Meten van de stijfheid van

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bae, Y. H., Liu, S. l., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (116), e54630, doi:10.3791/54630 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Arteriële verstijving is een belangrijke risicofactor en biomarker voor cardiovasculaire ziekte en een kenmerk van veroudering. Atomic force microscopie (AFM) is een veelzijdig analytisch hulpmiddel voor het karakteriseren viscoelastische mechanische eigenschappen voor verschillende materialen, variërend van harde (plastic, glas, metaal, enz.) Oppervlakken van cellen op een substraat. Het is wijd gebruikt om de stijfheid van de cellen te meten, maar minder vaak gebruikt om de stijfheid van de aorta meten. In dit artikel zullen we de procedures voor het gebruik van AFM in contact modus om de ex vivo elasticiteitsmodulus van onbelaste muis slagaders te meten te beschrijven. We beschrijven onze procedure voor het isoleren van de muis aorta, en vervolgens gedetailleerde informatie voor de AFM analyse. Dit omvat stap-voor-stap instructies voor het richten van de laserbundel, kalibratie van de veerconstante en de doorbuiging gevoeligheid van de AFM sonde, en verkrijging van kracht curves. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor data analysis van de kracht curves.

Protocol

Animal werk in deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies van de Universiteit van Pennsylvania. De methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen uitgevoerd.

1. Voorbereiding van de muis en isolatie van de Aorta

  1. Verdoven een muis met ketamine (80 - 100 mg / kg), xylazine (8-10 mg / kg) en acepromazine (1-2 mg / kg) intraperitoneaal. Bevestig anesthesie met een staart pinch-test. Zodra de muis is volledig verdoofd, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie.
  2. Plaats de muis op zijn rug en speld de muis om een ​​dissectie board. Reinig de buik met 70% (v / v) ethanol doekjes.
  3. Knijp de huid op het midden van de lijn en een kleine initiële incisie met middelgrote microchirurgie schaar op de buik. Houd de huid met een tang, gebruik middelgrote microchirurgische schaar om de huid en het buikvlies gesneden uit de buik tot het borstbeen.
  4. Knip de ribben aan both kanten met middelgrote microchirurgie schaar. Verwijder voorzichtig de longen en de lever met een klein formaat microchirurgie schaar, en laat het hart en de aorta. Breng de muis en dissectie boord om een ​​dissectie microscoop.
  5. Pak het vet rond de aorta met kleine tang en gebruik maken van kleine schaar om zorgvuldig weggesneden vet rond de aorta.
  6. Voorzichtig pak de aorta met een tang, maak een model met klein formaat microchirurgische schaar op het begin van de aorta ascendens en een snede aan het einde van de neergaande aorta, net boven de abdominale aorta.
  7. Breng de ontleed aorta een 60-mm schotel met 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; zonder calcium en magnesium).
  8. Blijven om weg te ontleden alle resterende vetweefsel uit de aorta met behulp van kleine formaat microchirurgie schaar. Gebruik maken van kleine schaar om de aorta in de lengterichting te openen.
  9. Met kleinschalige microchirurgische schaar om een ​​klein stukje (~ 2 x 4 mm) van de afdalende aorta en aorti gesnedenc boog voor AFM-analyse (figuur 1). Plaats het weefsel in een 60-mm kunststof schaal en het vochtig te houden in een druppel PBS.

Figuur 1
Figuur 1:. Een beeld dat de locatie van de verschillende Aorta segmenten in een muis De aorta werd geïsoleerd van het hart naar het membraan, en een klein deel van de neergaande aorta en de aortaboog werden gebruikt om de elastische moduli bepalen. Schaal bar, 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiden Tissue Monsters voor de AFM Metingen

  1. Verwijder de PBS voorzichtig met een lab-wipe zonder het aanraken van de aorta. Wees er zeker van dat de luminale zijde van het weefsel naar boven wijst.
  2. Voorzichtig lijm elk uiteinde van de geopende aorta aan de plaat door de add ing 5-10 pl cyanoacrylaat kleefmiddel met een gel-lading-punt (figuur 2).
    OPMERKING: De hoeveelheid lijm die nodig is om het weefsel vast bevestigt aan elk uiteinde moet empirisch worden bepaald. Het is essentieel dat de aorta niet tijdens dit proces wordt gerekt.
  3. Controleer de gelijmde aorta om er zeker van dat het niet gevouwen of zweven. Na de lucht-drogen van de lijm op de aorta (30-60 sec), zachtjes toe te voegen PBS en dompel het monster.
    LET OP: Voorbereiding van de AFM (stappen 3-5) kunnen worden uitgevoerd terwijl het weefsel wordt voorbereid voor analyse.

Figuur 2
Figuur 2: cartoon van een aortasegment gelijmd op een 60 mm kweekschaal gebruikt cyanoacrylaat lijm Het cyanoacrylaat kleefmiddel wordt aangebracht op de rand van een aorta monster voorbereiding AFM metingen..com / files / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Het laden van de Probe

  1. Monteer een vloeistof sonde houder op de sonde belasting stand.
  2. Met een pincet, schuift een siliciumnitride AFM probe (0,06 N / m cantilever) met een bolvormige top (We hebben gebruik gemaakt van een 1-um diameter SiO 2 deeltjes maar grotere afmetingen kunnen ook worden gebruikt) aan de houder probe. Zorg ervoor dat de AFM sonde stevig is bevestigd aan de houder van probe.
  3. Schuif de sonde houder op de Z-scanner monteren van de AFM hoofd, en ervoor te zorgen dat de houder sonde stevig vastzit.

4. Het uitlijnen van de laser op de Probe

  1. Open de AFM software. Kies het experiment op de software; Experiment Categorie naar Contact Mode, Experiment Group naar Contact Mode in vloeistof en Experiment naar Contact Mode in vloeistof. Klik op Laden experiment in de software; dit zet de laser.
  2. Voeg 3 ml gedestilleerd water tot een 50-mm glazen onderste schaal en leg de schotel op het stadium van de laser uitlijningeenheid. Deze eenheid vereenvoudigt het focusseren van de laserstraal op de achterzijde van de cantilever.
  3. Monteer de AFM hoofd rechtop op de laseruitlijning eenheid en de stroomvoorziening op de laser uitlijning unit. Voeg ongeveer 50 ul gedestilleerd water om een ​​druppel op de AFM tip vormen.
  4. Met behulp van de joystick, hoe lager de AFM hoofd, zodat de AFM tip contact met water in de schotel maakt. Als geen contact wordt gemaakt tussen de AFM tip en water in de schaal, voorzichtig verhogen de schotel totdat contact wordt gemaakt. Pas de scherpstelling, helderheid en XY-positie, zodat de AFM tip is met het oog op het LCD-scherm van de uitlijning unit.
  5. Plaats de laserspot op de punt van de AFM probe door aanpassing van de laserpositionering knoppen van de AFM weg. Met behulp van de detector positionering knoppen op de AFM hoofd, stel de ponerenion van de fotodiode tot waarden tussen 0 en -1 V worden verkregen voor de vertikale afbuiging en ~ 0 V wordt verkregen voor de horizontale afbuiging.
  6. Controleer de laser somsignaal wordt gemaximaliseerd. Herhaal eventueel stap 4.5 worden bijgestuurd de positie van de laserstraal op de AFM tip en de positie van de fotodiode de maximale somsignaal verkrijgen.
    Opmerking: Het kan nodig zijn de AFM probe hiervan op de houder probe maximaal somsignaal zelfs als stap 4,5 wordt herhaald verkrijgen.

5. Het kalibreren van de doorbuiging gevoeligheid en Spring Constant van de AFM Probe

  1. Maak een kras op een 60 mm cultuur schotel met een pincet en vul de schaal met gedestilleerd water. Plaats de cultuur schotel op het monster houder plaat. In dit geval zet de schaal op het gemotoriseerde XY scan fase van een omgekeerde microscoop.
  2. Plaats een magneetplaat houder boven op de plaat te houden het veilig tijdens de beeldvorming.
  3. Klik OPMERKING: Deze stap is zeer belangrijk omdat het voorkomt dat het breken van de AFM tip.
  4. Plaats de AFM hoofd op de microscoop podium.
  5. Gebruik de microscoop te richten op de kras op de plaat. Gebruik de joystick, of klik op de pijl 'Down' in het navigatiemenu te langzaam en voorzichtig laat de AFM sonde in de PBS. Plaats het hoofd iets boven de kras in de plaat.
    OPMERKING: als de beginpositie van de AFM kop dichter bij het monster, de tijd nemen wordt aanzienlijk verkort.
  6. Alvorens, past de positie van de laserstraal op de AFM tip en de positie van de fotodiode het maximumbedrag signaal vergaren als nodig.
  7. Selecteer een tip soort door te klikken op Wijzigen Probe in het menu Instellingen. Klik op Controleer parameters en stel de parameters: scanformaat tot 0, Scan Rate tot 1 Hz, Sample / lijn naar 256 en doorbuiging Setpoint tot 20 nm. Klik Engage. Het venster Status Engage blijft open tot de sonde contact met het oppervlak van de plaat maakt. Na het inschakelen van de sonde, klik Ramp.
  8. Klik Expanded Mode in het menu Scan Toolbar en stel de parameters: Ramp Size tot tussen 500 nm en 1 urn, Ramp Rate tot 2 Hz, aantal monsters 256, Tip Radius tot 500 nm, Sample Poisson Ratio tot 0,5 (gaat uit van het materiaal te meten is volkomen onsamendrukbaar), Tip Half Hoek op 0, Trigger Mode om Relatieve en Trigger Threshold om tussen 20 en 100 nm.
  9. Klik Ramp Continue in het menu Ramp Toolbar te OBTAin een krachtenkromme op de plaat (figuur 3A). In deze kracht curve, ingesteld kanaal 1 tot en met afbuiging fout.
    LET OP: Dit zal de software om de resultaten als verticale afbuiging vs. z positie grafiek.
    1. Klik op de links of rechts uiteinden van de kracht curve en sleep de cursor naar een lineaire gebied van de kracht curve (figuur 3A, gestippelde rode lijnen) omvatten. Gebruik deze twee lijnen om de grenzen van de hellende regio te markeren om fit te zijn met een rechte lijn.
  10. Selecteer Ramp in de werkbalk en klik op Update gevoeligheid. Noteer de waarde en herhaal deze stap nog vier keer. Selecteer Calibrate in de werkbalk en klik vervolgens op Detector. Ingang een gemiddelde waarde van vijf metingen in het vak Deflection gevoeligheid.
  11. Klik Trek 2-3 keer om de AFM hoofd op te tillen. Deze stap is belangrijk ter voorkominginteractie tussen de AFM tip en de plaat tijdens de thermische tune proces. Klik Thermal Stem af op de werkbalk.
  12. Stel Thermal Tune Bereik van 1 - 100 kHz (Deze informatie kan worden verkregen uit de catalogus van de fabrikant) en de doorbuiging gevoeligheid Correctie op 1.144 voor v-vormige uitkragingen en 1.106 voor rechthoekige uitkragingen.
  13. In de Thermal Tune menu op Acquire gegevens aan een thermische tune curve (Figuur 3B) te verkrijgen. Met de AFM software plaats rood stippellijnen aan weerszijde van de curve (zie figuur 3B) slepen met de muis van de rand van de grafiek om de grenzen definiëren voor montage. Selecteer de Lorentz (Air) of de eenvoudige harmonische oscillator (Fluid) model, afhankelijk van die beter past bij de data.
  14. Klik Fit Data, dan berekenen Spring K en sla deze waarde. Opnieuwturf de veerconstante kalibraties meerdere malen en gebruik maken van de gemiddelde waarde. Klik Trek meerdere malen.
  15. Verwijder de AFM hoofd van de microscoop podium en plaats het op de uitlijning unit. Haal de schotel uit de microscoop podium.

figuur 3
Figuur 3: AFM Force Curves gebruikt in de kalibratie van de AFM Probes. (A) Een representatief AFM krachtenkromme (a ijkkromme). De extensieportie van de krachtcurve tussen de verticale rode gestreepte lijnen gebruikt om de cantilever doorbuiging gevoeligheid te bepalen. (B) een eenvoudige harmonische oscillator fit grafiek gebruikt om de veerconstante van de cantilever zoals eerder beschreven 20 te berekenen. Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.

Ex Vivo

  1. Plaats de 60-mm cultuur schotel met de aorta weefsel op de microscoop podium, en zet de plaat met de magnetische plaat houder.
  2. Plaats de AFM hoofd op de microscoop podium. Zorg ervoor dat de AFM sonde niet contact met de aorta maakt maar voorzichtig contact maakt met PBS en vormt een meniscus. Indien nodig, plaats de AFM hoofd op de uitlijning apparaat en klik op Trek totdat er voldoende ruimte om contact te voorkomen, plaats dan de AFM hoofd op de microscoop podium.
  3. Klik op Navigeren. Met behulp van de joystick of klikken op 'Down' pijl, langzaam de AFM sonde naar de cantilever boven de aorta te lokaliseren. Pas de fotodiode positie met behulp van de detector positionering knoppen op de AFM hoofd indien nodig.
  4. Klik Engage om de cantilever contact met de aorta te maken.
  5. Zodra deaorta is geactiveerd, ervoor te zorgen dat het piëzo-centrum is stabiel en klik Ramp. Als het piëzo centrum fluctueert, kan dit het gevolg van een onjuiste ingrijping zijn. Trek de sonde en verhoging van de verticale verschuiving van de laser op de fotodiode door kleine stappen (~ 0,5 V) en opnieuw in te schakelen.
    1. Ook als de sonde is ver boven het monster oppervlak, handmatig de sonde verlagen dichter bij het monster oppervlak alvorens opnieuw aantrekkelijk. Als de vorige stappen niet de fluctuatie te elimineren, probeer dan het uitwisselen van de sonde.
  6. Stel de Ramp Size tot 3 pm, de Trigger Mode om Relatieve en de Trigger Threshold tot 100 nm en klik Ramp Continuous. Vast dat het contactpunt tussen de probe en het monster plaatsvindt bij ongeveer het midden naar de onderste ¾ van de Z helling cyclus. Als dit niet wordt nageleefd, los te maken van het monster, pas de Ramp grootte als nodig is, en opnieuw deel te nemen van het monster.
  7. Klik Microscoop in de menubalk en vervolgens Engage instellingen. Verander de SPM Trek tot 30 pm. Klik Ramp Continue in het menu Ramp Toolbar.
  8. Na het observeren van de kracht curve, klikt u op Opname in de menubalk en vervolgens Capture bestandsnaam. Voer een gewenste bestandsnaam met het einde "0,000" (dit zal toestaan ​​extra vastgelegde bestanden te verhogen in nummer 1). Selecteer een aangewezen-map en de gegevens op te slaan.
  9. Klik op Capture in het Opnamewerkbalk menu. Klik op te trekken en vervolgens te navigeren. Gebruik de joystick of software bedieningselementen de cantilever stand via een ander gebied van de aorta (naast de eerste meetpunt, zie figuur 4).
  10. Klik Engage, Ramp en Ramp Continu, respectievelijk. Na het observeren van de kracht curve, klikt u op Stoppen Capture.
  11. Herhaal stap 6,9-6,10. Capture ten minste 5 metingen per gebied zoals getoond in Figuur 4 Opmerking: Wij doorgaans laat 15-25 force curves 3-5 verschillende lokaties in elk weefsel zoals getoond in Figuur 4, respectievelijk..

figuur 4
. Figuur 4: Beeldverhaal van een Cantilever nadert en inspringen het weefsel (Gebied 1) Dit AFM meting herhaald tot 15-25 keer 3-5 verschillende locaties (gebieden 1-5) in elke slagader om de stijfheid van de totale verwerven weefselmonster. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Data Analysis

  1. Open kracht curve analyse software.
  2. click zoeken en openen in de menubalk, en dubbelklik op een bestand te analyseren.
  3. Klik op Wijzigen Force Parameters in de werkbalk menu om de doorbuiging gevoeligheid, Spring Constant, Tip Radius, Tip halve hoek en Poisson-ratio te controleren. Het wijzigen van de parameters vink het vakje ernaast en voer de juiste waarden in de nieuwe waarde kolom. Klik vervolgens op Uitvoeren.
  4. Als kracht curves zijn lawaaierig, klikt Boxcar Filter en stel ingangen voor Direction uit te breiden, Gemiddelde punten tot 3 en Filter Orde 0 Th. Klik op Uitvoeren om de gegevens glad.
  5. Klik Baseline Correction in de menubalk en stel ingangen voor Direction uit te breiden, Plot Units te dwingen, Type in Separation, Correctie Orde 1 e en uitbreiden Baseline Source Uitvoeren.
  6. Klik Inspringen op de werkbalk menu en stel ingangen voor Active Curve Extended, Fit Method naar Contact Point Based, Contact Point Algoritme als Fit Variable Treat, Inclusief kleefkracht op Nee, Max Force Fit Boundary tot 30%, Min Force Fit Boundary aan 0% en Fit Model voor Hertz (Spherical).
    LET OP: In onze metingen, was significant hechting tussen de tip en sample (een negatieve uitslag van de cantilever in het terugtrekken curve) zelden waargenomen. In gevallen waarin een dergelijke hechting wordt waargenomen, moet het juiste model (DMT of JKR) worden gebruikt voor analyse 18,19.
  7. Sla de waarden van de Young's modulus. Analyseer de Young (elastische) modulus van elk van de 3- 5 delen (5 werking curves per gebied) die op een kleine afstand van elkaar zoals weergegeven in figuur 4.
    OPMERKING: Om artefacten te verwijderen, uit te sluiten Young's modulus> 100 kPa (normaal ~ 10% van de totale afmetingen) uit de analyse.
  8. Berekenen van een gemiddelde Young's modulus voor elk van de 3-5 gebieden (die zijn gemeten) en deze waarden gebruiken die een gemiddelde elasticiteitsmodulus berekenen van de aorta als geheel.
    OPMERKING: Minimaal 3 vaker 4-6 afzonderlijke aorta's worden gebruikt voor een accurate bepaling van arteriële stijfheid te verkrijgen. De uiteindelijke resultaten zijn weergegeven als gemiddelde + SEM van "n" onafhankelijke experimenten. Het exacte aantal benodigde aorta zal uiteraard afhangen van de mate van nauwkeurigheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 5A toont een fase contrast beeld van de dalende (thoracale) aorta van een 6 maanden oude mannelijke C57BL / 6 muis. De AFM cantilever is op zijn plaats direct boven het weefsel en klaar voor inspringen. Figuren 5B en 5C tonen representatieve kracht curves verkregen door AFM inkeping in contact mode. Groene lijnen getoond in figuren 5B en 5C geven de best passende curves verkregen met de Hertz model van een bol. In figuur 5D, de gemiddelde stijfheid van de afdalende aorta en aorta bogen werden uit drie afzonderlijke muizen zoals beschreven in de tekst. Merk op dat de neergaande aorta en de aortaboog vertegenwoordigen gebieden van laminaire en verstoorde stroming resp. Niettemin zijn (mechanisch ongeladen) elastische moduli vergelijkbaar zoals bepaald met AFM.

0 / 54630fig5.jpg "/>
Figuur 5: de geanalyseerde Force-Inspringen Curves en stijfheid Data (A) Fase contrast vergroting toont een AFM cantilever over een muis dalende aorta ex vivo.. Schaal bar, 100 micrometer. (BC) Een set van twee representatieve force-inspringen curves verworven voor (B) de dalende aorta en (C) de aortaboog. (D) Mean stijfheid van de muis dalende aorta en de aortaboog werd bepaald als hierboven omschreven. Fout balken geven de gemiddelde + SEM; n = 3 onafhankelijke biologische herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM inspringing kan worden gebruikt om de stijfheid (elasticiteitsmodulus) van cellen en weefsels te karakteriseren. In dit document, bieden we uitvoerige stap-voor-stap protocollen de afdalende aorta en de aortaboog in de muis isoleren en bepalen de elastische moduli van deze slagaderlijke gebieden ex vivo. We hebben nu samen te vatten en bespreken de technische problemen en beperkingen van de in dit artikel beschreven methode.

Verschillende technische problemen kunnen voordoen in de isolatie en analyse van de muis aorta gezien hun klein en dun natuur. Als het schoongemaakte arteriën longitudinaal geopend, moet erop worden gelet de intima (luminale oppervlak) wanneer de elastische modulus gegevens verzameld niet te verstoren. Overtollige PBS in het uiteindelijke monster schaal voorkomt goede verlijming van de slagaders naar het gerecht, en dit moet zorgvuldig worden verwijderd met behulp van een papieren tissue zonder het aanraken van de slagader voor het verlijmen. Merk echter op dat de geïsoleerde ader kan vasthouden aan de papieren tissue while probeert overmatige PBS te verwijderen, en dit kan het monster beschadigt. Terwijl het lijmen van de slagaders naar de kweekschaal, is het uiterst belangrijk dat de slagader niet onder spanning staat en dat slechts een kleine hoeveelheid lijm wordt aangebracht bit-voor-bit aan de uiteinden van de slagader. Bij het uitvoeren van de AFM-inspringing, is het essentieel om te voorkomen sonderen aan de uiteinden van de slagader waarin het hechtmiddel is aangebracht. Ten slotte, vers geïsoleerde aders worden gebruikt voor de metingen van de elasticiteitsmodulus, de verstreken tijd van de oogst tot meting worden geminimaliseerd.

Aangezien de bolvormige uiteinden in deze studie een straal van 500 nm, kan een inkeping diepte van 500 nm nauwkeurig worden geanalyseerd met de Hertz model. Deze bolling diepte zou correleren met de bovenste laag van endotheelcellen in de intima 21. kan worden gebruikt - de mechanica van de sub-endotheliale lagen arteriële monsters grotere colloïdale probes (20 urn diameter 10) sondevoor inspringen en veranderingen in de berekende stijfheid inkeping diepte kan worden vastgesteld 22,23. Ook omdat biologische monsters meestal viscoelastische plaats van zuiver elastisch spanningsrelaxatie metingen (controle op de bederf uitgeoefende kracht bij constante inkeping diepte) kan worden gebruikt om de viskeuze component van arteriële mechanische eigenschappen 24,25 bepalen.

Een mogelijke beperking van de AFM analyse is de grootte van de scan, die alleen meet een klein gebied van het weefsel. De meeste biologische monsters, waaronder bloedvaten en cellen, niet topografisch en biomechanisch homogeen en heterogeniteit kan mogelijk leiden tot artifactually grote variaties van de elasticiteitsmodulus afhankelijk gladheid van de inkeping site, inspringen diepte en de hoeveelheid kracht aangebracht op het monster oppervlak. Om een ​​representatieve gemiddelde waarde van de totale elastische modulus te verkrijgen, is het belangrijk om herhaalde AFM-inkeping a voerent meerdere willekeurige plaatsen door de slagaders, zie figuur 4. Verder gebruiken we een geschikte grootte bolvormige tip, als eerdere studies hebben aangetoond dat AFM-inspringing met een scherpe piramidevormige punt resulteerde in hogere ramingen van de elasticiteitsmodulus en beschadigd zacht biologische monsters 26,27.

Hoewel onze ex vivo AFM metingen van arteriële stijfheid blijken goed overeenkomen met moleculaire merkers van gladde spiercellen verstijving 2, is het belangrijk te realiseren dat deze arteriële monsters niet mechanisch belast en mechanische belasting is waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de totale arteriële mechanica. Vergelijkingen van arteriële stijfheid, zoals bepaald door de AFM, myography (een ex vivo methode compatibel met mechanische belasting) 28 en pulse-wave velocity (een in vivo meting van de arteriële stijfheid) 29 zal waarschijnlijk de meest uitgebreide kennis van arterial mechanica.

We hebben de AFM beschreven in contact modus om de ex vivo stijfheid van de muis slagaders te meten. Deze methode schat de gemiddelde weefsel stijfheid door willekeurig inspringen op meerdere gebieden van de aorta. Om de ruimtelijke verdeling van de stijfheid van de belangrijkste regio's van de weefsels te onderzoeken, heeft een recente paper AFM gebruikt in force-volume-modus 30. Deze aanpak gelijktijdig kreeg een kaart van stijfheid variaties en een hoge-resolutie afbeelding van topografische oppervlak van het weefsel. Naast het meten van de stijfheid van weefselmonsters kan de AFM kracht-volumemodus worden gebruikt in cellen om de ruimtelijke verdeling van intracellulaire stijfheid 10,31 controleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioScope Catalyst AFM system Bruker
Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope Nikon Instruments
Silicon nitride AFM probe Novascan Technologies PT.SI02.SN.1 0.06 N/m cantilever; 1 µm SiO2 particle
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-10 See section 1.4
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 See section 1.8
Fine Scissors-ToughCut Fine Science Tools 14058-11 See section 1.4 (medium sized)
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08 See section 1.6 (small sized)
60 mm TC-treated cell culture dish Corning 353004
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x Corning 21-031-CM Without calcium and magnesium
Krazy Glue instant all purpose liquid Krazy Glue KG58548R See section 2.2
Gel-loading tips, 1 - 200 µl Fisher 02-707-139 See section 2.2
Tip Tweezers Electron Microscopy Sciences 78092-CP See section 3.2
50-mm, clear wall glass bottom dishes TED PELLA 14027-20 See section 4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189 (2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585 (2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57 (2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122 (2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974 (2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. e3733 (2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics