quantité de microorganismes 23,24,25,26. colonies multiples par échantillon ont été isolées mais la nature clonale des isolats était souvent indéterminée. Idéalement, les différentes souches devraient être testées dans le développement de tests par ailleurs la précision du dosage sera gonflé. L' identité de la souche peut être établie par des procédés de sous - typage classiques tels que le gel de l' électrophorèse en champ pulsé (ECP) ou par séquençage multilocus. V. souches parahaemolyticus dans cette étude ont déjà été caractérisées par ribotypage et ECP 19.

Au cours du développement de l'essai, la sensibilité, la spécificité et la limite de détection sont parmi les facteurs clés à l'enquête. Sensibilité, aussi connu comme la précision ou la sensibilité diagnostique, est l'accord de pour cent positive entre les méthodes de référence et de test. Spécificité, aussi connu comme la précision ou la spécificité du diagnostic, est le négatif d'un pour cent Gréement entre les méthodes de référence et de test. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode basée sur la PCR comme méthode de référence parce que les résultats ont été vérifiés parmi les différents groupes. TCBS et les milieux chromogéniques étaient les méthodes d'essai. Pour déterminer la sensibilité, les résultats du V. souches parahaemolyticus ont été utilisés, à savoir, la sensibilité = 100% x Vrai positif / (Vrai positif + faux négatifs). D'autre part, résulte de la non V. souches parahaemolyticus ont été utilisés pour déterminer la spécificité; et donc, Spécificité = 100% x Vrai Négatif / (True Négatif + Faux positif). Pour fournir des résultats de spécificité plus fiables, V. non souches parahaemolyticus doivent être isolés à partir d' un environnement dans lequel l' échantillonnage est effectué. Nos sensibilité et de spécificité calculs sont basés sur des documents écrits par le gouvernement 27, les universités 28 et 29 organisation scientifique sur un sujet lié au développement de tests et de validation.

nt "> Sur la base de nos résultats, le milieu chromogène a montré de meilleures performances que TCBS dans l'identification de V. parahaemolyticus. L'accord global de pour cent entre la méthode de référence et milieu chromogène est de 94,4%, comparativement à 77,8% entre la méthode de référence et TCBS. la sensibilité et la spécificité du milieu chromogénique sont 90,9% et 96,9% , respectivement, qui sont supérieures à celles de TCBS (86,4% et 71,9%, respectivement). des études antérieures évaluer d' autres milieux chromogènes pour la détection de V. parahaemolyticus a constaté que la sensibilité variait 85-88% , tandis que les spécificités variaient de 94 à 95% 23,24,25. Cependant, ces études ne pas utiliser la même méthode de calcul que notre étude. en outre, ils ont parfois utilisé une méthode de référence différente ou ils ont combiné les résultats de deux biochimique les analyses et milieu chromogénique comme une méthode d'essai. par conséquent, il est difficile de comparer directement les résultats de ces études antérieures.

V. parahaemolyticus, la gélose chromogène utilisée dans cette étude pourrait également différencier plusieurs espèces Vibrio que TCBS en raison de l'inclusion d'un mélange chromogène dans la formule moyenne, ce qui donne des couleurs multiples. Bien qu'il n'a pas été l'objet de cette étude pour détecter V. cholerae et V. vulnificus, il est intéressant de noter que les colonies magenta présentées par ces espèces peuvent être en outre différenciés par fluorescence sous UV. Une limitation à l' utilisation de la gélose chromogénique pour la détection de V. cholerae et V. vulnificus est sa faible récupération apparente pour ces espèces. Pour contourner ce problème, une étape d'enrichissement doit être inclus. Une autre limitation possible de la gélose chromogène est sa durée de vie plus courte que TCBS. l'optimisation continue de ce nouveau média est nécessaire pour maintenir le pH au cours du stockage.

Malgré la popularité des techniques moléculaires, Les méthodes de culture, en fonction sont toujours précieux car ils sont souvent moins coûteux et ont une meilleure limite de détection. Ces méthodes peuvent être utilisées en culture comme outil de criblage. A l'inverse, ils peuvent être utilisés pour confirmer l'identité et la viabilité des micro-organismes suivants analyses moléculaires. Pour énumérer les bactéries grâce à une approche de la culture en fonction, Standard Plate Count est reconnu comme la méthode standard. L'équation représentée à l'étape 4.2.5 est un moyen plus précis pour déterminer UFC / g ou cfu / ml de la moyenne CFU de différents facteurs de dilution. Il est important de noter que tous les diluants et les supports à travers les procédures doivent contenir suffisamment de sel pour maintenir la viabilité des bactéries halophiles comme V. parahaemolyticus. La température d'incubation et de l'environnement doivent être optimales pour la croissance bactérienne.

Le milieu chromogénique est conçu pour détecter Vibrio qui sont des agents pathogènes humains importants. Par conséquent, d'autres études doivent être menées pour détermine son efficacité pour détecter d' autres espèces environnementales Vibrio qui ne sont pas médicalement pertinents. Dans les applications futures, la nouvelle gélose chromogène peut être incorporé dans les tests de routine des échantillons environnementaux pour V. parahaemolyticus. Ceci peut être réalisé en ensemençant directe d'échantillons sur la gélose chromogénique afin de détecter la présence de V. présumée parahaemolyticus. La gélose chromogénique peut également être utilisé pour énumérer V. parahaemolyticus suivante dilutions. La quantification peut également être estimée en effectuant une méthode du nombre le plus probable en utilisant un bouillon d'enrichissement, suivie d'une strie sur la gélose chromogénique pour la confirmation.

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Acknowledgments

Nous remercions M. Channey, E. Chau, et K. Tomas pour leur aide sur le projet. fournitures de projets ont été financés en partie par California Polytechnic State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Equipment
Agar Fisher Scientific DF0140-15-4 may use other brands
Autoclave Any
BHI powder Fisher Scientific DF0418-17-7 may use other brands
Blender Any to blend oyster meat
CampyGen gas generator Hardy Diagnostics CN035A to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands
Chocolate agar plates Hardy Diagnostics E14 may use other brands
Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) Any or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)
Culture tubes Fisher Scientific S50712 may use other brands
Eppendorf tubes Fisher Scientific S348903 may use other brands
Gel doc Any
HardyChrom Vibrio agar plates Hardy Diagnostics G319 This study evaluates this medium
Incubator Any
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-606 10 microliter-size was used in this study
NaCl Fisher Scientific BP358-212 may use other brands
Oysters Any
PBS Fisher Scientific R23701 may use other brands
Petri dish Fisher Scientific FB0875713 may use other brands
Pipette and tips Any Sterilized tips
Primers for tlh IDT DNA
Scale Any
Spreader Fisher Scientific 08-100-11 Beads may be used instead
Stomacher blender Stomacher 400 Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.  Other homogenizer can be used.
Sterile filter bags for blenders Fisher Scientific 01-812-5
TCBS powder Hardy Diagnostics 265020 This study evaluates this medium
Thermocycler Any
TSB powder Fisher Scientific DF0370-07-5 may use other brands
UV viewing cabinet Any Emit long-wave UV light
Water bath Any  
 
 
Name Sources Catalog Number Comments
Bacterial species and strains
Aeromonas hydrophila ATCC
Candida albicans ATCC
Campylobacter jejuni ATCC
Escherichia coli ATCC
Proteus mirabilis ATCC
Pseudomonas aeruginosa ATCC
Staphylococcus aureus ATCC
Salmonella Choleraesuis ATCC
Shigella boydii ATCC
Shigella flexneri ATCC
Shigella sonnei ATCC
Vibrio alginolyticus ATCC
V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) FDA, ATCC
V. damsela FDA
V. fisheri Environment
V. fluvialis CDC
V. furnissii CDC
V. hollisae FDA
V. metschnikovii ATCC
V. mimicus FDA
V. parahaemolyticus (serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus FDA
V. vulnificus FDA

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References

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