יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים) בקלות מבודדים, שנקטפו השומן של חולדות רגילה. גליונות ASC יכולים להיווצר באמצעות הנדסה תא גיליונות, יכול להיות מושתלים לתוך צוקר סוכרתית חולדות שומני מפגין מלא-עובי העור פגמים עם עצם חשופה והן מכוסות bilayer של עור מלאכותי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עור מלאכותי השיג תוצאות טיפוליות ניכר בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, עור מלאכותי טיפולים עבור פצעים בחולי סוכרת עם זרימת הדם המניע או עם פצעים גדולים עשוי להיות ממושך. טיפולים מבוססי תאים הופיעו גם טכניקה חדשה לטיפול של כיבים סוכרתיים, הנדסה תא גיליונות שיפרה את היעילות של השתלת תא. מספר דוחות הראו כי נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים), סוג של תא mesenchymal סטרומה (MSC), נספח הפוטנציאל הטיפולי בשל השפע היחסי שלהם רקמת שומן, שלהם נגישות עבור אוסף בהשוואה ל- MSCs של רקמות אחרות. לכן, השיקופיים להיראות מקור טוב של תאי גזע לשימוש טיפולית. במחקר זה, גליונות עולה מן השומן אדיפוז epididymal של חולדות לואיס רגילה נוצרו בהצלחה באמצעות בינוני תרבות רגיל המכיל חומצה אסקורבית ומנות טמפרטורה מגיב תרבות. הסדינים ASC היו מושתלים לתוך צוקר שומן סוכרתית (ZDF) חולדות, מודל עכברוש של סוכרת מסוג 2 והשמנת, כי התערוכה מופחתת ריפוי פצעים. פצע נוצר על פני הגולגולת האחורי ASC הסדינים היו מושתלים לתוך הפצע, עור מלאכותי bilayer שימש כדי לכסות את הסדינים. ZDF חולדות שקיבלו ASC גליונות כדאי היה פצע ריפוי מחולדות ZDF ללא השתלת גיליונות ASC. גישה זו הייתה מוגבלת מכיוון ASC גליונות רגישים לתנאי יובש, המחייב שמירה על סביבה לחה הפצע. לכן, עור מלאכותי שימש כדי לכסות את הגיליון ASC כדי למנוע התייבשות. השתלת allogenic של גיליונות ASC בשילוב עם עור מלאכותי עשוי גם להיות רלוונטי סורר כיבים או כוויות, כגון אלה נצפו עם מחלת עורקים היקפיים ומחלות קולגן, אחרים ו יכול להיות מנוהל על מנת חולים אשר אתה סובל מתת תזונה או נמצאים באמצעות סטרואידים. לכן, טיפול זה יכול להיות הצעד הראשון לקראת שיפור האפשרויות הטיפוליות עבור סוכרת פצע ריפוי.

Introduction

אוכלוסיית חולי סוכרת היא הגוברת ברחבי העולם והגיע 400 מיליון בשנת 20151; אומדן 15-25% של חולי סוכרת נמצאים בסיכון של ההתקדמות של כיב סוכרתי התחתונה-הגפיים2. כיבים סוכרתיים התחתונה-הגפיים סורר, עשוי לדרוש הממושכת טיפולית עם הדרכה שיקומית לאחר התאוששות מלאה. תקופה ארוכה טיפול לעיתים קרובות גורמת לירידה משמעותית באיכות החיים המטופל. לפיכך, יש לפתח טיפולים חדשים להקטין או למנוע עוגמת נפש לטיפול פצעי סוכרת. כדי להעריך את ריפוי הפצע סוכרתית, אנחנו ממוטב כיב סוכרתי ריפוי פצע מודל בחולדות, אשר מחקה תנאים קליניים מעשיים, להעריך אם משתילים גליונות נגזר שומן בתאי גזע (ASC) באמצעות הנדסה תא גיליונות מואצת פצע ריפוי.

Mesenchymal תאי סטרומה (MSCs) התערוכה של פוטנציאל מצוין עבור האצת ריפוי הפצע בשל יכולת התחדשות עצמית שלהם, אפקטים immunomodulatory שלהם, יכולתם להבדיל לתוך התא השונים שושלות3. השיקופיים הם סוג של MSC נגזר רקמת שומן, שהם מייצגים את מספר יתרונות על פני MSCs נגזר רקמות אחרות, כולל שלהם האנגיוגנזה פוטנציאליים, paracrine פעילות4,5. רקמת שומן יחסית שופע בגוף האדם, הנגישות שלה מאפשר איסוף באמצעות הליכים פולשנית. לכן, השיקופיים שימשו השפעול של ריפוי פצע יישומים6,7.

בדו"חות קודמים הראו כי הזרקה ישירה של תא בודד MSC המתלים לאזורים סביב הפצעים יכולים להאיץ את8,9ריפוי הפצע. עם זאת, למרות דיווחים על ההאצה של ריפוי פצעים כיב סוכרתי דגמים לאחר ההזרקה של תא בודד המתלים, הפעם הישרדות התאים המושתלים באתר הפצע אינו ברור.

במחקר זה, אנחנו מוחלים הנדסה תא גיליונות באמצעות תרבות טמפרטורה מגיב מנות. הכלים האלה יש את הטמפרטורה מגיב פולימר N- isopropylacrylamide covalently שמאוגד אל פני השטח שלהם,10. השכבה פולימר המושתל מאפשר תא מבוקרי טמפרטורה הדבקה על או ניתוק מפני השטח של המנה תרבות. פני השטח של המנה הופך הידרופובי ב 37 מעלות צלזיוס, ומאפשר תאים לדבוק ולאחר להתרבות, ואילו תאים לנתק באופן ספונטני מהמשטח לכשתהיה הידרופילית בטמפרטורה שמתחת 32 ° C. תאים בתרבית ניתן לקצור כמו סדין תא רציפים עם צמתי לתא ללא פגע, מטריצה חוץ-תאית (ECMs) פשוט על-ידי הפחתת הטמפרטורה; לפיכך, אנזימים הפרוטאוליטי נזק ECM, כמו טריפסין, אינם נדרשים11. לכן, הנדסה תא גיליונות יכול לשמר חיבורים לתא ולשפר את היעילות של השתלת תא.

בנוסף, השתלת תאים גיליונות מגדילה תא שיעורי ההישרדות בהשוואה תא הזרקת12. ב פרוטוקול זה, נבחרו צוקר סוכרתית שומניים (ZDF) חולדות כמודל סוג 2 סוכרת והשמנה עם ריפוי הפצע מושהית. חולדות ZDF להתפתח באופן ספונטני השמנת יתר בכ-4 שבועות. ואז הם לפתח סוכרת מסוג 2 עם השמנת יתר בין 8 ל 12 שבועות של גיל, באיזה שלב הם מציגים היפרגליקמיה המשויך אינסולין ההתנגדות, dyslipidemia וטריגליצרידים13. עיכוב ריפוי הפצע, זרימת דם מופחתת כלי דם היקפיים, סוכרת כלייתית גם הן נצפו14,15,16. יתר על כן, ZDF חולדות עשוי להיות מודל המתאים עבור לימוד ריפוי של כיבים עורית סורר, כגון כיבים סוכרתיים.

ההבדלים בין בני אדם ומכרסמים מנגנוני ריפוי פצע משויכות הבדלים אנטומיים של העור. ריפוי אצל חולדות רגילה הפצע מבוסס על הפצע התכווצות, ואילו ריפוי הפצע בבני אדם מבוסס על היווצרות epithelialization מחדש רקמות פרור. בדרך כלל, הפצע לסדים. בשימוש במודלים מכרסמים מסייעת כדי למזער את הפצע התכווצות, מאפשר היווצרות הדרגתית של רקמות פרור17, למרות הפצעים בחולדות nondiabetic סגורים כמעט לגמרי על-ידי התכווצות. עם זאת, סוכרת פצע התכווצות ZDF חולדות הוא לקוי, ומתרחשת בעיקר ריפוי הפצע באמצעות epithelialization מחדש ויצירת רקמות פרור; לפיכך, תהליך זה דומה יותר ריפוי14הפצע האנושי.

פצעי סוכרת עם עצם חשופה לאחר הטריה לעיתים קרובות נתקל קלינית. מחקרים קודמים בחנו בקוטר 12 מ מ מלא-עובי העור פצעים על גבם של athymic עכברים עירום18,19 ופצעים עור מלא-עובי 10 מ מ קוטר על גבם של עכברים רגילה20. לפתח מודל קליני פצעי סוכרת חמורה, פגמים מלא-עובי העור (15 x 10 מ מ2) גדול יותר עם חשוף העצם ואת בלי קרום העצם נוצרו, כפי שתואר לעיל21, בחולדות עם סוכרת מסוג 2 והשמנת.

עכברוש גליונות עולה (rASC) מתוך השיקופיים של חולדות לואיס רגילה נוצרו לעבור השתלת allogenic של גיליונות ASC. באימון קליניים, השתלת עצמיים לא ילך, כי חולי סוכרת עם כיבים לעתים קרובות להפגין סיבוכים סוכרת חמורה, כגון רמות הגלוקוז בדם גבוהה לא מבוקרת ומדדי מסת גוף גבוה, סיבוכים כי ריפוי פצע הפרעות אלה המגבירים את הקושי בהשגת רקמת שומן מחולים אלה. יתר על כן, השיקופיים של בעלי חיים עם סוכרת בנספח לשנות מאפיינים, ליקויי תפקוד22. לכן, פרוטוקול המובאת כאן מתאר את השתלת allogenic של rASC גיליונות של חולדות רגילה לבין היישום של עור מלאכותי חולדות סוכרתית.

העור המלאכותי bilayer בשימוש פרוטוקול זה מונע התכווצות ספונטנית של הפצעים, מקדם את סינתזת של מטריצה רקמת חיבור חדשה, דומה הדרמיס נכון23. ב פרוטוקול זה, עור מלאכותי המוטלות על גיליון rASC, קבוע עם חוטי ניילון למניעת פצע התכווצות או התרחבות הנובע עור רופף עכברוש. בנוסף, העור המלאכותי מספקת מסגרת תלת-ממדי עבור הגליונות ASC שומרת על סביבה לחה ASC גליונות ופצעים המושתלים, מגן על הפצעים על זיהום, כוחות חיצוניים. לבסוף, ללא דבק ההלבשה מושם על הפצע כדי להגן עליו מפני השפעה חיצוניים, לשמור על סביבה לחה הפצע לספוג תפליט.

גיליון rASC רזה, גמיש ובעל deformable, יכול להיות דבקה העברת אתרים לנמען, כגון בגודל הלב הפועם24. הנדסה תא גיליונות שימש את שיקומה של רקמות שונות, ניתן להפיק אפקטים המרפא25,26. גליונות עולה כי התערוכה הפוטנציאל הטיפולי קליני שואלי ריפוי של סוגים רבים של פצעים. יתר על כן, השתלת allogeneic של גיליונות ASC, בשילוב עם השימוש של עור מלאכותי, עשוי להיות רלוונטי לטיפול בכיבים סורר או כוויות, כגון אלה הנהוגות מחלת עורקים היקפית או מחלות קולגן, או שהם עשויים להינתן לחולים אשר אתה סובל מתת תזונה או שימוש בסטרואידים. גישה זו מגדילה את היעילות של משתילים השיקופיים. המודל ריפוי פצע עכברוש ZDF מייצרת מצב פצע חמור דומה את תהליך ריפוי הפצע האנושי, מחקה תנאים קליניים בחיה ניסיוני בגודל קטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה ניסה לבסס טיפול מבוססת תא חדש עבור פצעי סוכרת סורר. בקצרה (כמו מאויר באיור1), גליונות allogeneic rASC שנוצרו חולדות רגילה באמצעות הנדסה תא גיליונות, ואז הושתלו באמצעות bilayer עור מלאכותי על פגם מלא-עובי העור על עכבר סוכרתית. מיקרוסקופ אור תמונות של דוגמה טובה של גיליון rASC (איור 2 א) דוגמה רעה של גיליון rASC (איור 2B) מוצגים באיור2. כאשר השיקופיים הם מצופה על גבי צלחת תרבות חדשה, המנה צריך להיות לאט שזעזעו הלוך ושוב, ימינה ושמאלה בתוך אינקובטור כדי להשיג rASC אחיד seeding, גיליון rASC בצורה אחידה בעובי (איור 2 א). אם rASCs לא יכולה להיות בצורה אחידה מצורף תרבותי על פני השטח של המנה תרבות, אין אפשרות לאסוף את הגיליון כמו סדין ASC רציף (איור 2B). איור 3 מראה הגליונות ASC נקצצו כמו סדין תא רציפים בטמפרטורת החדר כי השיקופיים חוברו בצורה אחידה פני התבשיל. בדרך כלל, ניתן לטפל rASC גליונות עם זוג מלקחיים. במידת הצורך, שקרום ההעברה יכול לשמש להעברת גיליון תא מתוך קערה תרבות לאתר הפצע, כגון אם הגיליון התא הוא שביר.
איור 4 מתאר העכברושים ZDF משמש מודל ריפוי פצע סוכרתי והשתלות של גליונות allogeneic rASC בשילוב עור מלאכותי. גיליון rASC הוא רך, גמיש, מתכוונן בגודל, מסוגל להיות מורחב לכל פינה של אתר הפצע עם זוג מלקחיים (איור 4A-F). . הפגם מכוסי גיליון rASC היה גם מכוסה עור מלאכותי (15 x 10 מ מ2), sutured עם 10 תפרים באמצעות ניילון 5-0 בתפר (איור 4G). כדי להגן על הפצע, סביבה לחה הפצע היה מתוחזק, exudates שנקלטו ההלבשה ללא דבק (20 x 15 מ מ2) הושם על העור המלאכותי, 5-0 ניילון התפרים הוחלו (איור 4I). הרוטב ללא דבק יוסר לעתים קרובות על ידי העכברושים ZDF בתוך ימים אחדים של יישום. לכן, החולדות חייב להיות במעקב לאחר ההשתלה. בדרך כלל, הרוטב ללא דבק מוחלף כל יומיים בהרדמה כללית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הצילומים מאקרוסקופית באיור 5 הן התוצאות נציג של השתלת של גיליון rASC. במחקר הקודם שלנו, אזור הפצע הממוצע בקבוצה rASC גיליון השתלת (איור 5B) היה קטן באופן משמעותי יותר בקבוצת הביקורת (איור 5A). עבור הפקדים, עור מלאכותי רק שימש לכסות את הפצע, בלי השתלת של גיליון rASC. התמונות האלו צולמו ביוםה 14 לאחר היצירה של הפצע (n = 6 בכל קבוצה)31.

Figure 1
איור 1: סכימטי של ההליך השתלת ניסיוני. תיאור סכמטי של ההליך השתלת ניסיוני ביצע עם עכברוש allogeneic נגזר שומן בתאי גזע (rASC) גיליון, עור מלאכותי במודל של עכברים ריפוי פצע של סוכרת מסוג 2 והשמנת. (א) עכברים רקמות אדיפוז היה טוחנות בניתוח של חולדות לואיס נורמלי. rASCs היו מבודדים, נזרע על גבי צלחת תרבות2 60 ס מ, תרבותי-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% 7-8 ימים. RASCs (B) היו subcultured כל 2-3 ימים ולאחר המעבר 3 rASCs היו נזרע על גבי צלחת תרבות טמפרטורה מגיב בקוטר 35 מ מ. התאים היו תרבותי שלם בינוני המכיל 16.4 µg/mL אסקורבית L אסיד פוספט מגנזיום מלח n-הידרייט (AA)-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% 7-8 ימים. RASCs נבצרו כמו סדין rASC רציף באמצעות הפחתת הטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. (ג) גליונות rASC מושתלים על פגם מלא-עובי העור2 15 x 10 מ מ עם עצם חשופה על הראש של חולדות מפגין סוכרת והשמנה (צוקר סוכרתית שומניים (ZDF) חולדות) שימשה כמודל ריפוי פצע. (ד) גיליון rASC היה ממוקם על הגולגולת ישירות על הפגם, מכוסה) עם 15 x 10 מ מ2 גיליון של עור מלאכותי bilayer, אשר היה sutured לתוך מקום עם ניילון 10 תפרים (5-0). סוכרת 2015; 64: 2723-2734; עם הרשאה. סוכרת (c) זכויות יוצרים (2015) על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אור מיקרוסקופ תמונות של השיקופיים. תמונות מיקרוסקופ אור של התפשטות עולה לקצה של תרבות מנות, ללא רווחים בין השיקופיים. (א) rASC גיליון עם עובי אחיד לכל הכיוונים 7 ימים לאחר תחילתה של culturing (A). (B) גיליון rASC ללא זריעת אחיד. אין אפשרות לקבל גיליון rASC רציפים ב 7 יום לאחר תחילת culturing (B). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תמונות time-lapse של rASC גיליון פסלים בטמפרטורת החדר. תמונות בצילום מואץ של המצב של גיליון rASC בטמפרטורת החדר. rASCs בצלחת תרבות טמפרטורה מגיב בקוטר 35 מ מ באופן ספונטני ובהדרגה מנותקת פני התבשיל בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C), נבצרו כמו סדין רציפים. (א) כ- 5 דקות לאחר המעבר המנה תרבות טמפרטורה מגיב לטמפרטורת החדר. (B) כ- 10 דקות אחרי המנה תרבות מגיבים לטמפרטורה של קוטר 35 מ מ לטמפרטורת החדר. (ג) כ- 20-30 דקות אחרי המנה תרבות טמפרטורה מגיב לטמפרטורת החדר. זהו גיליון rASC באיכות טובה (C). מצב גליון rASC (D-E) כ 20-30 דקות אחרי המנה תרבות טמפרטורה מגיב לטמפרטורת החדר. גיליון זה rASC היא בעלת איכות ממוצעת (D). גליונות rASC (F-G) מטופלים בדרך כלל עם זוג מלקחיים. אם הגיליון התא הוא שביר, קרום ניתן בדומה לפיגום להעברת הגיליון תא מתוך קערה תרבות לאתר הפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זמן-סדרת תמונות של הפצע ויצירת rASC גיליון השתלת עור מלאכותי, ההלבשה Non-דבק
זמן סדרת תמונות של הפצע ויצירת rASC גיליון השתלת עור מלאכותי, ההלבשה ללא דבק. (א) ראשיהם של ZDF חולדות היו מגולח עם מכונת גילוח חשמלית. לאחר גילוח השיער בגוף, סימני הביקורת (15 x 10 מ מ2) נמשכו באמצעות עט הידרופובי שמנוני. מלא-עובי מום (B) א (15 x 10 מ מ2) נוצר על ראש עכברוש ZDF anesthetized על-ידי הסרת עורית מכל האפידרמיס על קרום העצם. העור ואת עורית היו טוחנות עם איזמל, והוסרה קרום העצם עם חידוש raspatory. לחץ בעזרת גזה לחלח עם מלח סטרילית, הוחל כדי לעצור את הדימום לאחר כריתה. (ג) rASC גיליון השתלת. גיליון rASC הונח מעל הפגם מיד מעל הגולגולת של העכברוש באמצעות זוג מלקחיים. (D-G) התאמת הרחבת גליון rASC כדי להתאים את גודל הפצע. הגיליון rASC הוא גמיש, מתכווננת, ניתן להרחיב לכל פינה האתר הפצע בעזרת זוג מלקחיים. עבור פצעים רחב יותר, שניים או שלושה גליונות rASC גמיש יכול להיות מוערם. (H) תפירת העור המלאכותי הגיליון rASC. את הפגם ואת הסדין rASC מושתל היו מכוסים עור מלאכותי (15 x 10 מ מ2), אשר היה sutured עם עשרה תפרים בעזרת תפרים ניילון 5-0. (אני) Suturing של ללא דבק חבישה (20 x 15 מ מ2) לאתר הפצע מכוסה עור מלאכותי. כדי להגן על הפצע, ללא דבק ההלבשה (20 x 15 מ מ2) הושם על העור המלאכותי בתפרים ניילון 5-0. סוכרת 2015; 64: 2723-2734; עם הרשאה. סוכרת (c) זכויות יוצרים (2015) על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מאקרוסקופית תמונות של מלא-עובי העור פגמים. תמונות מאקרוסקופית של עור בעובי מלא פגמים ללא השתלת גיליון rASC (א) ועם את השתלת של גיליון rASC (B) 14 ימים לאחר היצירה של הפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בהצלחה culturing גיליון rASC הן כדלקמן: 1) הטמפרטורה חייבת להישמר כ 37 מעלות צלזיוס במהלך culturing על המנות תרבות מגיבים טמפרטורה. במהלך היצירה של גיליון rASC, כל הליך בוצעה על התרמו-צלחת 37 ° C, ו כל ריאגנט היה התחמם עד 37 ° C כדי למנוע את התאים באופן ספונטני ניתוק מן המנה31. 2) לעכברושים ZDF הנמען חייב להיות במעקב כדי למנוע הסרת החבישה ללא דבק, אשר הוא קריטי עבור השתלת מוצלחת של גליונות rASC. אם הרוטב מוסר, יש להחיל ההלבשה ללא דבק חדש כדי למנוע את הסדינים ASC המושתלים של ניתוק מן האתר הפצע.

באמצעות הליך זה, גליונות rASC בדרך כלל התקבלו בתוך 5-7 ימים של זריעה מעבר לשלוש תאים על תרבות טמפרטורה מגיב מנות. ניתן להתאים את תרבות הזמן הנדרש כדי ליצור גיליון rASC על פי צפיפות התאים הראשונית ואת הזמן שבו מוחל המדיום תרבות מלאה המכילה AA. אם גיליון rASC לניתוק מתוך קערה במהלך תא culturing, הגיליון rASC צריך להיות הניקל, להכין מנות נוספות במקרה של ניתוק התא.

המגבלות של פרוטוקול זה הם כדלקמן: 1) ניהול קפדני טמפרטורה יש ליישם לשמור משוער בטמפרטורה של 37 ° C במהלך התהליך כולו בעת שימוש תרבות טמפרטורה מגיב מנות. 2) לאחר קבלת גיליון rASC, מכשירים רפואיים מיוחדים יש להשתמש כדי לשמור על תנאים לח, כי בגיליון rASC רגישה לתנאי יובש. 3) ניהול שלאחר הניתוח, כולל תצפיות יומי של התנאי של העכברוש הנמען, נדרש.

פצעים גדולים יותר עם עצם חשופה לעיתים קרובות שנצפו קלינית. לדוגמה, תנועה טראומה מתאונת דרכים, כוויות, פצעים נגועים, פגומים או נמק את הפצעים לאחר הטריה יכול להתפתח פצעים גדולים עם עצם חשופה. . הנה, מודל קליני של פצעים חמורים פותחה באמצעות פגם גדול, מלא-עובי העור עם עצם חשופה בחולדות עם סוכרת מסוג 2 והשמנת. מודל זה יש פוטנציאל לשמש כמודל סטנדרט להערכת ריפוי הפצע בחולדות סוכרתית.

עור מלאכותי הוא מכשיר רפואי זמין מסחרית פגמים מלא-עובי העור לאחר הטריה, רקומביננטי בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF) כבר בשימוש נרחב לריפוי הפצע כדי לקדם אנגיוגנזה ואת פרור. שני טיפולים אלה שימשו להשגת תוצאות טיפוליות ניכר, אפילו עבור פצעים כרוניים, כגון פצעי סוכרת. בעבר דווח כי השיקופיים מפרישים angiogeneic גורמי גדילה28, כגון כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), גורם הגדילה hepatocyte (דבורה שחר) ו- bFGF, אשר יכול לתרום כורוידאלית29,30 ולהאיץ ריפוי הפצע. המחקר הקודם שלנו אישר כי השיקופיים ברציפות מפרישים גורמי גדילה אלה31. לכן, עולה גליונות, בשילוב עם עור מלאכותי, יש פוטנציאל לשמש כאופציה טיפולית חדשה, האצת vascularization ו-31ריפוי הפצע, גליונות אלה עשוי להיות רלוונטי לטיפול בסוגים רבים של כיבים סורר או כוויות בהגדרות קליני האדם בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים הבאים לחשוף יחסים פיננסיים הרלוונטיות בפרסום זה: Okano השנה הוא מייסד ומנהל של הלוח של תא הזרע בע מ, אשר רשיונות טכנולוגיה, פטנטים מאוניברסיטת טוקיו לנשים הרפואי, ואת השנה Okano יאמאטו יתבוננו הם בעלי תפקידים באוניברסיטה לרפואה תא זרע inc. טוקיו נשים מקבל וקרנות מחקר של תא הזרע בע מ המחברים אחרים מצהירים כי אין הם יחסים פיננסיים הרלוונטיות בפרסום זה.

Acknowledgments

המחברים תודה ד ר קוגה יוקיקו של המחלקה של פלסטיק, ניתוח לשחזור, Juntendo הספר לרפואה של אוניברסיטת, מתן עצות מעשיות. אנו מודים גם מר מוראטה Hidekazu על סוכרת במרכז של טוקיו של הנשים רפואי הספר לרפואה של אוניברסיטת לתמיכה טכנית מצוינת. מחקר זה נתמך על ידי יצירה של חדשנות המרכזים לתוכנית מתקדם בין-תחומי מחקר אזורים של הפרויקט עבור מערכות מתפתחות חדשנות "תא גליון רקמות הנדסה מרכז (CSTEC)" של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366, (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214, (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3, (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20, (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2, (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27, (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7, (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52, (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19, (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18, (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12, (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9, (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9, (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14, (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137, (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21, (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14, (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12, (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267, (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24, (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48, (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18, (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. db141133 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics