Humoral प्रतिरक्षण के एक कार्यात्मक readout के रूप में ELISPOT: अलगाव, भेदभाव, और मानव की मात्रा रक्त से एंटीबॉडी स्रावित बी प्रकोष्ठों

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University
Published 12/14/2016
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Immunology and Infection

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Summary

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Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

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Abstract

त्रिदोषन प्रतिरोधक क्षमता की बानगी कार्यात्मक ASCs, जो synthesize और इस तरह के एक रोगज़नक़ के रूप में एबीएस एक प्रतिजन (एजी), के लिए विशिष्ट छिपाना, और मेजबान रक्षा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं उत्पन्न करने के लिए है। एक व्यक्ति की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यात्मक स्थिति के मात्रात्मक निर्धारण, दोनों के लिए सीरम पेट और घूम ASCs सामान्यतः कार्यात्मक readouts के रूप में मापा जाता है। मनुष्यों में, परिधीय रक्त सबसे सुविधाजनक और सहज सुलभ नमूना है कि मेजबान बी कोशिकाओं द्वारा हासिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ASCs सहित अलग-बी सेल सबसेट, वंश विशेष Ab संयुग्मित microbeads के साथ या सेल के माध्यम से प्रवाह cytometry के साथ छँटाई चयन के माध्यम से परिधीय रक्त से सीधे अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, शुद्ध भोले और स्मृति बी कोशिकाओं को सक्रिय और संस्कृति में ASCs में भेदभाव किया जा सकता है। ASCs Ab स्राव के लिए योगदान करने के कार्यात्मक गतिविधियों ELISPOT द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जो एक परख है कि एंजाइम converges हैसे जुड़े immunoabsorbance परख (एलिसा) और पश्चिमी सोख्ता प्रौद्योगिकियों एकल कोशिका के स्तर पर अलग-अलग ASCs की गणना कर सकें। अभ्यास में, ELISPOT परख तेजी से रक्त के नमूनों की एक बड़ी संख्या के निपटने में आसानी की वजह से टीका प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। परिधीय रक्त से मानव बी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के तरीकों, इन विट्रो में ASCs में बी कोशिकाओं के भेदभाव, और कुल IgM- और आईजीजी ASCs की मात्रा का ठहराव के लिए ELISPOT के रोजगार यहाँ वर्णित किया जाएगा।

Introduction

बी कोशिकाओं त्रिदोषन प्रतिरोधक क्षमता के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। वे शुरू में अस्थि मज्जा में विकसित करने और इस तरह के रूप में तिल्ली भोले बी कोशिकाओं है, जो लसीकावत् ऊतकों में विस्थापित कर सकते हैं, लिम्फ नोड्स, और टॉन्सिल, आगे विकास के लिए के रूप में रक्त प्रवाह में प्रवेश। एजी मुठभेड़ पर, कुछ भोले बी कोशिकाओं लसीकावत् के रोम, जहां कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं स्मृति बी कोशिकाओं और plasmablasts (पीबीएस) / प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसी) में अंतर कर सकते में विस्थापित। जबकि सबसे पीबीएस / पीसी रक्त प्रवाह में बाहर निकलना, कुछ अंततः अस्थि मज्जा में रहते हैं लंबे समय रहते पीसी 1 में टर्मिनल भेदभाव से गुजरना है। संचलन में बी कोशिकाओं विषम हैं, और स्थिर अवस्था में, पीबीएस / पीसी परिधीय रक्त 2 में दुर्लभ हैं। वंश विशेष सतह मार्कर की उपलब्धता का एक परिणाम के रूप में, प्रवाह cytometry पहचान और परिधीय रक्त में बी-सेल सबसेट के लक्षण वर्णन के लिए एक लोकप्रिय तरीका बन गया है। प्रवाह cytometr की एक विस्तारित आवेदनy एक सेल सॉर्टर समारोह है, जो जुदाई और बी कोशिकाओं की अलग-अलग सबसेट के अलगाव के उच्च शुद्धता के साथ परमिट के अतिरिक्त है। विभिन्न विकासात्मक चरणों में विशिष्ट सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति मानव घूम बी कोशिकाओं आम तौर पर तीन मुख्य उप-जनसंख्या में वर्गीकृत कर रहे हैं के आधार पर:, स्मृति बी कोशिकाओं (CD19 + CD27 + CD38 -) भोले बी कोशिकाओं (- - CD38 CD19 + CD27), और पीबीएस / पीसी (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (चित्रा 1)। स्वभाव से भोले बी कोशिकाओं Ags सामना नहीं किया है। हालांकि, वे आईजीएम + CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि भोले बी कोशिकाओं बी सेल प्रतिजन रिसेप्टर (बीसीआर) -associated अणु (जैसे, CD19, CD20 और CD22) वे अपने इम्युनोग्लोबुलिन प्रदर्शनों की सूची 5 में विषम हैं व्यक्त करने में सजातीय हैं। CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं के बहुमत CD27 में भेदभाव किया जा सकता+ / हाय CD38 + पीबीएस / पीसी 6। इसके अलावा, स्मृति बी कोशिकाओं और पीबीएस / पीसी पॉलीक्लोनल कर रहे हैं और विकास और कार्यात्मक विविधता 4-7 दिखा रहे हैं। संचलन में पीबीएस / पीसी सामान्य रूप से अल्पकालिक होते हैं और CD138 व्यक्त नहीं करते, लेकिन अस्थि मज्जा में बसने के लिए किए गए उन टर्मिनली अंतर और लंबे समय रहते हो जाएगा। टर्मिनली विभेदित पीसी CD138 व्यक्त करने और उनके सतहों पर 8 CD27 अणुओं नीचे विनियमित। चूंकि दोनों पीबीएस और पीसी के पेट स्रावित करने में सक्षम हैं, कई अवसरों में वे सामूहिक रूप से ASCs के रूप में चिह्नित हैं। इसके विपरीत, न तो भोले बी कोशिकाओं और न ही स्मृति बी कोशिकाओं पेट 9-10 की प्रशंसनीय मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं। 10 दिनों जब उचित संस्कृति की स्थिति 6, 11-15 में रखा गया - फिर भी, जब अलग-थलग, दोनों भोले और स्मृति बी कोशिकाओं ASCs में 3 में भेदभाव किया जा सकता है। वास्तव में, ASCs उन सीधे पृथक fr के साथ CD27 और CD38 की इन विट्रो भेदभाव हिस्सेदारी समान सतह भाव से निकाली गईओम परिधीय रक्त 6। इसके अलावा, ASCs इन विट्रो में भेदभाव सतह CD20 का स्तर कम है, उस घूम पीबीएस / पीसी 6 के समान व्यक्त करते हैं। हालांकि संस्कृति व्युत्पन्न ASCs सभी अल्पकालिक होते हैं, वे पेट छिपाना कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि वे कार्यात्मक रूप से सक्षम और त्रिदोषन प्रतिरक्षा करने के लिए योगदान करने के लिए सक्षम हैं।

अब तक सबसे अधिक आवेदन किया है जिसके साथ तरीकों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर कार्यात्मक जानकारी प्राप्त करने के द्वारा दोनों एलिसा और ELISPOT हैं। एलिसा एक 96 अच्छी तरह से थाली आधारित परख है, और यह अक्सर सीरम एजी-विशिष्ट ABS और अन्य analytes (जैसे, साइटोकिन्स) की titers को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह सुविधाजनक और स्केलेबल है। एलिसा एक तरल नमूना 16 में, पेट या इस तरह के सीरम के रूप में अन्य पदार्थों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक ठोस चरण एंजाइम परख का उपयोग करने के लिए बनाया गया है। सीरम ELISAs से readouts व्यापक रूप से शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एक उपकरण पुन के अधिग्रहण के लिए आवश्यकएलिसा assays से adouts एक spectrophotometric microplate पाठक है। पाठक अंत उत्पादों को आम तौर हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित का पता लगाने के पेट और उनके विशिष्ट substrates 17 की प्रतिक्रिया से उत्पन्न ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) निर्धारित कर सकते हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रिपोर्टिंग के संबंध में, सीरम अब एलिसा द्वारा निर्धारित स्तर निरूपित करते सामूहिक, लेकिन अलग-अलग नहीं है, शरीर में ASCs का प्रदर्शन। इसके अलावा, एलिसा खाते में स्मृति बी कोशिकाओं है, जो पेट छिपाना नहीं है की भागीदारी लेने के लिए विफल रहता है।

एलिसा तरह, ELISPOT का पता लगाने और परिधीय रक्त के नमूने 17-18 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। ELISPOT एक सैंडविच एलिसा से संबंधित एक तकनीक है। इसे में, कोशिकाओं polyvinylidene difluoride (PVDF) एक अल्पकालिक संस्कृति के लिए microplates 96 अच्छी तरह से की झिल्ली समर्थित कुओं में रखा जाता है। ELISPOT परख एक microplate और developin पर पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन के अनुरूप हैजी प्रत्येक कुएं में (PVDF) झिल्ली पर धब्बे। एक स्वचालित प्रणाली ELISPOT पाठक या मैनुअल गिनती के लिए एक stereomicroscope की आवश्यकता है। एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने में ELISPOT का मुख्य लाभ ASCs और साइटोकाइन स्रावित कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव में अपनी शानदार संवेदनशीलता है। यह क्रमश: त्रिदोषन और सेलुलर प्रतिरक्षा में उनके कार्यात्मक गतिविधियों की रिपोर्ट। प्रतिरक्षा समारोह की माप में, सीरम अब एलिसा और ELISPOT द्वारा प्रगणित ASCs की संख्या द्वारा निर्धारित स्तर अक्सर सहसंबद्ध होते हैं, लेकिन इन दो assays से डेटा readouts कार्यात्मक निहितार्थ 19-20 में कुछ मतभेद हैं। ELISPOT का मुख्य लाभ यह विधि की अपनी संवेदनशीलता है। जब पेट की उचित isotypes का एक ज्ञात राशि संदर्भ के लिए शामिल किया गया है के रूप में एलिसा द्वारा रिपोर्ट सीरम Ab titers के स्तर पर आयुध डिपो readouts के रूप में प्रस्तुत किया जाता है अर्द्ध मात्रात्मक, रिश्तेदार Ab स्तर denoting, या अधिक मात्रात्मक, एकाग्रता readouts के रूप में। इसके विपरीत, ELISPOT के परिणामों presente हैंब्याज की एक सेल पूल में ASCs की पूर्ण संख्या के रूप में डी (जैसे, unfractionated परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) और PBMCs से शुद्ध बी कोशिकाओं)। ELISPOT एक भी एएससी पता लगा सकते हैं, लेकिन एलिसा पूर्व माप करने के लिए अनुकूलित परख निर्भर सांद्रता तक पहुंचने के लिए ASCs से Ab मात्रा की आवश्यकता है। इसलिए, ELISPOT जाहिर मात्रा का ठहराव की संवेदनशीलता में एलिसा के लिए बेहतर है। इसके अलावा, ELISPOT भी सक्रिय स्मृति बी कोशिकाओं से इन विट्रो विभेदित ASCs बढ़ाता के लिए उपयुक्त है। मेमोरी बी कोशिकाओं पेट छिपाना नहीं है, लेकिन सक्रियण पर ASCs में अंतर कर सकते हैं; वे इसलिए एलिसा द्वारा पता लगाया सीरम पेट के लिए कोई योगदान नहीं है। इस प्रकार, ELISPOT संस्कृति में सक्रियता के बाद स्मृति बी कोशिकाओं घूम की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के माप में पसंद की विधि है। यह लंबी अवधि के त्रिदोषन उन्मुक्ति के रखरखाव की निगरानी के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

मानव परिधीय रक्त सूचित सहमति के तहत स्वस्थ दाताओं से प्राप्त किया जाना चाहिए, और रक्त के नमूनों के उपयोग को मंजूरी व्यक्ति संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुरूप होना चाहिए। इस अध्ययन में, प्रोटोकॉल से फ्लो (चित्रा 1) और ELISPOT assays (चित्रा 3) के परिणामों के एक प्रदर्शन में मानव रक्त का उपयोग करने के लिए नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय अस्पताल के आंतरिक समीक्षा बोर्ड (प्रोटोकॉल संख्या 201307019RINB) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अलगाव और मानव परिधीय रक्त बी कोशिकाओं की शुद्धि

  1. युक्त कश्मीर 2 EDTA (1.5 करने के लिए 2.0 मिलीग्राम / एमएल रक्त) 15 एमएल ट्यूब में मंझला Cubital नस से ड्रा खून की ~ 10 एमएल (कोहनी को Cubital खात पूर्वकाल में) और तुरंत ट्यूब थक्का को रोकने के लिए कई बार पलटना गठन।
  2. Autoclaved (121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) बफर (150 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3, और 1 मिमी EDTA lysis के 35 एमएल जोड़ें, पीएच 7.4) ताजा खून का नमूना (≥ 3 युक्त ट्यूब के लिए: 1 / खंड खंड) और अब की तुलना में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं।
    नोट: ट्यूब के माध्यम से प्रकाश संचरण की उपस्थिति आरबीसी सेल के पूरा होने का संकेत है।
  3. 5 मिनट के लिए आरटी पर 600 XG पर अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि गोली सफेद रंग में है।
  4. Autoclaved फॉस्फेट बफर खारा के 10 एमएल के साथ गोली Resuspend (पीबीएस, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 4.3 मिमी ना 2 HPO 4, और 1.47 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 7.4 पीएच) और 1.3 चरण में के रूप में सेंट्रीफ्यूज।
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, के साथ 10 एमएल RPMI 1640 मध्यम (पूरक: 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी, और 2 मिमी एल glutamine) गोली resuspend, और फिर थाली एक 10 सेमी संस्कृति डिश में कोशिकाओं (पकवान प्रति रक्त के 10 एमएल)। 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान रखें।
  6. धीरे संस्कृति डिश के लिए कई बार चक्कर आने और जगहसंस्कृति के माध्यम से (निलंबन कोशिकाओं) 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में। संस्कृति बर्तन पर पक्षपाती कोशिकाओं (ज्यादातर मैक्रोफेज) त्यागें।
  7. 5 मिनट के लिए आरटी पर 600 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  8. 1640 RPMI माध्यम के 1 एमएल के साथ गोली Resuspend। एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ सेल संख्या की गणना।
    नोट: पृथक ल्यूकोसाइट्स की व्यवहार्यता सामान्य रूप से trypan नीले बहिष्कार से 90% से अधिक है।
  9. 1.7 कदम के रूप में अपकेंद्रित्र और 5 की एकाग्रता में ठंड पीबीएस बफर (0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 2 मिमी EDTA) की ~ 200 μL में कोशिकाओं resuspend - 10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल।
  10. Biotinylated विरोधी मानव अटल बिहारी कॉकटेल (बी कोशिकाओं की नकारात्मक चयन के लिए) रक्त कोशिकाओं के लिए विशिष्ट 10 6 कोशिकाओं प्रति के 5 μL जोड़ें और 30 मिनट 21 के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    नोट: विरोधी मानव अटल बिहारी कॉकटेल कम से कम पेट CD2 (या CD3), CD14, और CD16 के लिए विशिष्ट शामिल करना चाहिए।
  11. एक 10 गुना अधिक मात्रा में जोड़ेंबाँझ पीबीएस की कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  12. गोली (10 6 कोशिकाओं प्रति 5 μL) streptavidin संयुग्मित microbeads के बराबर मात्रा में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  13. एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  14. पीबीएस बफर के 2 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें।
  15. ट्यूब एक चुंबकीय स्टैंड में रखें और 8 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। भूरे रंग के microbeads धीरे-धीरे चुंबक 22 के बगल में ट्यूब दीवार को जोड़ना होगा।
  16. ट्यूब चुंबकीय स्टैंड में शेष के साथ, ध्यान से एक नया बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब 22 में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
  17. दोहराएँ 1.16 करने के लिए 1.14 कदम है, और दो supernatants कि अछूता बी कोशिकाओं होते गठबंधन। microbeads त्यागें।
  18. 5 मिनट के लिए आरटी पर 600 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  19. बहाव के प्रयोगों के लिए 1640 RPMI माध्यम में गोली Resuspend।
    नोट: आमतौर पर, 1 - 5 एक्स 5 10 बी कोशिकाओं बुद्धिहा परिधीय रक्त के 10 एमएल से 95% से अधिक शुद्धता के 23 अलग किया जा सकता है।

पृथक बी कोशिकाओं से 2. शोधन और स्मृति के पृथक्करण और भोले बी प्रकोष्ठों

  1. चरण 1 से शुद्ध कोशिकाओं का प्रयोग करें और एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग सेल नंबर का निर्धारण।
  2. 5 मिनट के लिए आरटी 600 XG पर centrifugation और बाद ठंड पीबीएस बफर के 100 μL में कोशिकाओं Resuspend।
  3. 1 - 2 10 6 कोशिकाओं प्रति biotinylated CD27 एमएबी की माइक्रोग्राम और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  4. 5 मिनट के लिए 600 XG पर ट्यूब और अपकेंद्रित्र पीबीएस बफर के 10 एमएल जोड़ें।
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस बफर के 50 μL में कोशिकाओं resuspend।
  6. कोशिकाओं के लिए - (2 माइक्रोग्राम / 10 6 कोशिकाओं 1) एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में streptavidin चुंबकीय microbeads के बराबर मात्रा में जोड़ें।
  7. धीरे अच्छा मिश्रण है और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  8. पीबीएस बफर के 3 एमएल ट्यूब - 2 जोड़े।
  9. इसे रखोएक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब और 8 मिनट के लिए आरटी पर सेते भूरे microbeads ओर चुंबक के लिए निकटतम को संलग्न करने की अनुमति है।
  10. चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब के साथ, ध्यान से एक नया बाँझ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला अंश हस्तांतरण। भोले बी कोशिकाओं - इस अंश को समृद्ध CD27 शामिल हैं।
  11. Microbeads युक्त ट्यूब के लिए 5 एमएल जोड़ें और धीरे microbeads resuspend (यानी, CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं की समृद्ध अंश) 24-25।
  12. 5 मिनट के लिए आरटी पर 600 XG पर अपकेंद्रित्र। बहाव के प्रयोगों के लिए 1640 RPMI माध्यम के साथ छर्रों Resuspend।
    नोट: आमतौर पर, ~ 30 - बी कोशिकाओं के 60% एक स्वस्थ दाता 7, 25-26 से PBMCs से CD27 + स्मृति कोशिकाओं के रूप में शुद्ध किया जा सकता है।

3. सेल भोले बी कोशिकाओं, मेमोरी बी कोशिकाओं, और पीबीएस / पीसी के संग्रह के लिए छंटनी

  1. कोशिकाओं चरण 1 से शुद्ध का उपयोग करना, एक hemocytome का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारितआतंकवाद या एक स्वचालित सेल काउंटर।
  2. 5 एमएल polystyrene ट्यूब में 10 7 प्रति एमएल की एकाग्रता में ठंड पीबीएस बफर में कोशिकाओं resuspend।
  3. 1 - 2 10 6 कोशिकाओं प्रति मानव आईजीजी की माइक्रोग्राम और एफसी ब्लॉक के लिए 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  4. 1 माइक्रोग्राम से प्रत्येक जोड़े विरोधी CD19 एपीसी (क्लोन: HIB19), विरोधी CD27-eFluor450 (क्लोन: O323), और विरोधी CD38 पीई (क्लोन: HIT2) 10 6 कोशिकाओं प्रति; अच्छी तरह मिक्स और 30 मिनट के 4, 27 के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  5. 3.4 कदम में पिछले 5 मिनट में, वाणिज्यिक 7-Aminoactinomycin (7-एएडी) के 5 μL जोड़ें।
  6. 5 मिनट के लिए 600 XG पर ट्यूब, भंवर, और सेंट्रीफ्यूज पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. एक 15 एमएल ट्यूब में एमएल प्रति 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं - 1 की एकाग्रता में बफर (2% बीएसए और 2 मिमी EDTA के साथ बाँझ पीबीएस) छँटाई में कोशिकाओं Resuspend।
  8. सेल clumps समाप्त करने के लिए एक नायलॉन जाल सेल झरनी (40 माइक्रोन ताकना आकार) के माध्यम से कोशिकाओं फ़िल्टर।
  9. एक प्रवाह cytometric तरह से कोशिकाओं को अलगवायलेट (405 एनएम), नीला (488 एनएम), और लाल (640 एनएम): एर तीन लेज़रों के साथ सुसज्जित है।
    नोट: अकेले नीले लेजर पर्याप्त के लिए 3-रंग cytometry 27-28 प्रवाह है।
  10. क्रमबद्ध भोले बी कोशिकाओं के एक साथ संग्रह के लिए तीन 15 एमएल ट्यूब (5 RPMI माध्यम से एमएल युक्त) (CD19 + CD27 -) में कोशिकाओं, स्मृति बी कोशिकाओं (CD19 + CD27 +), और पीबीएस / पीसी (CD19 + CD27 + / हाय CD38 +) 3-4, 28।
    नोट: हल से भोले और स्मृति बी कोशिकाओं सुसंस्कृत चरण 4 में वर्णित के रूप में हो सकता है।

4. अलग मानव CD19 + बी कोशिकाओं, CD19 + CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं, और CD19 + CD27 की इन विट्रो भेदभाव में - भोले बी प्रकोष्ठों

  1. कोशिकाओं कदम 1.19, 2.10, 2.11 और 3.10 में शुद्ध का उपयोग करना, एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ सेल संख्या निर्धारित है।
  2. 1640 RPMI मध्यम के साथ कोशिकाओं Resuspendके 1 एकाग्रता में - 10 x 10 5 एमएल प्रति और उन्हें एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में विभाज्य।
  3. सीपीजी (ODN 2006) 5 माइक्रोग्राम / 10 6 कोशिकाओं में जोड़ें / एमएल 18, 29।
  4. संस्कृति 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए।
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक से कोशिकाओं फसल, उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलग से जगह है, प्रत्येक ट्यूब पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और उन्हें 600 XG और आरटी 5 मिनट के लिए पर अपकेंद्रित्र।
  6. एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना। 1640 RPMI मध्यम के साथ 10 x 10 5 एमएल प्रति - 1 के एक एकाग्रता में कोशिकाओं Resuspend।

5. ELISPOT परख

  1. 30 एस के लिए ELISPOT प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए आसुत जल में 35% इथेनॉल के 30 μL जोड़ें।
    नोट: जब pipetting, सभी समय पर कुओं में झिल्ली को छूने से बचें।
  2. ELISPOT प्लेटों उलटें इथेनॉल हटा दें।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक में 150 autoclaved DDH 2 हे की μL रखो और सेते5 मिनट के लिए उन्हें आरटी पर अवशिष्ट इथेनॉल बंद फ्लश करने के लिए; 3 मिनट के लिए आरटी पर बाँझ पीबीएस के एक धोने के साथ पालन करें।
    नोट: कदम 5.1 5.3 के लिए वैकल्पिक हो सकता है, प्लेटों के निर्माण पर निर्भर करता है।
  4. रखो 5 माइक्रोग्राम / एमएल पॉलीक्लोनल एफ (एबी ') विरोधी मानव पुलिस महानिरीक्षक (आईजीजी आईजीएम + + IgA) के 2 टुकड़ा के 50 μL (पीबीएस में) ELISPOT प्लेटों के प्रत्येक कुएं में और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं (पसंदीदा) या 2 घंटे 11 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: उपयोग करें जब तक Parafilm साथ प्लेटों के किनारों को सील।
  5. प्लेटों पलटना 3 मिनट प्रत्येक समय के लिए आरटी पर, अपार पेट को दूर करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक पीबीएस के 200 μL जोड़ने के लिए, और उन्हें सेते दो बार।
  6. अच्छी तरह से रोकने के लिए 5% बीएसए (या RPMI 1640 मध्यम) प्रत्येक के साथ पीबीएस के 200 μL जोड़ें, और 2 घंटे के लिए आरटी पर उन्हें सेते हैं।
  7. प्लेटों उलटें अवरुद्ध बफर हटा दें। प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोने कदम 5.5 में के रूप में।
  8. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1640 RPMI माध्यम के 100 μL जोड़ें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  9. कोशिकाओं बीज के लिए तैयार है, RPMI 1640 मध्यम दूर करने के लिए प्लेटों पलटना।
  10. बीज 100 μL (5 एक्स 10 4), 50 μL (2.5 x 10 4), और एक के कुओं में 25 μL कोशिकाओं की (1.25 x 10 4) (कदम 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 से, और 4.6) ELISPOT थाली। 1640 RPMI माध्यम के साथ, अच्छी तरह / 150 μL करने के लिए खंड लाने के लिए।
    नोट: चढ़ाना कोशिकाओं के लिए एक या दो 2 गुना धारावाहिक dilutions की एक न्यूनतम सिफारिश की है।
  11. 14 h 18 - 5% सीओ 2 के लिए 8 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं। ऊष्मायन के दौरान प्लेटों चलती से बचें।
  12. प्लेटों कोशिकाओं और RPMI 1640 मध्यम हटाने पलटना।
  13. अच्छी तरह से पीबीएस-टी के 200 μL / (पीबीएस 0.05% बीच 20) के साथ आरटी पर 3 मिनट के लिए हर बार जोड़ें और, 5 बार उन्हें सेते हैं। प्लेट पलटना 5 washes से प्रत्येक के बीच धो बफर हटा दें।
  14. या तो बकरी विरोधी मानव आईजीजी alkaline फॉस्फेट (एपी), Fcγ विशेष पेट जोड़ें (आईजीजी का पता लगाने, के लिए 1: 5,000 पीबीएस-टी में) या बकरी विरोधी मानव आईजीएम-एपी, Fcμ टुकड़ा-विशिष्ट ABS (आईजीएम का पता लगाने, 1: पीबीएस आयकर में 5,000) नामित कुओं में और अंधेरे में 2 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
  15. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोने कदम 5.5 में के रूप में।
  16. 50 μL / अच्छी तरह से bromochloroindolyl फॉस्फेट नाइट्रो नीले tetrazolium (BCIP / एनबीटी) सब्सट्रेट समाधान जोड़ें। 15 मिनट - बैंगनी रंग के धब्बे सामान्य रूप से 5 में दिखाई देते हैं।
  17. 100 में अच्छी तरह से DDH 2 की μL / हे स्पॉट की ओवर-विकास को रोकने के लिए जोड़ें।
  18. सभी स्थानों के पूर्ण विकास के बाद नल का पानी चलाने के साथ प्लेटों कुल्ला।
  19. प्लेटों के underdrain निकालें और उन्हें अंधेरे में शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं।
  20. एक छवि अधिग्रहण / विश्लेषण इकाई (जैसे, एक स्वचालित स्कैनर या स्वयं एक विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से) के साथ एक स्वचालित प्लेट रीडर का उपयोग स्पॉट गणना।
    ध्यान दें: प्लेटों अंधेरे में आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण किया।

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Representative Results

PBMCs लाल रक्त कोशिकाओं और पक्षपाती कोशिकाओं (कदम 1.7 करने के लिए 1.2) के समाप्त हो गया था। कोशिकाओं के एक विभाज्य (2 x 10 6) भोले बी कोशिकाओं, स्मृति बी कोशिकाओं, और परिधीय रक्त (चित्रा 1) में पीबीएस / पीसी की आबादी वर्णन करने के लिए एक प्रवाह cytometric विश्लेषण के अधीन थे। इस दाता PBMCs में, लिम्फोसाइटों के बारे में 10% CD19 + बी कोशिकाओं थे। बी सेल डिब्बे में, CD19 + CD27 का प्रतिशत - भोले बी कोशिकाओं लगभग 50% था। दूसरी ओर, CD19 + बी कोशिकाओं के बारे में 50% CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं, 25-26 7 थे। ध्यान से, CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं आगे आईजीडी 4 के शामिल किए जाने के साथ अलग किया जा सकता है। 2, 30-31 - पीबीएस घूम के phenotype बेहतर CD20 के कम या कोई सतह अभिव्यक्ति (CD19 + CD27 + / हाय CD38 + CD20 लो /) के साथ परिभाषित किया जा सकता है। मृत कोशिकाओं 7 AAD को बाहर करने के लिए,सेल धुंधला (3.5 कदम), और बनाम 7 AAD एफएससी के लिए एक साजिश में शामिल किया जा सकता जीवित कोशिकाओं (7 AAD -) की आबादी gating के लिए अनुमति देता है।

ELISPOT परख की महत्वपूर्ण कदम चित्रा 2 में चित्रित कर रहे हैं। दोनों शुद्ध मानव बी कोशिकाओं और CD19 + CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं 5 दिनों के लिए 1640 RPMI माध्यम के साथ सीपीजी की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे। प्रकोष्ठों नव उभरा ASCs बढ़ाता के लिए ELISPOT परख के लिए काटा गया। अगर मौजूद है, पूर्व मौजूदा पीबीएस परिधीय रक्त से अलग करने में 48 घंटे 11 बाहर मर जाएगा। ELISPOT परख प्रदर्शन किया गया था, और एक स्वत: प्लेट स्कैनर द्वारा अधिग्रहीत मौके छवियों चित्रा 3 में प्रदर्शन कर रहे हैं। 5 दिनों के लिए सीपीजी के साथ इलाज किया 10 4 बी कोशिकाओं से 200 आईजीएम-ASCs जबकि आईजीजी ASCs की संख्या 10 है - - ELISPOT के परिणामों को आम तौर पर 50 दिखाएगा 10 4 कोशिकाओं 11 में 50।


चित्रा 1. gating रणनीति का चित्रण भोले बी कोशिकाओं, मेमोरी बी कोशिकाओं को अलग, और PBMCs में पीबीएस के लिए। (ए) कोशिकाओं (2 एक्स 10 6) 2 CD19 एपीसी, CD27-eFluor450, और CD38 पीई MABS (3.4 कदम) के माइक्रोग्राम से प्रत्येक के साथ दाग रहे थे। लिम्फोसाइट डिब्बे आगे बिखरने (एफएससी) बनाम ओर बिखरने (एसएससी) के लिए डॉट भूखंड पर (G1) gated था। (बी) सेल दोहरी है, जो एक साथ अटक दो कोशिकाओं से बनते हैं, FSC-W (चौड़ाई) बनाम FSC-एच (ऊंचाई) के लिए भूखंड पर (उन लोगों के बाहर G2) बाहर रखा गया। (सी) CD19 + बी कोशिकाओं एसएससी-ए (क्षेत्र) और CD19 एपीसी के लिए भूखंड पर जी 3 के रूप में gated थे। (डी) CD19 + कोशिकाओं की, CD27 और CD38 मापदंडों के डॉट साजिश भोले बी कोशिकाओं (CD19 + CD27 -; Q1 और Q4) से पता चला है, स्मृति बी कोशिकाओं (CD19 + CD27 +;Q2 और Q3), और पीबीएस (CD19 + CD27 + / हाय CD38 +; जी -4, Q2 के 0.6%)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 ELISPOT परख की महत्वपूर्ण कदम का रेखांकन। (ए) रखो 50 μL / अच्छी तरह से (5 माइक्रोग्राम / एमएल) एफ (एबी ') विरोधी मानव पुलिस महानिरीक्षक (आईजीजी + आईजीएम + IgA) के 2 टुकड़ा 2 घंटे के लिए एक ELISPOT थाली में से 37 डिग्री सेल्सियस पर या रात 4 डिग्री पर सी (पसंदीदा) (कदम 5.4)। ELISPOT थाली के कुओं में कोशिकाओं बीज। 14 एच (कदम 5.11) - ASCs PVDF झिल्ली को संलग्न करने के लिए और 8 के लिए ABS छिपाना करने की अनुमति दें। (बी) पीबीएस (0.05% के साथ बीच 20) के साथ कोशिकाओं से धो लें। (सी) एपी या एचआरपी-conj जोड़ेugated का पता लगाने या तो आईजीजी या आईजीएम के लिए विशिष्ट पेट। (डी) का पता लगाने पेट कि अपार हैं से धो लें। (ई) एपी या एचआरपी का एक सब्सट्रेट समाधान का पता लगाने के पेट से मिलान करने के साथ स्पॉट का विकास करना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक प्रतिनिधि प्लेट से ELISPOT परिणाम। (ए) शुद्ध CD19 + बी कोशिकाओं ELISPOT थाली के तीन आसन्न कुओं (अच्छी तरह से # 1 में 50,000 कोशिकाओं, अच्छी तरह से # 2 में 25,000 कोशिकाओं, और अच्छी तरह से # 3 में 12,500 कोशिकाओं, क्रमशः) में रखा गया था। प्रकोष्ठों RPMI 1640 मध्यम रातोंरात (~ 14 ज) में तो सुसंस्कृत थे। ELISPOT परख संस्कृति को पूरा करने के बाद किया गया था (5.18 करने के लिए 5.12 कदम)। analyz करने के लिएई परिणाम, ELISPOT प्लेट एक स्वचालित स्कैनर और सॉफ्टवेयर से लैस विश्लेषक के माध्यम से छवियों को प्राप्त करने के लिए स्कैन किया गया। (बी) के शुद्ध CD19 + CD27 + स्मृति कोशिकाओं (10 6 / एमएल) 5 दिनों के लिए 5 माइक्रोग्राम सीपीजी के / एमएल की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे। कोशिकाओं (ए) ELISPOT परख के लिए के रूप में इलाज किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अलगाव और मानव परिधीय रक्त बी कोशिकाओं की शुद्धि

आम तौर पर, लाल रक्त कोशिकाओं को कुशलता से उठी और lysis बफर (1.2 चरण) द्वारा मंजूरी दी जा सकती। यह आरबीसी lysis 5 मिनट से ज्यादा देर तक बफर के साथ PBMCs सेते लिए महत्वपूर्ण नहीं है, के रूप में सेल व्यवहार्यता अमोनियम क्लोराइड से प्रभावित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, लाल रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स एक साथ निम्नलिखित प्रोटोकॉल द्वारा हटाया जा सकता है।

1, रक्त से बफर: 9 के एक मात्रा के अनुपात में, एसिड साइट्रेट-डेक्सट्रोज (एसीडी) बफर के साथ नए सिरे से पूरे रक्त मिक्स (7.4 पीएच 39 मिमी साइट्रिक एसिड, 75 मिमी सोडियम साइट्रेट, और 135 मिमी डेक्सट्रोज)। आरटी पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र। परतों, जुदाई का संकेत के गठन पर ध्यान दे। महाप्राण और ऊपरी परत है, जो प्लेटलेट्स और प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा (पीला रंग) शामिल हैं त्यागें। इंटरफेस है, जो PBMCs होता है पर पतली परत बीच निकालें (मैं करें.ई.।, बफी कोट)। नीचे की परत में लाल रक्त कोशिकाओं के संक्रमण से बचने (घलाल रंग ark)। PBMCs के लिए lysis बफर जोड़े अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए, और फिर कदम 1.19 करने के लिए 1.2 का पालन करें।

सकारात्मक और नकारात्मक चयन 21: दो दृष्टिकोण PBMCs से बी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नकारात्मक चयन की विधि (कदम 1.1 1.19 के लिए) कोई बाध्य ABS या microbeads, नीचे की ओर प्रयोगों के लिए के साथ, अछूता, कार्यात्मक बी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ऐसा नहीं है जब सक्रियण और / या शुद्ध बी कोशिकाओं के भेदभाव संस्कृति में होता है इस खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण है। चिंता यह है कि सकारात्मक चयन द्वारा शुद्ध कोशिकाओं अनजाने एमएबी संयुग्मित microbeads (व्यास में 0.2 से 5 माइक्रोन) से प्रभावित किया जा सकता है। MABS बी कोशिकाओं पर विशिष्ट रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य है और इसलिए सक्रियण के लिए रिसेप्टर्स crosslink हो सकता है कर सकते हैं। इसके अलावा, microbeads बाध्य रिसेप्टर्स के माध्यम से बी कोशिकाओं द्वारा endocytosed जा सकता है। हालांकि biodegradable, microbeads एक सप्ताह से भी अधिक समय के लिए कोशिकाओं के अंदर रह सकते हैं। चाहे microbeads अनुभव को प्रभावित करती है की अवधारणमानसिक परिणाम अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। सकारात्मक चयन, विरोधी CD19 (क्लोन: 4G7 या HIB19) के माध्यम से मानव बी कोशिकाओं की शुद्धि में microbeads आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है, क्योंकि CD19 व्यापक रूप से बी कोशिकाओं के विकास के चरणों के दौरान व्यक्त की है। (: SJ25C1 या LT19 क्लोन), जो विरोधी CD19 microbeads से अलग epitopes को पहचान जुदाई के बाद बी कोशिकाओं की पवित्रता विरोधी CD19 MABS साथ प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

शोधन और पृथक बी कोशिकाओं से मेमोरी और भोले बी कोशिकाओं की पृथक्करण

CD27 मानव स्मृति और भोले बी सेल भेद 24 के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकार कर लिया सतह मार्कर है। CD27 अणु ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर (TNFR) परिवार के अंतर्गत आता है। भोले बी कोशिकाओं - क्योंकि CD27 सबसे मानव स्मृति बी कोशिकाओं पर व्यक्त की है, यह आमतौर पर उन्हें CD27 से भेदभाव करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, क्योंकि CD27 भी टी कोशिकाओं और एन.के. कोशिकाओं, विरोधी CD27 microbea के उपयोग पर व्यक्त की हैडी एस (क्लोन: O323) सकारात्मक स्मृति बी कोशिकाओं के चयन में बी कोशिकाओं की पूर्व शुद्धि (1.19 करने के लिए 1.1 कदम) की आवश्यकता है। जुदाई के बाद एक शुद्धता की जांच के लिए, मानव CD27 के लिए विशिष्ट Mabs (क्लोन: L128 या LG.3A10) (कदम 2.12) की सिफारिश कर रहे हैं। क्योंकि CD27 + मेमोरी बी कोशिकाओं विषम हैं, इस तरह के आईजीडी और FCRL4 के रूप में अतिरिक्त सतह मार्कर, सेल छँटाई 4, 7 में और अलग होने के लिए विचार किया जा सकता है।

सेल भोले बी कोशिकाओं, मेमोरी बी कोशिकाओं, और पीबीएस / पीसी प्राप्त करने के लिए छंटनी

क्योंकि बी कोशिकाओं FcγRIIB एक्सप्रेस, एक एफसी ब्लॉक (3.3 कदम) से फ्लो के लिए MABS के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए पहले की सिफारिश की है। अकेले मानव आईजीजी के एफसी टुकड़े 1 माइक्रोग्राम / 10 6 कोशिकाओं में पूरे मानव आईजीजी के रूप में समान रूप से अच्छी तरह से ब्लॉक कर सकते हैं। विरोधी मानव CD32 एमएबी (क्लोन: 3D3 या AT10) एफसी ब्लॉक के लिए एक और विकल्प है। ध्यान से, यदि FcγRIIB एक सतह मार्कर है शुद्ध बी कोशिकाओं में दाग हो, fluorophore संयुग्मित विरोधी CD32 एमएबी शएफसी ब्लॉक, एक पीबीएस धोने के बिना अन्य MABS साथ धुंधला द्वारा पीछा माफ करने के लिए जोड़ा जा ould।

तीन रंग के लिए प्रवाह cytometry, CD38-FITC (Fluorescein), CD27 पीई (phycoerythrin), और CD19 एपीसी (Allophycocyanin) fluorophores का एक विशिष्ट संयोजन कर रहे हैं। फिर भी, अगर प्रवाह cytometric सॉर्टर इस तरह के 405 एनएम, 488 एनएम और 640 एनएम के उन लोगों के रूप में तीन लेजर, के साथ सुसज्जित है, शोधकर्ताओं तो लक्जरी सेल छँटाई के लिए अलग लेज़रों से उत्साहित fluorophores चुनना है। , CD27-eFluor450 (प्रशांत नीले, क्लोन के बराबर: O323), और CD38 पीई (क्लोन: HB7) भोले बी कोशिकाओं को अलग करने, स्मृति: जैसा कि चित्र 1 में सचित्र, कोशिकाओं CD19 एपीसी (HIB19 क्लोन) के साथ दाग थे बी कोशिकाओं, और पीबीएस। एक ल्युकोसैट वंश मार्कर और एक CD45 + CD19 + जनसंख्या के रूप में गेट बी कोशिकाओं के रूप में: (HI30 क्लोन) ध्यान से, कुछ शोधकर्ताओं CD45 के शामिल किए जाने को पसंद करते हैं। क्योंकि स्थिर अवस्था में प्रचलन में पीबीएस का पता लगाने के एक दुर्लभ पूर्व संध्या हैsubstantiates उनकी सदाशयी अस्तित्व 2, 30-31 - NT स्वस्थ व्यक्तियों, कम या पीबीएस (CD19 + CD27 + / हाय CD38 + CD20 लो /) पर CD20 की भी कोई सतह अभिव्यक्ति में। जब ELISPOT संसाधनों द्वारा पीबीएस की मात्रा का ठहराव परिणाम सतह phenotypes और ASCs द्वारा की तुलना में किया जा रहा है यह उपयोगी है। सेल छँटाई करने के लिए पूर्व की अवधि के दौरान, 7-एएडी अपनी संकरा उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और निचले spillover बहुरंगा में प्रवाह cytometry के कारण मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के लिए propidium आयोडाइड के लिए पसंद किया जाता है।

इन विट्रो उत्तेजना और अलग मानव बी कोशिकाओं की भेदभाव में

ग्रुप बी सीपीजी (ODN 2006) अकेले स्मृति बी कोशिकाओं से दोनों IgM- और आईजीजी ASCs के सीमित भेदभाव पैदा कर सकते हैं। इसके अलावा, भोले बी कोशिकाओं केवल सीपीजी को कमजोर उत्तरदायी हैं और मुख्य रूप से आईजीएम-ASCs 6, 11 को जन्म दे। संस्कृति में सीपीजी की एकाग्रता का 2.5 रेंज में है - 5 माइक्रोग्राम / एमएल 10 6 बी कोशिकाओं प्रतिया PBMCs 11, 18। सीपीजी के अलावा, शुद्ध बी कोशिकाओं और PBMCs संस्कृति में ASCs में मानव बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए, mitogens, साइटोकिन्स, और बीसीआर एगोनिस्ट साथ सीपीजी के संयोजन की उपस्थिति में संवर्धित किया जा सकता (4.3 चरण)। उदाहरण के लिए, आमतौर पर एमएल प्रति 10 6 कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया व्यंजनों में शामिल हैं (एक) सीपीजी (5 माइक्रोग्राम / एमएल), पुनः संयोजक मानव आईएल -2 (10 एनजी / एमएल), और पुनः संयोजक मानव आईएल -10 (10 एनजी / एमएल) 15, 34; (ख) सीपीजी (5 माइक्रोग्राम / एमएल) और एफ (एबी ') विरोधी मानव पुलिस महानिरीक्षक (आईजीजी आईजीएम + + IgA) के 2 टुकड़े (20 माइक्रोग्राम / एमएल) 11; (ग) सीपीजी (5 माइक्रोग्राम / एमएल), एस ऑरियस कोवान (सैक) से एक प्रोटीन (1: 10,000 कमजोर पड़ने), और Pokeweed माइटोजन (PWM) (1: 100,000 कमजोर पड़ने) 18; (घ) पुनः संयोजक मानव आईएल -21 (100 एनजी / एमएल) और पुनः संयोजक sCD40L (1 माइक्रोग्राम / एमएल) 12, 15, 33; और (ङ) पुनः संयोजक मानव आईएल -2 (10 एनजी / एमएल) और R848 (1 माइक्रोग्राम / एमएल), एक TLR7 एगोनिस्ट 33-34। बी कोशिकाओं तीन दिनों में 11 ASCs में भेदभाव किया जा सकता है, कोशिकाओं को आम तौर पर पूर्व एस रहे हैंप्रायर ASCs 11, 18 की मात्रा का ठहराव के लिए ELISPOT प्लेट में जोड़ा जा रहा करने के लिए 5 से 6 दिन के लिए timulated। संस्कृति अवधि के दौरान, वहां आमतौर पर शुरू भेदभाव एजेंटों की कोई पुनःपूर्ति है।

सीपीजी युक्त संस्कृतियों के लिए आईएल -2 और आईएल -10 के अलावा काफी भेदभाव IgM- और आईजीजी ASCs 15, 35 की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं। संस्कृति में आईएल -2 की उपस्थिति सीपीजी से भेदभाव बी कोशिकाओं के विस्तार की सुविधा के लिए mitogenic उत्तेजना प्रदान कर सकते हैं। आईएल -10 10-25 एनजी की रेंज में / एमएल बहुत सीपीजी 35 की उपस्थिति में ASCs के उत्पादन (~ 3 से 10 गुना) में वृद्धि कर सकते हैं। विरोधी बीसीआर और सैक, और PWM सहित बीसीआर एगोनिस्ट भी प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं 18 के प्रसार को प्रोत्साहित कर सकते हैं। सीपीजी और पॉलीक्लोनल विरोधी बीसीआर मुख्य रूप से आईजीजी ASCs 28 में आईजीएम-ASCs में वृद्धि में परिणाम नहीं बल्कि साथ स्मृति बी कोशिकाओं incubating। FcγRIIB, एक एफ द्वारा बीसीआर के माध्यम से संकेत के निषेध की रोकथाम के लिए (अटल बिहारी और# 39;) विरोधी पुलिस महानिरीक्षक के 2 टुकड़ा (10 - 20 माइक्रोग्राम / एमएल 10 6 कोशिकाओं प्रति) जब बीसीआर 11 crosslinking की सिफारिश की है। पॉलीक्लोनल विरोधी पुलिस महानिरीक्षक के बजाय, या तो आईजीएम + या आईजीजी + बी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट विरोधी बीसीआर MABS ASCs में भेदभाव के लिए निर्धारण विशेष बी सेल सबसेट निशाना बनाने के लिए विचार किया जाना चाहिए। (: 10,000 कमजोर पड़ने 1), और PWM (1: 100,000 कमजोर पड़ने) सीपीजी, सैक का एक संयोजन कुशलता IgM- और आईजीजी ASCs 18, 24 में अंतर करने के लिए स्मृति बी कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं। इसके अलावा, सीपीजी मामूली विट्रो 28-29 में पुलिस महानिरीक्षक के वर्ग परिवर्तन के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इसके विपरीत, आईएल -21 (100 एनजी / एमएल) और sCD40L में (1 माइक्रोग्राम / एमएल) को प्रभावी ढंग से स्मृति बी सेल भेदभाव विशेष रूप से बंद कर आईजीजी ASCs 12, 30 के लिए प्रेरित करते हैं। SCD40L बी कोशिकाओं पर CD40 के माध्यम से टी सेल मदद नकल उतार, विवो में पीसी में उनके भेदभाव को प्रभावित करने से बी कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं। ध्यान से, विरोधी CD40 (क्लोन: 89 या G28.5) संस्कृति में 15 sCD40L के लिए स्थानापन्न कर सकते हैं। Howevएर, न है और न ही sCD40L विरोधी CD40 अकेले स्मृति बी कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए सक्षम है। इस प्रकार, सुसंस्कृत बी कोशिकाओं की CD40 सक्रियण अक्सर ऐसे आईएल -4, सीपीजी, R848, या आईएल -21, जिनमें से कोई भी पुलिस महानिरीक्षक वर्ग परिवर्तन को बढ़ावा देने के कर सकते हैं के रूप में एक भेदभाव एजेंट के साथ संयुक्त है। आईएल 4 Th2 सीडी 4 कोशिकाओं के भेदभाव करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, संस्कृति में IgG1 + बी कोशिकाओं के लिए स्विच करने के लिए सबसे आईजीएम + बी कोशिकाओं की प्रेरण की इजाजत दी। इसी तरह, आईएल 21 की उपस्थिति में दोनों स्मृति बी कोशिकाओं और भोले बी कोशिकाओं को विशेष रूप से कक्षा बंद ASCs 12, 32 में अंतर है। सीपीजी की तरह, R848 बी कोशिकाओं 34 की मामूली वर्ग स्विच पैदा कर सकते हैं। अंत में, यह उल्लेख है कि हालांकि lipopolysaccharide (LPS) को प्रभावी ढंग ASCs में माउस बी कोशिकाओं के भेदभाव पैदा कर सकते हैं, मानव बी कोशिकाओं TLR4 और CD14 29 के निम्न स्तर को व्यक्त करने लायक है। क्योंकि संस्कृति में एक भेदभाव एजेंट के अलावा बंद कर बी कोशिकाओं की पीढ़ी को बढ़ावा देता है, इस के अलावा जो बचा जाना चाहिएमापा जा सकता है जब पूर्व मौजूदा पीबीएस / पीसी या unswitched स्मृति बी कोशिकाओं रहे हैं।

ELISPOT परख

ELISPOT परख, झिल्ली आधारित पश्चिमी सोख्ता प्रौद्योगिकियों के साथ थाली-आधारित ELISAs को जोड़ती है पेट का पता लगाने के लिए एक एकल बी सेल 18 से स्रावित के लिए अनुमति देता है। ELISPOT भी एजी विशेष टी कोशिकाओं है कि साइटोकिन्स 17, 36 छिपाना यों के लिए अनुकूलित किया गया है। एक ELISPOT परख में, या तो शुद्ध कोशिकाओं या unfractionated PBMCs (लाल रक्त कोशिकाओं की मुक्त) का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, ~ 10 गुना शुद्ध कोशिकाओं ELISPOT assays में अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए और अधिक से अधिक PBMCs आवश्यक हैं। PBMCs में घूम ASCs का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं - एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 1 है। एजी-विशिष्ट ASCs, का पता लगाने में विरोधी पुलिस महानिरीक्षक आमतौर पर एजी द्वारा बदल दिया है (5 - 10 माइक्रोग्राम प्रति पीबीएस में / एमएल) एजी-विशिष्ट ACSS (कदम 5.4) पर कब्जा करने के लिए। निर्धारण-विशिष्ट पहचान पेट के उपयोग एजी-विशिष्ट आईजीएम-ASCs और आईजीजी निर्धारण-ASCs के बीच भेद (5.1 कदम परमिट4)। ध्यान से, चाहे विरोधी पुलिस महानिरीक्षक या एजी ASCs पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं की परवाह किए बिना, पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एलिसा पेट नहीं हमेशा ELISPOT के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसी तरह, नहीं एलिसा के लिए सभी रंग substrates ELISPOT में ठीक से कार्य करते हैं। एपी और एचआरपी संयुग्मित पेट सबसे अधिक ELISPOT में स्थान का पता लगाने के लिए किया जाता है। BCIP / एनबीटी सब्सट्रेट समाधान, एपी आधारित पता लगाने के लिए एक लोकप्रिय विकल्प है, जबकि 3,3 ', 5,5'-tetramethyl-बैन्जीडाइन (TMB) और 3-अमीनो-9-ethylcarbazole (एईसी) के समाधान के लिए आम एचआरपी substrates हैं ELISPOT में। एपी या एचआरपी सीधे पता लगाने के पेट संयुग्मित है, तो केवल एक कदम प्रोटोकॉल (कदम 5.14) में वर्णित है, का पता लगाने के लिए आवश्यक है। इसके विपरीत, पता लगाने के पेट biotinylated और एक दो कदम विधि में substrates के साथ प्रतिक्रिया से पहले एपी या एचआरपी संयुग्मित streptavidin के साथ आगामी ऊष्मायन आवश्यकता होती है। दोनों एक कदम और दो कदम तरीकों ELISPOT में स्पॉट का पता लगाने में कुशलता से काम करते हैं।

ELISPOT परख यों नहीं कर सकते हैं circulatआईएनजी लेकिन यह भी संस्कृति में ASCs भेदभाव (1.19 कदम बनाम 4.6)। अगर मौजूद है, ASCs, जो सामान्य रूप से संस्कृति में दो दिन से अधिक समय नहीं रहते घूम, ELISPOT थाली में सीधे संवर्धित किया जा सकता है, के साथ या PBMCs 11 से शुद्धि के बिना। इसके विपरीत, स्मृति बी कोशिकाओं के भेदभाव को 5 दिन की आवश्यकता है। इसलिए, सेल अलगाव (कदम 1.19) के बाद ELISPOT प्लेट में प्रत्यक्ष संवर्धन की सिफारिश नहीं है; मृत सेल मलबे विस्तारित अवधि संस्कृति से उत्पन्न स्थान का पता लगाने में पृष्ठभूमि में वृद्धि कर सकते हैं। इसके बजाय, दोनों शुद्ध बी कोशिकाओं और कुल PBMCs पहले mitogens और भेदभाव एजेंट (4.3 चरण) की उपस्थिति में 6 अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से थाली में संवर्धित किया जा सकता है। संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, उत्तेजना एजेंटों के बार-बार इसके अलावा अनावश्यक (4.3 चरण) है। प्लेटों इनक्यूबेटर में हैं, इनक्यूबेटर का दरवाजा धीरे खोला जाना चाहिए और बंद कर दिया, बढ़ने से वरीयता प्राप्त ASCs को रोकने के लिए वे आगे बढ़ पटरियों के साथ secreted पेट फैलाना कर सकते हैं के लिए, धब्बे पैदापूंछ (तथाकथित "धूमकेतु की तरह" स्पॉट) (कदम 5.11) के साथ। ELISPOT प्लेट में ऊष्मायन अवधि के समय कोशिकाओं के विभाजन की अनुमति के बिना पेट के detectable मात्रा में स्रावित करने के लिए कोशिकाओं के लिए की जरूरत है, जो मौके गिनती करने में कठिनाइयों पैदा होगा द्वारा निर्धारित किया जाता है। इस प्रकार, कोशिकाओं को आमतौर पर 8 घंटे के लिए रात भर (कदम 5.11) की श्रेणी में सुसंस्कृत हैं।

ELISPOT परख स्मृति बी सेल प्रतिक्रिया बढ़ाता के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। यह एक लोकप्रिय, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति के स्वतंत्र readout बन गया है। अभ्यास में, पूर्ववर्ती mitogenic संस्कृति ASCs (4.3 चरण) में भेदभाव के लिए स्मृति बी कोशिकाओं को सक्रिय करने की आवश्यकता है। हालांकि, आवृत्ति, जिस पर स्मृति बी कोशिकाओं का विस्तार और ASCs में अंतर के रूप में ऊपर वर्णित है, अलग संस्कृति परिवेश में बदलता है। आम सहमति के बिना हालांकि, सबसे शोधकर्ताओं प्रेरण शर्त यह है कि ASCs के उत्पादन को अधिकतम कर सकते अपनाने। एजेंट के मामले में स्पॉट detectio के लिए इस्तेमाल कियाn, एक घुलनशील biotinylated एजी संवेदनशीलता 37 समझौता किए बिना असंतोषजनक पता लगाने Ab जगह ले सकता है। इस विशेष महत्व का है जब एजी की उपलब्धता सीमित है क्योंकि एजी की एक बहुत कम मात्रा कोटिंग प्लेटों के लिए की तुलना में पता लगाने के लिए आवश्यक है। अन्त में, ELISPOT सेलुलर विविधता के प्ररूपी विश्लेषण की अनुमति नहीं है, और इस तरह सेल उप-जनसंख्या की पूर्व विभाजन की आवश्यकता है। हाल ही में, एक बहुरंगा ELISPOT परख, जिसमें पता लगाने के पेट विभिन्न fluorophores के साथ लेबल रहे हैं, एक भी अच्छी तरह 38-39 में साइटोकाइन स्रावित कोशिकाओं के कई प्रकार का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है। इस नई तकनीक PBMCs में कम आवृत्ति कोशिकाओं का पता लगाने के लिए और टीका प्रेरित बी सेल प्रतिक्रियाओं के एक बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए विशेष ब्याज की हो जाएगा।

क्योंकि ELISPOT परख तेजी से और ASCs और साइटोकाइन स्रावित कोशिकाओं बढ़ाता में कुशल है, यह न केवल circu की कार्यक्षमता को मापने के लिए बढ़ा दिया गया हैऐसे intrahepatic ल्यूकोसाइट्स 40 के रूप में लिम्फोसाइट, लेकिन यह भी ऊतक प्रतिरक्षा कोशिकाओं lating। अपनी संवेदनशीलता एक भी ए एस सी का पता लगाने के स्तर तक पहुंच की वजह से, ELISPOT परख तेजी से मौजूदा और उभरते रोगजनकों के खिलाफ टीका efficacies करने के लिए मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि उच्च throughput प्रदर्शन और ELISPOT परख की मजबूती PBMCs का उपयोग कर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बड़े पैमाने पर मूल्यांकन के लिए शानदार रहे हैं, assays के परिणाम इस तरह के नमूने के प्रसंस्करण देरी के रूप में विभिन्न कारकों से प्रभावित हो सकते हैं, चाहे कोशिकाओं ताजा या फ्रोजन हैं संस्कृति के माध्यम में, सीरम घटक है, और ELISPOT प्लेट 41 को जोड़ा गया कोशिकाओं की संख्या। इस प्रकार, सामान्य प्रक्रियाओं बड़े पैमाने पर और अनुदैर्ध्य अनुवर्ती अध्ययन (जैसे, टीका परीक्षण) में अंतर और अंतर-परख की विविधताओं को कम करने के ELISPOT प्रोटोकॉल में शामिल किया जाना चाहिए। प्लेट पढ़ने को सामान्य विधि भी linearity, सटीकता, और विपक्ष के लिए महत्वपूर्ण हैपरख में istency 41-42 परिणाम है। एक तरह से प्लेट पढ़ने सामान्य बनाने के लिए प्रदर्शन करने ELISPOT प्लेट (5.10 कदम) के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के धारावाहिक कमजोर पड़ने की प्रक्रिया का विस्तार है। एक संदर्भ प्लेट बनाकर, अधिक धारावाहिक dilutions अच्छी तरह से प्रति चढ़ाया सेल नंबर और अच्छी तरह से प्रति मौके मायने रखता है के बीच एक रैखिक संबंध का प्रदर्शन करना चाहिए। ELISPOT प्लेट के बार-बार स्कैन मौके मतगणना के खाके को मान्य करने के लिए, दोनों स्वचालित रूप से और मैन्युअल इस्तेमाल किया जा सकता है। मौके मायने में कम से कम इंट्रा-अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता इन सामान्यीकरण प्रक्रियाओं 43 के बाद अनुमान है। अन्त में, ELISPOT के आवेदन इस तरह के संक्रमण और कैंसर लेने के immunotherapies के साथ रोगियों के उपचार के लिए प्रतिक्रियाओं की निगरानी, के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए immunotoxicity के मूल्यांकन (जैसे, प्रतिरक्षादमन और दवा प्रेरित औतोइम्मुिनित) के रूप में कई मायनों में बढ़ाया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

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