حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الكائنات المجوفة، وعلى وجه التحديد هيدرا، كانت أول الحيوانات أظهرت لتجديد الهياكل التالفة أو المقطوعة، وبالفعل مثل هذه الدراسات أطلقت القول التحقيق البيولوجية الحديثة من خلال عمل Trembley منذ أكثر من 250 عاما. في الوقت الحاضر وقد شهدت دراسة تجديد تجدد باستخدام كل الكائنات التجدد "الكلاسيكية"، مثل الهيدرا، المستورقات وUrodeles، فضلا عن طائفة واتساع الأنواع التي تغطي مجموعة من metazoa، من الإسفنج من خلال الثدييات. وإلى جانب الفائدة الجوهرية بوصفها ظاهرة بيولوجية، وفهم كيفية عمل تجديد في مجموعة متنوعة من الأنواع سوف تبلغنا حول ما إذا كانت عمليات التجدد تشترك الميزات و / أو الأنواع الشائعة أو الآليات الخلوية والجزيئية للسياق معين. وشقائق البحر نجيمة، Nematostella vectensis، هو كائن نموذجا الناشئة على التجدد. مثل هيدرا، Nematostella هو عضو في الأسرة في اللغات القديمة، القراصات، ولكن في غضون رانه الطبقة الحيزهير، كليد شقيقة لالهدروانيات هذا هو أكثر تطويريا القاعدية. والجوانب وبالتالي من تجديد في Nematostella تكون مثيرة للاهتمام لمقارنة ومع تلك هيدرا والكائنات المجوفة الأخرى. في هذه المقالة، فإننا نقدم وسيلة لشطر، ومراقبة وتصنيف تجديد نهاية مجافي الفم من الكبار Nematostella، وهو ما يسمى المنفخة. والمنفخة يخضع بطبيعة الحال الانشطار كوسيلة من التكاثر اللاجنسي، وإما الانشطار الطبيعي أو بتر اليدوي للالمنفخة يؤدي إعادة النمو والإصلاح من الأشكال التضاريسية المعقدة. هنا قمنا دونت هذه التغييرات الشكلية البسيطة في نظام Nematostella التجديد التدريج (وNRSS). نحن نستخدم NRSS لاختبار آثار الكلوروكين، المانع من وظيفة الليزوزومية الذي يمنع الالتهام الذاتي. وأظهرت النتائج أن تجديد هياكل ورم، لا سيما المساريقا، غير طبيعي عندما يتم تثبيط الالتهام الذاتي.

Introduction

كانت الملاحظة التجديد في هيدرا واحد من الحدث البارز في ظهور البيولوجيا باعتبارها 1،2 العلم التجريبي. يبقى تجديد ظاهرة نداء واسع للغاية إلى الأحياء ووضع الشخص على حد سواء. إمكانية علماء البيولوجيا التطورية والأطباء وعلماء الطب الحيوي والمهندسين الأنسجة لفهم والتغلب على القيود المفروضة على تجديد البشري يجعل البيولوجيا تجديد أكثر من مثيرة للاهتمام في جوهرها.

الآن، مع استخدام التكنولوجيات الناشئة مثل تسلسل الجينوم والربح والخسارة من أدوات وظيفة، تستعد الميدان لندف آليات التجدد، وبصرف النظر لفهم في النهاية كيف الأنواع المختلفة يمكن أن تتجدد في حين لا يمكن للآخرين. وتبقى درجة من القواسم المشتركة في الردود الجزيئية الخلوية والمورفولوجية إلى توضيح، ولكن حتى الآن يبدو أن ردود الأساسية بين الحيوانات التي يمكن أن تتجدد هو أكثر مماثلة مما كان imagiنيد فقط قبل عقد من الزمن 3.

الكائنات المجوفة على وجه الخصوص هي السطحية في تجديد ما يقرب من جميع أجزاء جسمها وسط مجموعة واسعة من التنوع الصرفي. من الانفرادي ورم المياه العذبة، هيدرا جنبا إلى جنب مع الاورام الحميدة البحرية الصغيرة التي تبني الشعاب المرجانية الهائلة، إلى siphonophores الاستعماري معقدة، مثل البرتغالية رجل-O-الحرب، وتجديد وغالبا ما يكون وضع الإنجاب، بالإضافة إلى آلية ل إصلاح أو إصلاح أجزاء الجسم التالفة أو المفقودة الناتجة من الاصابة والافتراس. إذا كانت الأنواع المختلفة من القراصات استخدام آليات مماثلة أو مختلفة لتجديد هو مسألة مثيرة للاهتمام بشكل أساسي 4-6.

ونحن، والبعض الآخر تم تطوير وanthozoan، Nematostella vectensis كنموذج للتجديد 7-17. نحن وضعت مؤخرا نظام التدريج لوصف تجديد لكامل الجسم من قطعة موحدة شكليا من الأنسجة شطر من أبورال نهاية ورم 10. بينما الاورام الحميدة Nematostella يمكن تجديد عندما شطر على أي مستوى، اخترنا لخفض البالغين في موقف مجافي الفم في المنطقة الأكثر بسيطة شكليا، والمنفخة، في جزء منه لأن هذا هو على مقربة من الطائرة العادية للانشطار اللاجنسي الطبيعي 18، وأيضا لأنه مراقبة التصاريح والتحليلات الجزيئية لكيفية تجميعها على كامل الجسم من أبسط المكونات الشكلية.

والتدريج النظام Nematostella التجديد (NRSS) يوفر مجموعة بسيطة نسبيا من المعايير الشكلية التي يمكن استخدامها ليسجل تقدم في أي جانب من جوانب التجديد من قبل المنفخة بتر، في ظل ظروف ثقافة العادية أو أقلقت تجريبيا الحالات مثل علاج جزيء صغير، والتلاعب الجيني ، أو تغيير البيئة. كما كان متوقعا، وأصبح اعتمدت NRSS كما سقالة المورفولوجية التي الأحداث الخلوية والجزيئية للتجديد يمكن الرجوع إليها10.

أخيرا أسلوبنا في قطع تنتج فجوة عدة أوامر من حجم أكبر من ثقب نقطة دبوس المستخدمة في دراسة حديثة 17، إلا أن كلا من الجروح تلتئم في حوالي 6 ساعات. يجب توثيق مراحل اعتقال بصريا ومتميزة من إغلاق الجرح اقتراح نهج التجريبية لشرح استقلال واضح من حجم الجرح والوقت الذي يستغرقه لإغلاقه. وبالتالي، فهم البصرية أعمق لعملية بتر مجافي الفم، المنصوص عليها في هذا البروتوكول، سيساعد مزيد من التحقيقات في هذا النظام تجديد نموذج وتوسيع تطبيق هذا النظام انطلاق باستخدام Nematostella vectensis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تكييف من الحيوانات لدرجة الحرارة والتغذية ودورة الضوء / الظلام

  1. الحصول على البالغين Nematostella vectensis من واحدة من العديد من المختبرات Nematostella في جميع أنحاء العالم، أو مورد غير ربحية (الجدول 1)
  2. الحفاظ على Nematostella في درجة حرارة ثابتة (عادة ما بين 18 و 21 درجة مئوية) في الظلام، في "1 / 3X" الاصطناعي مياه البحر (مضادة للغواصات) في الملوحة من 12 أجزاء في الألف (باور بوينت). الحفاظ على الثقافات في أطباق ثقافة زجاج الصودا والجير بسيطة، وعادة 250 مل أو 1.5 لتر سعة 11.
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الشروط ثقافة بسيطة عادة بين المختبرات التي تدرس Nematostella، ولكن يمكن أيضا رعاية الثقافة أن يكون آليا (19).
  3. تغذية Nematostella فقست حديثا الأرتيميا اليرقات 2 - 4X في الأسبوع. الخراجات هاتش الأرتيميا في كامل قوتها (36 جزء في الألف) أو 1 / 3X مضادة للغواصات في 30 درجة مئوية، في الضحلة طبق زجاج مستطيلة 20 أو فيأي عدد من نطاق صغير، المفرخات الأرتيميا تجارية أو محلية الصنع. إذا حاضنة غير متوفرة، والروبيان يفقس في RT ولكن القيام بذلك ببطء أكثر.
    ملاحظة: هذا غالبا ما يتطلب أكثر من 24 ساعة لاستكمالها.
  4. استبدال المياه ثقافة النعمان مرة واحدة على الأقل في الأسبوع. للحصول على أفضل صحة البالغين، نظيفة تماما (بدون صابون) ثقافة الطاسات مرة واحدة في الأسبوع من الإفرازات المخاطية المتراكمة، التي معطف وعاء ويمكن فخ المواد الغذائية غير مأكول والنفايات، وتوريط الحيوانات.

2. اختيار والاسترخاء من الحيوانات مكيفة من الناحية التغذوية

  1. اختر المتطابقة حجم الاورام الحميدة من تقريبا نفس طول (3-5 سم، وعندما خففت بشكل طبيعي) ووضعها في وعاء فصلها عن مستعمرة لمدة ثلاثة أيام قبل البتر.
    ملاحظة: سيتم تحديد عدد الحيوانات التي اختيرت لقطع من التجربة التي أجريت، وبطبيعة الحال، ولكن بشكل عام نحن نوصي على الأقل خمسة حيوانات في كل نقطة عينة مع ستة مكررات. وهكذا،في تجربة نموذجية سيتم انتقاؤه ما لا يقل عن 30 الحيوانات. بشكل عام، فإنه من الحكمة لاختيار أكثر من الحد الأدنى لعدد (30) منذ بتر الأطراف التي هي غير منتظمة (انظر أدناه) يمكن أن تؤثر لاحقا التهديف.
  2. إزالة طبق من الحيوانات المختارة من الحاضنة إلى ضوء غرفة ساعة واحدة على الأقل قبل البتر.
    ملاحظة: سوف التعرض لضوء الغرفة والاهتزازات من التعامل المرجح أن يسبب الحيوانات للتعاقد، لذلك هم بحاجة إلى أن تتكيف أو "الاسترخاء" التي الحضانة على مقاعد البدلاء المختبر. وسوف تصبح الحيوانات الحرارية لمسة والتعرض للضوء وعند هذه النقطة يمكن نقلها من قبل pipetting لطيف.
  3. اختياري: تخدير الحيوانات بإضافة 7.5٪ MgCl 2 (في 1 / 3X مضادة للغواصات). إضافة بلطف حل MgCl 2 إلى وعاء مع معيار البلاستيك 5 مل ماصة.
    ملاحظة: على الرغم من الحيوانات سوف تصبح في نهاية المطاف تعود على ضوء والتلاعب الجسدي، قد يكون من المفيد لتخدير الحيوانات للحفاظ على أو "إصلاح" تيانه خففت الدولة بعد أن أصبحت 16،21،22 ممدود.
  4. استخدام تجويف واسع (> 0.5 سم) البلاستيك ماصة للنقل (في 1 / 3X مضادة للغواصات) خمسة حيوانات من تجمع لابد من بتر، في الجزء السفلي من طبق قطع الزجاج المعقم بقطر 100 ملم تحتوي على 12 جزء في الألف مضادة للغواصات. وضع الطبق على المسرح من مجهر تشريحي مع التكبير متغير بين 10 - 40X.
    ملاحظة: إذا لم يتم تخدير الحيوانات والاسترخاء لعدة قطاعات، فإنها قد لا تزال تستجيب لمسة والإضاءة المجسام، وبالتالي قد تحتاج إلى بضع دقائق لتصبح مرتاحا ثانية.

3. البتر

  1. باستخدام مشرط معقم، بتر المنفخة مجافي الفم من كل ورم، وذلك بهدف الحصول على قسم من المنفخة أن ما يقرب طالما أنها واسعة وتحتوي على أي مساريق.
    ملاحظة: وخفض الموقع المثالي هو مجرد مجافي الفم لإنهاء مساريق. في الطائرة من قطع هناك انتقال من مساريق المناسب لل رقيقةإيناس المقابلة لكل الإدراج المساريقية (انظر الشكل 1، السهام). غياب مساريق أمر بالغ الأهمية لأنها تنتج المخاطية التي قد تسهل "سد" ثقب 17،30.
    1. ضع شفرة المشرط في اتصال مع الحيوان في الموقع المطلوب من البتر. القيام بذلك إما بدون مساعدة (مرفوعة)، أو عن طريق استيعاب بلطف جسم الحيوان مع # 5 ملقط (نمط دومون أو ما شابه ذلك).
    2. قطع طريق الأنسجة من خلال الاستفادة من شفرة منحنية من مشرط في "الهزاز" الحركة في جميع أنحاء الجسم.
      ملاحظة: يجب أن الأنسجة تقطع نظيفة كما هزت مشرط وتحرير القسم المطلوب من المنفخة من الجهة المانحة. ومع ذلك، إذا كان قطعة صغيرة من الأنسجة لا يزال يربط الجسم والمنفخة، قطع عليه مع مشرط. لا تحاول فصل القطع متصلة عن طريق سحب، لأن هذا قد يؤدي إلى تلف المنفخة.
  2. إزالة كل بتر "المانحة" ورم من الطبق وإعادته إلى سيباعاء معدل المسمى "مبتوري الأطراف المجمعة؛ التاريخ وعاء وإعادته إلى ثقافة الأسهم.
    ملاحظة: سوف الاورام الحميدة بتر شفاء الجرح مجافي الفم خلال يوم واحد وبعد ذلك يمكن أن يكون الطعام بشكل طبيعي. وسوف إعادة إنشاء المنفخة تبدو طبيعية في غضون أسبوعين وعند هذه النقطة والمنفخة يمكن بتر مرة أخرى إذا رغبت في ذلك.
  3. شطف المنفخة رفعه التي تبقى في طبق القطع في 12 ASW باور بوينت، ثم نقل كل المنفخة إلى بئر العقيمة مستقل في لوحة الثقافة خلية متعددة جيدا أن لديها بالفعل 10 مل من 12 ASW جزء في الألف في كل بئر.
    ملاحظة: يستخدم هذا المثال لوحة جيدا ستة، مع كل عقد أيضا في 10 مل من مياه البحر وخمسة المنفخة رفعه. في مياه البحر العام يجب أن يغطي المنفخة بما فيه الكفاية لتجنب التعرض للهواء بسبب حركة في التعامل والتبخر. يجب أن يكون غطاء لوحة أو الآبار.
  4. كرر الخطوات من 3،1-3،3 لجمع ما لا يقل عن 5 المنفخة في كل محفوظة بشكل جيد لكل علاجا تجريبيا.
  5. احتضان المنفخة عند درجة حرارة من شأنها أن سفر الأمثالبيئة تطوير متكاملة على أفضل سعر للتجديد لاستجواب التجريبية المخطط لها. وضع لوحة تحتوي على المنفخة في تنظيم درجة الحرارة حاضنة، عند درجة حرارة ثابتة يحددها معدل المطلوب للتجديد.
    ملاحظة: سوف المنفخة تجديد الأنسجة المفقودة وتشكيل ورم كامل عندما حضنت في درجات حرارة تتراوح بين 15 و 27 درجة مئوية. معدل تجديد هو درجة الحرارة يعتمد باستثناء المرحلتين الأوليين. في اليوم في المتوسط ​​للوصول إلى المرحلة 4 في جميع درجات الحرارة هو 7 أيام بعد أن قطع وهذا يتزامن أيضا مع تجديد في 21 درجة مئوية. في 27 درجة مئوية، ويتم التوصل إلى المرحلة 4 في وقت سابق عن 3 أيام، وعند 15 درجة مئوية، ويتم تأخير المرحلة 4 بحوالي 3 د مقابل تجديد في 21 ° C (انظر أيضا المرجع 10).

4. تقييم التجديد مع نظام التدريج Nematostella التجديد (NRSS)

  1. يسجل المنفخة باستخدام مجهر ستيريو مركب مع Magnific على متغيرأوجه (10 - 80X). يسجل Nematostella المنفخة قطع طازجة كما المرحلة 0 ويستمر التسجيل في نفس الوقت كل يوم بعد بتر (د ب أ) باستخدام NRSS 10.
    ملاحظة: للحصول على معايير انطلاق الرئيسية وتفاصيل تشير المرجعي 10.
    1. يسجل المنفخة كما المرحلة 0 (الجرح المفتوح) إذا ظهرت قطع طازجة المنفخة باعتباره cup- على شكل كتلة تشبه البالون مترهلة، مع موقع جرح مفتوح من المرجح مرئية.
      ملاحظة: قد عصا حواف الجرح معا أيضا منذ البداية، ولكن ستظل انهار الأنسجة وتفتقر إلى الصلابة. يمكن ملاحظة حواف الجرح المفتوح تمر انكماش شعاعي كما يشفى الجرح.
    2. يسجل المنفخة كما المرحلة 1 (الجرح مقفلة) إذا يبدو الجرح بتر مغلقة.
      ملاحظة: موقع الجرح تتوافق مع القطب عن طريق الفم في المستقبل. السطح الخارجي حول القطب عن طريق الفم في المستقبل قد تبدأ في عرض أقواس متميزة الموافق الكامنة الإدراج المساريقية الأديم الباطن متماثل شعاعيا.
    3. فتاه النتيجةYSA كما المرحلة 2 (شعاعي الأقواس) إذا كان سطح القطب عن طريق الفم يبدو مبالغا، وكشف عن ثمانية أقواس رفع مرتبة في نمط متماثل شعاعيا ومفصولة الأخاديد. نلاحظ، الفقاعات نصف كروية صغيرة في قمة الأقواس. وسوف يكون حوالي مثل طويل القامة واسع كما، عابرة المرجح، وتتألف في البداية من قبل طبقة الخلايا الأدمة واحدة.
      ملاحظة: في بعض الحالات قد تستقر الفقاعات المزدوج الطبقات. ملاحظة: في هذا أو في وقت لاحق مراحل طبقة المخاطية قد تظهر لتغليف المنفخة (الشكل 2) في "غمد" غشائي. يجب إزالة هذه المواد التغليف لتسهيل التهديف.
    4. يسجل المنفخة كما المرحلة 3 (اللامسة) إذا تم تشكيل براعم مخالب تحتوي على الأديم الباطن والأدمة طبقات الأنسجة ثابت في نهاية الفم من بعض الأقواس الشعاعية على الأقل.
      ملاحظة: مخالب أطول مما هي واسعة وتكون متحركة الحد الأدنى. سوف تظهر المنفخة زيادة، ولكن التضخم متغير بحيث اساسيات مساريق قد تصبح فيماible تمتد من الإدراج المساريقية في تجويف الجسم (معى بدائي).
    5. يسجل المنفخة كما المرحلة 4 (الخطي المساريقا) إذا كان المنفخة تحتوي على ثمانية، المساريقا مرئية المتميزة التي تمتد إلى معى بدائي من الإدراج في جدار الجسم، مع أطوال عن طريق الفم مجافي الفم التي هي أكثر من ضعف عرض شعاعي على قياس من حيث ظهورها للاتصال إلى البلعوم في نهاية مجافي الفم لها (enterostome).
      ملاحظة: أربعة أو أقل المساريقا لها "مطوي" الحواف الحرة الداخلية. البلعوم مرئيا. أكثر من ثمانية مخالب واضحة، متحركة وأحيانا التعاقد في الجسم.
    6. يسجل المنفخة كما المرحلة 5 (في الغالب مطوي المساريقا) إذا كان المنفخة لديها أكثر من أربعة المساريقا مع ضفائر، وضفائر أكثر الكامل ومتعرج مما كانت عليه في المرحلة 4. الحيوان لديه تقريبا "العادي" مظهر الكبار، ولكن لا توجد مرئية خلايا الغدد التناسلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر تطور الأحداث المورفولوجية خلال تجديد في المنفخة قطعت في الشكل 1A، الذي يتضمن آراء تمثيلية من المنفخة في كل مرحلة NRSS. يشار إلى نموذجي موقع قطع المنفخة على الكبار (السهام). تظهر الصور في الشكل 1A تجديد التدريجي للهياكل الفم والجسم من قطع طازجة المنفخة من خلال ورم تشكيلها بالكامل. الشكل 1B، C تظهر ترتيب الحاجز الداخلي، والمساريقا، في المرحلة 4 والمرحلة 5 على التوالي. لاحظ أن بعض المساريقا في المرحلة 4 وتفتقر "ضفائر"، ولكن لتتأهل كمرحلة 5 الأغلبية يجب أن يكون وضعت الطيات. ويبين الشكل 1D والمنفخة يلفها غشاء مخاطي والتي يمكن ازالتها بالملقط (الشكل 1E). بينما عادة غير ضارة لتجديد (ما لم يعوض بشكل غير معقول الحيوان)، يمكن للغشاء تعوق يحرز المنفخة والقيامجي التلاعب التجريبية، مثل المجهر، تثبيت عينة أو حصاد التحليل الجزيئي / الكيمياء الحيوية. تتم إزالة هذا أفضل بعد المرحلة 1، أو في وقت لاحق إذا كان الإصلاحات.

ويبين الشكل 2 كيف يمكن للنظام التدريج يمكن استخدامها لتسجيل نتائج تجربة لتقييم آثار تثبيط الالتهام الذاتي. قطعت المنفخة وتعامل مع الكلوروكين في 10 و 50 و 100 ميكرومتر، أو كان المنفخة غير المعالجة (الضوابط). الكلوروكين يمنع ظائف الليزوزومية، التي مطلوبة من أجل الالتهام الذاتي. استخدمت معايير NRSS ليسجل المنفخة على مدى التجدد وكانت النتائج المرسومة في الشكل 2E. وقدمت عندما وصلت الضوابط مرحلة 5. الكلوروكين معاملة الحيوانات لم تخطي المرحلة 4، وأنها عادة عرضت ناقصة regenera مساريق - صور من السيطرة التمثيلية (الشكل 2A) والكلوروكين تعامل المنفخة (D الشكل 2 ب)نشوئها (أكثر تفتقر ضفائر)، قصيرة حجم اللامسة، وفي بعض الحالات طول الجسم القصير.

شكل 1
الشكل 1. ملامح التجديد. (أ) نظم أمثلة المنفخة تجديد الهياكل عن طريق الفم والجسم وفقا لNRSS. يظهر لوحة المسمى الكبار ملامح الحيوان ناضجة مع مخالب (ر) البلعوم (PH)، المساريقا (م) والإدراج مساريق (ميل). وتشير السهام البيضاء المنطقة حيث مطوي من المساريقا الانتقال إلى الإدراج مساريق، سلسلة من التلال من الأديم الباطن تمتد إلى محطة مجافي الفم. وتشكل هذه المنطقة المنفخة. وتبين الأسهم الصفراء المثالي الموقع المنفخة التنصيف. يظهر لوحة 0 خمس دقائق المنفخة بعد التنصيف، ولوحة 0 "نسخة مكبرة من واحدة من تلك المنفخة، مع جرح مفتوح في مركز وتحديد المرحلة 0 لNRSS. يظهر لوحة 1 لالمنفخة مع الجرح مغلق الآن، وتحديد المرحلة 1. لوحة 2 عروض المنفخة مع الأقواس الشعاعية التي أثيرت حول القطب عن طريق الفم، مع الأنسجة المتضخمة أدناه، الموافق المرحلة 2 (لوحات 0-2 وجهات نظر من نهاية الفم). يظهر لوحة 3 براعم اللامسة الناشئة في القطب عن طريق الفم (التي تواجه الحق) من المنفخة ممدود وتضخيم، والآن في مرحلة 3. لاحظ عناصر مساريق بدائية ومرئية والبلعوم يتشكل في منطقة مظلمة في نهاية طريق الفم. يظهر لوحة 4 ظهور مخالب حقيقية، فضلا عن "الفقاعات" عابرة في القطب عن طريق الفم، وتحديد المرحلة 4. المساريقا الخطية مرئية في المنفخة مبالغ فيها. كتلة مستديرة كبيرة مرئية داخل ورم هي مجهولة المنشأ وسيتم طرد عن طريق الفم. يظهر لوحة 5 تجديد كامل تقريبا تتميز بأكثر من أربعة المساريقا مطوي، فتاه تشكيلها بالكاملarynx وثمانية أو أكثر مخالب، التي تعرف بأنها المرحلة 5. (B، C) وجهات النظر مجافي الفم من المنفخة الفردية توضح ترتيب biradial ومورفولوجية المساريقا. في وجهة النظر هذه، تظهر المساريقا مطوي أن يكون لها انتفاخ في منتصف الطريق النسيج (رأس السهم الأخضر). والمرحلة 4 المنفخة أربعة أو أقل المساريقا مطوي، والمنفخة مرحلة 5 لديها أكثر من أربعة (C). يشار إلى المساريقا مع أو بدون ضفائر بواسطة السهام الخضراء أو الصفراء، على التوالي. رأس السهم الأسود في (C) يشير إلى مساريق مطوي امتدت شعاعيا. ويصور (D، E) إزالة غمد المخاطي من المنفخة. وتشير السهام البيضاء غمد المخاطية المحيطة المنفخة (D) التي ينبغي إزالتها كما في (E) قبل أن يحرز تجديد. أحيانا الأنسجة المتبقية (الأسهم الصفراء) يمكن محاصرين داخل غمد، وهذا أيضا ينبغي إزالتها. النجمة تشير القطبين عن طريق الفم، حيث علامةأد. الحانات حجم الحمراء هي 0.5 ملم في جميع اللوحات ما عدا A5 (1.0 ملم). تم تعديل وحات باء وجيم من هذا الشكل وطبعها بإذن من المرجع 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. آثار الكلوروكين على التجديد. لإثبات وجود تطبيق NRSS، اختبرنا آثار الكلوروكين، المانع من الالتهام الذاتي. وقد تم بتر المنفخة وضعت على الفور في 1 / 3X مضادة للغواصات تحتوي على 0.1٪ DMSO (مراقبة) أو الكلوروكين في 10 و 50 و 100 ميكرومتر. وسجل المنفخة في 24 ساعة فترات باستخدام NRSS. (A) صور نقطة النهاية الممثلة المأخوذة من الضوابط عندما وصلوا مرحلة 5. - D) صور الممثل المنفخة المعالجة الكلوروكين التي وصلت إلى "الهضبة التجدد" المرحلة 4. الكلوروكين تسبب عيوب مماثلة في تجديد في كل الجرعات التي تم اختبارها. كانت المشكلة الأبرز في عدم التجديد الكامل للالمساريقا ومخالب. مورفولوجيا الجسم غير طبيعي (على سبيل المثال، قصر القامة) وأيضا لاحظت في بعض الأحيان (C). ويظهر وجود (السهم الأبيض) وعدم (السهم الأسود) من الطيات في المنفخة المعالجة الكلوروكين في D (يتم سحب مخالب جزئيا). (E) رسم البيانات انطلاق لجميع المنفخة بوصفها وظيفة من الزمن (في 23 درجة مئوية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ملخصالملامح الرئيسية للمراحل NRSS. يوضح هذا الرسم البياني التغيرات المورفولوجية الرئيسية التي تحدد كل مرحلة في NRSS. يشار إلى اتجاه تحركات الأسهم والميزات الحمراء السهام الخضراء. مرحلة 0 يصور جرحا مفتوحا فقط بعد قطع (A)، ور). حواف الجرح تخضع إغلاق شعاعي تقلص في اتجاه مركز (B). تتميز المرحلة 1 من الإغلاق الكامل للجرح (C) ورفع أقواس بين التلال التي تواجه الفم (D)؛ مركز السطح عن طريق الفم (رأس السهم) هو الاكتئاب. المرحلة 2 لديها الظليل وضوحا من السطح عن طريق الفم (رأس السهم، E)؛ تبدأ المنفخة إلى استطال وتصبح ضيقة (F) مع براعم اللامسة والفقاعات وضوحا في قمة الأقواس (السهام). المرحلة 3 لديه براعم مستقرة اللامسة (رأس السهم، G) ويمكن النظر إلى البلعوم تجديد كما كثافة في القطب عن طريق الفم (كتلة البرتقال، رأس السهم في H (I) التي يجب أن تكون على الأقل مرتين طالما أنهم طويل القامة في تقاطع البلعوم (أنا). قد يكون مطوي أربعة أو أقل المساريقا في قدرتها الداخلية - خيوط المساريقية (J، J '). وتتميز مرحلة 5 بأكثر من أربعة المساريقا مطوي (K)، الذي يمكن أن يكون أفضل تقييمها عن طريق عرض من نهاية مجافي الفم (K). إعادة طبع بإذن من المرجع 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استخدام Nematostella كنموذج للالتئام الجروح وتجديد تزداد شعبية. وبالتالي، فمن المهم أن تكون قادرا على تصور أنماط شكلية بروتوكول معين قبل التحاليل الخلوية والجزيئية فعالة يمكن تعيين ومقارنة. Nematostella يكون على درجة عالية من "المرونة" التجدد، أن تكون قادرة على إصلاح أي ما يقرب من هيكل المفقود بتر في أي مكان، في مراحل ما بعد بلانولا الحياة. وهكذا، وقد درست مختلف المحققين تجديد الناتجة عن بتر أو جرح في مناطق مختلفة من الاورام الحميدة، في أعمار مختلفة وأحجام 7-18.

ونظام التدريج هو موضح هنا يتبع تحويل قسم موحد شكليا من المنفخة، بترت من نهاية مجافي الفم من الكبار، إلى ورم الأحداث الكامل تشريحيا تفتقر إلى الأنسجة التناسلية فقط (نحن لم يحدد بعد عندما تصبح هذه الأحداث مجدد جنسيا مature). ويتناول هذا النهج تجديد من رديم بسيطة من الأنسجة إلى واحدة من أقصى تعقيد القريب. بينهم خمسة المنفخة كما ينصح الحد الأدنى من حجم المجموعة لتطبيع للتقلب الفردية المحتملة، والبقاء على قيد الحياة. وبطبيعة الحال، فإن هذا العدد يمكن تعديلها لتتناسب مع أهداف تجريبية معينة ولكن بروتوكول NRSS يسمح 2 مل من المتوسط في المنفخة لنفي و"تأثير حجم" محتملة مثل تلك التي تم الإبلاغ عن أن تؤثر على تجديد في هيدرا 23.

وقد استخدمت مناهج أخرى لدراسة Nematostella تجديد البالغين شطر منتصف الجسم أو في نهاية طريق الفم، أو الأحداث مرحلة الزوائد 4 اللامسة شطر منتصف الجسم 7،11-18. وقد درست دراستين تجديد في المنفخة حررها الانشطار الطبيعي 16،18، والنهج باستخدام المنفخة بتر وقد ظهرت في الآونة الأخيرة مع NRSS 8،9. كل من هذه الأساليب المتنوعة له مزاياه الخاصة، ويمكن معالجة المسائل فريدة من نوعها حول regeneratiلقد العمليات التي تحدث في ظل الأنظمة بتر أو جرح مختلفة، وبين الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين مختلف. بروتوكول NRSS لبتر المنفخة والتهديف، كما هو موضح في هذه الدراسة، يولد مجموعة موحدة نسبيا من المنفخة لدراسة منهجية والابتعاد عن الاختلاف في حجم المنفخة، وتكوين الأنسجة، وتطور لاحق للتجديد لاحظ مع عرضية الطبيعي الانشطار 18،24. على الرغم من أن المنفخة بتر يتوافق إلى حد ما الوضع الطبيعي من التكاثر اللاجنسي في Nematostella، وقد لوحظت اختلافات الجزيئية بين التجديد الناتجة عن الانشطار الطبيعي وبتر في منتصف الجسم أو في المنفخة 16،18،24. سواء المنفخة التي تنتجها طريقة البتر هو موضح هنا أو الطبيعي المعرض الانشطار مثل هذه الخلافات لا تزال يحدد لاحقا.

وهناك عدد قليل من القضايا التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح مع بتر تربية، والتقنيات التهديف هو موضح هنا. الاورام الحميدة التي اختيرت لشو بترالإبقاء دينار في نفس درجة الحرارة، مطابقة لحجم المنفخة والتاريخ التغذوية وإذا سن ممكنة (على الرغم من أن هذا الأخير لم يتم اختباره بشكل منهجي لتحديد ما إذا كان هناك تأثير العمر على الاختلاف في مرحلة التقدم). الحصول على جرح مفتوح مع مشرط معقم حاد وجود شفرة منحنية المهم بالنسبة الملاحظات الشكلية من التئام الجروح بين المرحلة 0 والمرحلة 1. عند تضخم المنفخة وهز نصل مقوس من مشرط على أنسجة البالغين، وبترت في اقتراح واحد ويمكن نقلها بسرعة للعلاج بشكل جيد من قطع الطبق. بتر التي تشمل مساريق أو التي هي يجب التخلص منها نتيجة التلاعب مادية واسعة النطاق.

ممارسة تنظيم المنفخة غير المعالجة للحصول على شعور من الاختلافات الفردية في عدد السكان التي يجري اختبارها. الاختلاف بين المنفخة الفردية هو أقل عن المراحل الأولى. على سبيل المثال، كل المنفخة هي في المرحلة 0 في 0 د ب أ. في نفس الطريق كل المنفخة تصل إلى المرحلة1 في التزامن في 1 (د.ب.أ). ظهور المرحلة 2 قد يكون من الصعب على المراقب أن يتبين لأن 'التضخم' هو شرط النسبية التي تحققت، ولكن بنسبة 2 (د.ب.أ) مع اختلاف بسيط. ظهور صحيح علامات مخالب التقدم إلى مرحلة 3. قد يكون غامضا في مخالب تجديد قبل ظهور "شرنقة" غشائي أن يعوق التصور من المهد اللامسة تحت. إذا كسوة الغشائي لم يتم إزالتها سابقا، ينبغي أن يتم ذلك حتى الآن. سوف إزالة الغشاء مع منتاش يميل غرامة تحرر المنفخة تجديد. التمييز بين المرحلة 4 و 5 هو عدد المساريقا مطوي. المرحلة 4 أربعة أو أقل المساريقا مطوي، ومرحلة 5 لديه 07:55 المساريقا مطوي. في حين ضفائر يمكن ملاحظتها في منظر جانبي، العدد الدقيق للالمساريقا مطوي هو أفضل الملحوظ مع وجهة نظر مجافي الفم.

أحد التحديات في دراسة الكبار Nematostella تجديد من فيزسا رديم، وبالفعل مع الأنسجة قطع من المواقع بتر الأخرى، هي وضوح متنوعة من الأنسجة الحية. لمبة من المنفخة واضحة نسبيا في البالغين سليمة، ولكنه يصبح غير شفاف بدلا بسبب تقلص الأنسجة بعد البتر. وضوح يعود تدريجيا (المرحلة 2) مرة واحدة ليغلق الجرح (المرحلة 1) ويبدأ الحيوان لتضخيم، ولكن حتى ذلك الحين المنطقة حول موقع الجرح حيث الأنسجة والهياكل والتجدد بنشاط بقايا تحجب نوعا ما الأنسجة الكثيفة (وخاصة المرحلة 3). زيادة التضخم عادة ما ترافق المرحلة 4 و 5. التثبيت تليها توضيح بصري سيحل يكاد يكون من المؤكد ما يحدث في نهاية عن طريق الفم، ولكن أكثر إفادة قد تكون حية، وأنسجة محددة للصحفيين المعدلة وراثيا التي يمكن رصدها لمضان وتصور أكثر سهولة 15، 25-30.

والمنفخة بترت من الواضح أنه لا يمكن إطعام لأنه يفتقر إلى مخالب والفم والمساريقا (التي ترعى الغدد الهضمية)، وبالتالي requiحلقة تجديد هياكل الجسم المفقودة إلى أن يتحقق من خلال تعبئة احتياطي المواد الغذائية من مصادر غير الغذائية. والمنفخة من المحتمل أن تحقيق ذلك هي عن طريق الالتهام الذاتي، والتي هي غارقة السيتوبلازم، العضيات والمكونات الخلوية الأخرى داخل الخلية ومعالجتها من خلال آلية تعتمد على يحلول لإنتاج الطاقة والمركبات لعمليات الابتنائية 31-33. نجد أن علاج المنفخة مع مثبط يحلول، الكلوروكين، يسبب تجديد غير طبيعي للالمساريقا ومخالب، والتشكل الهيئة العامة، مشيرا إلى أن هناك حاجة الالتهام الذاتي للتجديد العادي من الهياكل عن طريق الفم والجسم. الالتهام الذاتي ينظم وقف وظائف الخلية 34-36، ويلعب دورا أساسيا في تجديد في حيدرة، المستورقات، والزرد 37-41. مطلوب مزيد من التحليل لفهم كيف يؤثر الالتهام الذاتي Nematostella تجديد على المستويات الخلوية والجزيئية، ولكن يظهر لنا أول تجربة تمرير الأداة المساعدة من استخدام NRSS كوسيلة من وسائل فحص سريع للجزيئات الصغيرة التي قد تؤثر على التجدد.

العمليات الوراثية، الجزيئية والخلوية التي تنظم تجديد في Nematostella هي فقط في مرحلة بدائية من التفاهم، ولكن هذا النموذج المنبثق لتجديد لديه ذخيرة المتنامية من الأدوات لتحليل التعبير الجيني والجينات. مع الجينوم المشروح، عدد كبير من علامات وراثية الإقليمية والأنسجة محددة، وأساليب قوية لtransgenesis، الطفرات، الأنسجة والفحص المجهري، Nematostella عود للكشف عن الآليات التي تحكم anthozoan تجديد القراصات وكشف ما إذا كانت عمليات التجدد لها متشابهة أو فريدة من نوعها بين الكائنات المجوفة وmetazoans بشكل عام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل الخلايا الجذعية نيويورك العلوم (NYSTEM C028107) منحة لGHT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 mL Carolina Biological Supply 741004 250 mL
Glass Culture Dish, 1,500 mL Carolina Biological Supply 741006 1,500 mL
Polyethylene transfer pipette, 5 mL USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex Petri dish, 100 mm diameter Corning 3160 can substitute other glass Petri plates
Sterile 6-well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12-well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24-well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000 mL PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 - 40X magnification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. The Boxwood Press. (1986).
  2. Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. Jean & Herman Verbeek. (1744).
  3. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11, (10), 710-722 (2010).
  4. Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56, (6-8), 411-423 (2012).
  5. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233, (1-2), 53-66 (2013).
  6. Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226, (2), 257-267 (2003).
  7. Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16, (12), 28449-28471 (2015).
  8. Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10, (4), e0124578 (2015).
  9. Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227, (3), 211-220 (2014).
  10. Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242, (11), 1320-1331 (2013).
  11. Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8, (5), 916-923 (2013).
  12. Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2, (2), 217-226 (2013).
  13. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
  14. Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240, (12), 2673-2679 (2011).
  15. Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (1), 104-108 (2010).
  16. Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219, (2), 79-87 (2009).
  17. DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
  18. Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
  19. Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212, (2), 99-103 (2002).
  20. Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83, (3), 33-40 (2016).
  21. Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
  22. Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215, (12), 618-630 (2005).
  23. Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87, (2-3), 191-203 (2007).
  24. Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
  25. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
  26. Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
  27. Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370, (1684), (2015).
  28. Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139, (2), 347-357 (2012).
  29. Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141, (24), 4681-4689 (2014).
  30. DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
  31. Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, (8), 461-472 (2015).
  32. Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47, (10), 2065-2088 (2015).
  33. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221, (1), 3-12 (2010).
  34. Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73, (3), 475-496 (2016).
  35. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, (6), 830-849 (2013).
  36. Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70, (1), 89-103 (2013).
  37. Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
  38. Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21, (4), 547-556 (2014).
  39. Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15, (3), 279-292 (2010).
  40. Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
  41. Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14, (2), 116-125 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics