世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

地中海ミバエ(チチュウカイミバエ)Ceratitis capitata(ヴィーデマン)(双翅目:ミバエ科)は非常に高い農業関連性を持つ害虫種です。これは、その生殖行動に起因している:彼らはパルプに卵や孵化した幼虫のフィードを置くとき、女性は果物や野菜の外表面に損傷を与えます。ワイルドC. capitata集団は、伝統的に噴霧および/または環境に優しいアプローチは、最も成功したが、無菌昆虫技術(SIT)である殺虫剤を介して制御されています。 SITは交尾する能力を保持するが、肥沃な子孫を生成することができません男性の大量飼育、放射線ベースの殺菌・フィールドリリースに依存しています。出現およびバイオテクノロジーのツールのその後の急速な発展は、一緒にチチュウカイミバエゲノム配列の可用性と、大幅にこの種の生物学の我々の理解を後押ししています。これは、ゲノム操作のための新しい戦略の増殖を支持しているCAnは集団制御に適用します。

この文脈では、胚のマイクロインジェクションは、チチュウカイミバエ制御のためのツールボックスの拡大に二重の役割を果たしています。キー生物学的プロセスを調節する遺伝子の機能を妨害する能力は、確かに、チチュウカイミバエ侵襲性の根底にある分子機構の理解を拡張します。さらに、生殖系列形質転換を達成する能力は、新規SIT設定将来フィールドアプリケーションについて試験することができる複数のトランスジェニック株の産生を促進します。実際、遺伝子操作は、例えば、フィールド内の滅菌男性パフォーマンスを監視するために使用することができる望ましい特性を付与するために使用することができ、またはそれは、初期の生命段階の致死をもたらすことができます。ここでは、これらの二つの主要な目標を達成するためにチチュウカイミバエ胚に核酸を顕微注入するための方法を記載します。

Introduction

地中海ミバエは(チチュウカイミバエ)Ceratitis capitataはコスモポリタン種広範囲に被害果物や栽培作物です。このような属BactroceraAnastrephaに属するものなど、いくつかの害虫種を含み、ミバエ科のファミリーに属します。チチュウカイミバエは、このファミリーの最も研究の種であり、それは昆虫の侵略1の研究のためだけでなく、害虫管理戦略2を最適化するためだけでなく、モデルとなっています。

チチュウカイミバエは野生と栽培植物3,4の300以上の種を攻撃することができます多化の種です。損傷は大人と幼虫の両方によって引き起こされる:交配した雌は、微生物がそれらの商業的品質に影響を与えることができるように、産卵のために果物の表面に穴を開け、果肉上の幼虫フィード一方。 3幼虫期の後、幼虫は、ホストから出てくると土壌に蛹化。Ceratitiscapitataは、アフリカ、中東、西オーストラリア、中南米、欧州、米国5の領域を含む、ほぼ世界的な分布を表示します。

チチュウカイミバエ蔓延を制限するための最も一般的な戦略は、殺虫剤( 例えば 、マラチオン、スピノサド)と環境に優しい滅菌昆虫技術(SIT)6の使用を伴います。後者のアプローチは、電離放射線への暴露により無菌に男性の数十万の野生への放出を伴います。野生のメスのような滅菌男性の交配は、最終的に根絶につながる、人口規模の縮小を引き起こし、ノー子孫になります。 SITは、世界中の複数のキャンペーンに有効であることが証明されたが、その主な欠点がリリースされる昆虫の何百万人を飼育し、殺菌の高コストが含まれます。放出された個人のマーキング中にフィールドに入力された野生昆虫から無菌区別する必要があります活動を監視し、それが現在の蛍光粉を使用して達成されます。これらの手順は、高価であり、望ましくない副作用7を持っています。

最適化するために、および/または、この害虫の制御のためのより効果的なアプローチを開発するためには、チチュウカイミバエ生物学と遺伝学は広く世界中で数多くの研究者によって検討されています。チチュウカイミバエゲノム配列8,9の利用可能性は、遺伝子機能に関する新たな調査を容易にするであろう。 RNA干渉は、そのような研究のための強力なツールであり、それは、dsRNA(二本鎖RNA)又はsiRNA(低分子干渉RNA)の微量注入を介して達成することができます。この技術は、Cでその性別決意分子カスケードを実証するために、例えば、使用されていますcapitataは部分的にしかショウジョウバエ 10とに対して保存されています。

C.許可チチュウカイミバエ胚を顕微注入するためのプロトコルの開発最初の非すべきcapitata-Drosophilidフライ種は遺伝的に改変されます。その卵は、 ショウジョウバエと同様であり、両方の形態および乾燥11への耐性の観点から、プレ胚盤葉の胚にプラスミドDNAを送達するためのプロトコルは、最初のDのために開発されたようにショウジョウバエ 12,13 最初にCでの使用に適合しましたcapitata。これらの最初の実験は、転移因子ミノス11に基づいて、チチュウカイミバエ生殖変換を可能にしました。その後、元のシステムは、他のトランスポゾンベースのアプローチを用いて、14変更されました。これは、鱗翅目Trichoplusianiの 15からのpiggyBacの場合です。プロトコルは、以来、さらに最適化されており、これは他の多くの双翅目22-31の他tephritid種16-21の変換とを可能にしました。人工欠陥transpo:すべてのこれらのシステムは、一般的なバイナリーベクター/ヘルパープラスミドの形質転換系の使用に依存します所望の遺伝子を含有する息子は、プラスミドDNAに組み込まとトランスポザーゼ酵素32を供給することにより、昆虫のゲノムに組み込まれています。トランスジェニックチチュウカイミバエ行数は、精度を高める可能性がある、致死性を誘発する条件優性致死遺伝子を有する株、株の雄のみの子孫を生成するため、追加の雌雄鑑別戦略を必要としない、蛍光精子で株を含む複数の機能で、生成されましたSITの監視段階33-37の。トランスジェニック生物の野生でのリリースのみ38,39蚊に対するパイロットテストで発生したが、少なくとも一つの会社は、フィールド40での使用のためのトランスジェニックチチュウカイミバエ株の数を評価しています。

胚のマイクロインジェクションは、(CRを、このような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ(TALENs)、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピートなどの新しいゲノム編集ツールの開発に有利に働くことができますISPR)/ CRISPR関連タンパク質小説進化論と発達研究を可能にするだけでなく、利用可能なバイオテクノロジーのツールボックスを展開します9ヌクレアーゼ(Cas9)とホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子(HEGs)、。ゲノム編集アプローチはすでに蚊41における遺伝子ドライブシステムの生成を可能にし、チチュウカイミバエへの転送が目前に迫っています。ここでは、上記のすべてのアプリケーションに有用であることができるチチュウカイミバエ胚に核酸を微量注入のための普遍的なプロトコルを記述します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.実験の設定

  1. 昆虫館の要件
    1. すべてのC.を維持25℃、湿度65%および12/12時間の明/暗の光でcapitataのライフステージ。
    2. 6 Lケージには約1,500〜2,000チチュウカイミバエ蛹を置きます。産卵42を刺激するのに十分に小さい穴を有する一方の側に真鍮メッシュでケージを使用してください。毛細管現象により水でハエを提供するために、ケージのベースにある小さい開口部からスポンジ片を挿入します。大人( 図1A)のための食料源として酵母と砂糖(1:10)の混合物を使用してください。酵母の量を増やします(最大1:砂糖:3、酵母)メスは卵を産むために失敗する必要があります。
    3. メッシュを通して堆積卵を収集するために、ケージの下に水で満たされたプレートを置きます。処女雌が産卵することができるようにハエがマイクロインジェクション実験のために卵を収集する前に、少なくとも6〜7日間経過するまで、待ちます。これは、女性が交尾しているであろうことを保証しますそして卵が受精されているであろうこと。
    4. 細かいネットストレーナーで水を濾過することによって卵を収集します。標準の幼虫の食(1.5 LH 2 O、100ミリリットルを1%HClを含有するプラスチック製の箱にストレーナから卵を移す広域スペクトル抗菌剤は50ミリリットルのエタノールに溶解した5グラム、400グラムの砂糖、175グラムの脱イオンビール酵母、1パスツールピペットを使用して)軟質小麦ふすまをkgです。
    5. 空気の循環を可能にするために、ネット蓋を透明容器内の各ボックスを配置し、ふすまの層を含有する蛹化( 図1B)を有利にします。
    6. 約10日後に、幼虫の食物から出てくると蛹化のためのふすま層に飛び降りる第3齢幼虫を確認してください。
    7. 24時間後、柔らかいブラシを使用して、小さなカップに蛹を収集し、新しい大人のケージに転送します。大人は通常10日蛹化後に出現します。新興フライはptilinum、目の上にその頭の上に位置して膨らませてポケットを使用していますアンテナの電子ベースは、蛹殻の終わりを強制的にオフにします。出現した後、ptilinumは恒久的に頭の中に戻って崩壊します。
  2. マイクロインジェクション幼虫のため1 Lの食品の調製
    1. 300ミリリットルのH 2 Oに2.5グラム寒天を溶かし
    2. ホット撹拌プレート上のウォーム500ミリリットルのH 2 Oおよび4グラム安息香酸ナトリウム、4.5ミリリットル37%HClを、42グラムの酵母エキスと115グラム脱水ニンジン粉末を溶解します。
    3. 混合物に10ミリリットルの無水エタノールに溶解した2.86グラム広域スペクトル抗菌剤の溶液を加えます。
    4. 15センチメートルラウンドペトリ皿に培地を配布し、放冷します。必要に応じて、4℃で保存します。
  3. スライドの準備
    1. 顕微鏡スライド(75×26ミリメートル2)に両面テープの2cmのストリップを置き、油スプレッドと注入された胚の結果としての乾燥を防ぐために、中国のマーカーでエッジをマークします。
  4. 市販のキット34を用いてプラスミドDNAを単離します。エタノールを用いてプラスミドを沈殿させ、所望の濃度で注射用緩衝液(0.1 mMリン酸緩衝液pH 7.4、5ミリモルのKCl)中に再懸濁します。
  5. フェノール-クロロホルムを使用して、長いdsRNAを合成し、in vitroで精製、イソプロパノールを用いて沈殿させ、注入バッファ43に再懸濁します。

2.胚の準備

  1. 6-7日齢の成人を含むケージの下に水で満たされたトレイを置きます。
  2. 女性は30分間産卵した後、細かいストレーナーを用いて水を濾過することによって胚を収集することを許可します。常に胚の乾燥を避けるために、水にストレーナを保ちます。
  3. 商業50%の漂白剤溶液中に5秒間ストレーナを浸すことにより、胚をDechorionate。
  4. 少なくとも、(繰り返しきれいな超純水にストレーナを浸すことにより、慎重に胚を洗います4-5回)。最後に、きれいな超純水にストレーナを配置します。最大2時間以内に胚を使用してください。
    注:マイクロインジェクションのタイミングは、前細胞化の核分裂の段階の間に、前胚盤葉の胚に注入する必要性に関連しています。これは、注入されたDNAを採取アップする核に、具体的に配偶子を発信します始原生殖細胞核の中にできます。チチュウカイミバエ細胞化に9と12時間45,46との間で行われるのに対し、 ショウジョウバエでは、極細胞で細胞化は、胚盤葉の形成は、約30分後に44を発生すると、(25℃)受精後約90分で開始します。
  5. 行の胚の向き
    1. 細かい絵筆を使用して、約50の胚を収集し、水に浸した黒濾紙ディスク上に置きます。
    2. 解剖実体顕微鏡下では、両面テープの上面の上の行の胚を手配細かい絵筆(000)を使用して、顕微鏡スライド( 図1C)。
      注:注射は生殖系列の始点となる後極で行われているように、すべて同じ向きで胚を合わせます。後極は卵門領域に対向します。
    3. 油は(1.3を参照)中国のマーカーの境界線上にこぼれないことを確認してクロロトリフルオロエチレン油の層で胚をカバーしています。
      注:油で胚をカバーする前に、更なるステップを行うことができる:胚は、その液体の含有量を減らすため、注入されたDNA溶液の侵入を容易にするために、数分間乾燥させることができます。これは、高い液体圧力の結果として、注射または注入溶液の過度の漏洩時​​の胚の破裂を回避するのに役立つことがあります。

3.胚のマイクロインジェクション

  1. マイクロピペットを用いてプラスミドDNAまたはdsRNA溶液(1-2μgの/μl)を用いて、針(1-2μl)を入力します。
  2. 針( 図1D)の動きを制御するためにマイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロインジェクションを実行します。スライドを移動するために顕微鏡ステージを使用してください。
    1. スコープのステージ上にスライドを置きます。
    2. 胚( 図1E)の後極に針の先端を挿入します。
    3. ペダルとマイクロインジェクションシステムを作動させることによって溶液を注入します。注入された液体は、胚のわずかな動きで、その結果、内部圧力の増加を誘導します。
    4. ペダルを離すとすぐに、しかし優しく、胚から針を取り除きます。
    5. 注射部位のほとんどの細胞質の漏れを確認します。
      注:原因マイクロインジェクションプロにDNA / dsRNAは/ siRNAおよび死亡率の潜在的な致死効果とを区別するために、自身cedure、対照実験を実施しなければなりません。これらは、逆遺伝学実験の場合には、緩衝液のみの注入を含む、または、緑色蛍光タンパク質(GFP)の二本鎖RNA(dsRNA-GFP)、またはsiRNAの由来。
  3. 注射後25℃で胚をインキュベートします。

4.注入後の手順

  1. 注入の2日後、実体顕微鏡下で孵化した幼虫( 図1F)のためのスライドを確認してください。幼虫は、油に移動するが、できるだけ早く幼虫食品に転送する必要があることができます。このため、スライドを数回日をご確認ください。
  2. 細かい絵筆(000)を使用して、静かにニンジンベースの幼虫食品に孵化した幼虫を移します。各ペトリ皿当たり200幼虫の最大値まで転送します。
  3. 湿度65%(25℃)で幼虫をインキュベートします。空気交換を損なう、蓋が皿に固執しないことを確認してください。
  4. 蓋をペトリ皿にしてください幼虫への空気の流れがまだあるように、ほとんど閉じました。過度の乾燥を避けるために、必要に応じて、毎日の料理をチェックし、蒸発を補うために水を追加します。
  5. ネット蓋と蛹化を有利に働くふすまの層を含むことにより、閉じた透明容器にペトリ皿を置きます。ルーチン昆虫館飼育については、 第3齢幼虫の幼虫の食のうち、ジャンプとはふすまで蛹になります。
  6. (これは世代0、G0)で蛹を収集し、大人の飼育およびスクリーニングのための小さなケージに配置します。リア標準幼虫食品に子孫。
  7. 注入された個人は、通常、キメラあるとして生殖形質転換実験の場合には、次の世代(G1)で可能な形質転換された個人のために確認してください。転位事象は、確かに、生殖細胞系または細胞体のいずれかを形成する胚の合胞体、核のいずれかに発生した可能性があります。
    1. まもなく出現した後、CO 2を使用して、G1の個人を麻酔し、TRANSFをチェック落射蛍光実体顕微鏡下でのイベントをormation。緑色蛍光のために画面にEYFPフィルタ(。。;エム30分の535内線500/20)を使用しながら、; DsRedwideフィルタ(EMM 75分の605。。内線12分の546)を使用し、赤色蛍光の存在をスクリーニングするために、 。
    2. 異性の野生型大人と小さなケージに変換された個人を置き、新しい、最初はヘテロ接合、歪みを発信。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ここでは、それぞれ、目的の遺伝子の機能解析に向け胚のマイクロインジェクションの二つのアプリケーション(ケース1)を報告し、およびトランスジェニック株の世代(ケース2)で。

胚へのdsRNAの送達は、遺伝子機能を解明します。

innexin-5遺伝子は、昆虫では、男性と女性の生殖腺43,47,48に特異的に発現しているギャップジャンクションをコードしています。近縁種のために利用可能な情報に基づいて、dsRNAを誘発性遺伝子サイレンシングは、チチュウカイミバエ雌と雄の生殖系列の切除をもたらすことが期待されていました。 2400胚の総数は548幼虫が孵化しと216大人が(未発表データ)生き残っているから、2μgの/μlのdsRNAの混合物、を注射しました。成人の約75%で、精巣および卵巣は下-develoのいずれかであるように見えましたPEDまたは全く存在( 図2)。対照と比較して男女両方から個人の腹部におけるinnexin-5転写産物量の定量化は、遺伝子の有意に低い発現を確認しました。

蛍光精子を持つトランスジェニック株の生成。

チチュウカイミバエ蛍光標識された精子を有するトランスジェニック株はプラスミドDNAで胚を注入することにより、スコラーリ監督や同僚34によって生成されました。 、1、「ヘルパープラスミド」 のpiggyBacのトランスポゼースをコードし;混合物は、固定された相対的な割合で混合二つのプラスミドを含有していましたその他、「ドナープラスミド」、人工トランスポゾンを含有しており、二つの蛍光マーカーを搭載し、1は、具体的には精巣で、雄と雌の細胞体に他を表明しました。トンの責任ベータ2チューブリン遺伝子のプロモーター、エステス特異的発現は、それぞれ、(#1261構成)蛍光タンパク質turboGFP(#1260構築物)またはDsRedExpressのコード配列とATGで融合させました。 205幼虫が孵化し、37大人が生き残っているから821胚の合計数は、注入しました。 ( -ライセンス番号3796240759880エルゼビアから得られたこれらのデータを再利用するライセンス)9女性と8男性の交差は、蛍光子孫に34を与えた6そのうち、アップを設定しました。成功した形質転換は、緑色と赤色蛍光精巣、それぞれ( 図3)を有する株の開発につながりました。

図1
図1. 昆虫館機器や胚。1,500-2,000成人を含む(A)標準飼育ケージ。雌はケージの前面に真鍮メッシュを通して卵を産みます。卵を、水に回収されます。左にケージの側面には、卵をフィルタリングするために使用されるストレーナが表示されます。 (B)の幼虫を含む標準幼虫食品の2つのボックス。ボックスは蛹化を容易にするために、ふすまを含むより大きな透明なプラスチックの箱に入れています。ボックスをカバーするネットは削除されました。 (C)胚は、行に配置されています。スライド上の両面テープの縁が白いチャイナマーカーでマークされています。テープ上に整列した卵は、クロロトリフルオロエチレン油で覆われます。 (D)マイクロインジェクション装置(左)マイクロマニピュレーター(右)を装備した実体顕微鏡に接続されています。 (E)胚極;黒い矢印は(卵門が配置されている)前極を示しているのに対し、赤色の矢印は、後極(注射部位)を示しています。スケールバー=500μmの。油に移動(F)孵化幼虫。スケールバー=500μmの。 嘆願seがこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2. 男性と低開発の生殖腺を持つ女性。女性(左)と男性(右)生殖器を解剖しました。上:通常の生殖腺を持つ野生型の個人。下:低開発生殖腺を持つ個人を妨害しました。 MAG:男性アクセサリー腺。 SP:spermathecaの複数形。スケールバー=500μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
蛍光精巣および精子 3. トランスジェニック男性。成人男性それぞれ、構築物#1260と#1261で形質転換しました。矢印はFLUOを示しますrescent精巣。 #1261男性は赤、精巣およびグリーン体を示しているのに対し、#1260男性は、赤いボディと緑の精巣を示しています。スケールバー= 2ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

昆虫の胚中の核酸のマイクロインジェクションは、遺伝子機能の解析とバイオテクノロジーのアプリケーションの両方を容易に普遍的な技術です。

昆虫の種数の増加から、ゲノム配列の最近の刊行物は、まだ未知の機能の遺伝子の機能解析のためのツールのための緊急の必要性につながります。 RNA干渉は、分子機能49と胚のマイクロインジェクションを推測するために最も貴重な方法の一つであることが証明されたこれらの研究を容易にします。

プラスミドDNAの注入は、トランスポザーゼ媒介遺伝子挿入を用いて、昆虫のゲノムを変更するために使用することができ、より最近では、ゲノム編集ツール( 例えば、TALEN、CRISPR / Cas9、HEGs)。これらの技術はすでに撲滅にまたは野生個体群の交換ワットの両方を目指し、害虫制御プログラムのために使用される可能性があり、複数の昆虫種の菌株の開発を可能にしています修正された生物学的機能を備えたi番目の昆虫。このプロトコルでは、我々は、プラスミドDNAまたはdsRNAのいずれかでチチュウカイミバエ胚マイクロインジェクションのために最適化された方法を説明します。

チチュウカイミバエ飼育のための十分に確立し、費用対効果の半乾燥幼虫の媒体、ならびにこの種でセックス決意と細胞化プロセスを研究する研究者が長年にわたって達成広範な分子情報の可用性、大幅に信頼性の確立を促進します胚のマイクロインジェクションプロトコル。具体的には、飼育プロトコルは、胚の最大生殖能力と活力を確保するために最適化されています。これは、可能な注入された胚の数が最も少ない実行可能な大人が得られる確率を最大にすることが重要です。異なるプロトコルは、そのような私たちが後方に注入された幼虫を記述ニンジンベースの幼虫食品として、チチュウカイミバエ飼育のために利用可能です。しかし、この方法は、より高価であり、その製造は、より多くの時間がかかりますルーチン飼育のために使用される他の媒体。

マイクロインジェクションの使用に重要な障壁は、胚の機械的操作に起因する非特異的な損傷です。これは、胚、注入体積、注入部位とバッファを配向するために使用される絵筆で、胚膜の穿孔のような胚の生存に影響を与える複数の変数を含み、針の種類は50を使用しました 。これらのパラメータのいくつかは、注入されたボリュームとバッファとして、最適化されています。針の場合には、それらは、プラーを使用して、社内で製造することができ、これは理想的なプロトコルを決定する最適化工程を必要とします。

マイクロインジェクションの手順の主要な欠点の中でもdechorionationです:このステップは( すなわち、滑りにくい)ハンドラに卵を容易にするために、注入を容易にすることが不可欠であるものの、漂白剤への長期暴露は重く胚の活力に影響を与えることができます。フォーこの理由を、R、我々はここで説明するプロトコルは、絨毛膜の除去と生存率との間の良好な妥協点として確立されている非常に短いdechorionation時間(5秒)、の使用を報告しています。

リアその後のライフステージに使用されるプロトコルにも関連しています。注入した胚から孵化した幼虫は、できるだけ早く油から除去されなければなりません。オイルは胚の乾燥を防ぐために実際に必要不可欠であるが、幼虫に有害であることができます。幼虫を除去するために使用される方法であって、油中に費やした時間、および使用される食品の種類は、それらが最終的な生存率を損なうことができるので考慮する必要があるすべての重要な変数です。

成人および幼虫スクリーニングする場合、固定化方法も重要であることができます。チチュウカイミバエ大人のアイスやCO 2のいずれかを使用して固定化することができますが、長時間の曝露は、成人の生存のために有害である可能性があります。胚のマイクロインジェクションの代替として、経口送達がが証明されていますRNAiのアッセイを実行するための低侵襲かつ潜在的に高いスループット方法です。これは、マイクロインジェクションの影響を受けやすいだけでなく、フィールド集団におけるRNAi媒介害虫駆除のためではない種に特に有効であることができます。

まず、蛍光精巣を持つ複数の株の確立につながったチチュウカイミバエゲノムのトランスポザーゼ媒介遺伝子挿入による形質転換の成功を:プロトコルの可能な用途の例が記載されているように、本論文では、2例が報告されています。同様のマイクロインジェクションの手順を用いて、ノックダウンの効果は、成人期まで見えては、dsRNAを注入することも可能です。

チチュウカイミバエ胚のための信頼性の高いマイクロインジェクションプロトコルの確立は、無菌昆虫を含め、古典的なアプローチへの代替または補完的な戦略として、野生でハエを制御するためのツールとして、遺伝的に改変された株を検討する道を開きました技術。最後に、ゼブラフィッシュ胚における自動化されたマイクロインジェクションのための技術の最近の進歩は、潜在的にチチュウカイミバエ及びその他の関連する害虫51のトランスジェニック株を作成するための重要な関連性を有する高スループット送達システムの開発に役立つ可能性があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats