रक्त कोशिकाओं से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पीढ़ी सेंडाइ वायरस और centrifugation का उपयोग

Developmental Biology

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Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

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Abstract

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) की हाल ही में विकास ने साबित कर दिया है कि परिपक्व कोशिकाओं दैहिक एक undifferentiated, pluripotent राज्य के लिए लौट सकते हैं। आदि केरेटिनकोशिकाओं, मूत्र कोशिकाओं, fibroblasts, प्रारंभिक प्रयोगों आमतौर पर त्वचीय fibroblasts के साथ किया गया: अब, reprogramming वयस्क दैहिक कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ किया जाता है। हालांकि, इस रोगियों से fibroblasts प्राप्त करने के लिए एक आक्रामक शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की आवश्यकता है। इसलिए, इस तरह के रक्त और मूत्र कोशिकाओं के रूप में निलंबन कोशिकाओं, प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करने की सुविधा की वजह से reprogramming के लिए आदर्श माना जाता था। यहाँ, हम परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से IPSC पीढ़ी के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। एक नया, मैट्रिक्स लेपित प्लेट का उपयोग करने के लिए centrifugation क्रमानुसार transduced PBMCs चढ़ाना द्वारा, इस प्रोटोकॉल आसानी से IPSC कालोनियों प्रदान कर सकते हैं। इस विधि को भी गर्भनाल रक्त कोशिकाओं mononuclear (CBMCs) के लिए लागू है। इस अध्ययन में यह एक सरल और कुशल prot प्रस्तुतPBMCs और CBMCs के reprogramming के लिए ocol।

Introduction

स्टेम कोशिकाओं को पिछले कई दशकों से 1 के लिए नैदानिक चिकित्सा में सबसे आकर्षक सामग्री में से एक रहे हैं। स्टेम कोशिकाओं की आकर्षक गुण pluripotency और आत्म को नवीनीकृत करने की क्षमता है। 1981 में, पहले भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) माउस भ्रूण 2 से अलग थे। हालांकि, जब तकनीक मानव भ्रूण के लिए लागू किया गया था, यह कई नैतिक मुद्दों का सामना करना पड़ा।

2006 में, जब डॉ यामानाका और उनकी टीम माउस दैहिक कोशिकाओं से पहले pluripotent सेल reprogrammed, स्टेम सेल के क्षेत्र में अपनी संभावना आ गया और ब्याज 3 फिर से उभार दिया गया था। कई कारकों परिभाषित पहुंचाने रखकर स्टेम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक वयस्क दैहिक कोशिकाओं से "प्रेरित" थे, और इस तरह का नाम दिया गया "प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs)।" 2007 में, इस तकनीक मानव कोशिकाओं 4 के लिए लागू किया गया था, ESCs की सटीक विशेषताओं के साथ कोशिकाओं को बेदखल लेकिन नैतिक बहस से कोई नहीं। सैद्धांतिक रूप से, आईपीएससीएस किसी भी व्यक्ति या रोगी से प्राप्त किसी भी प्रकार की कोशिका से उत्पन्न हो सकता है। रोगी विशेष IPSCs एक संभावित उपकरण है कि रोग phenotypes और प्रत्येक व्यक्ति के मरीज की epigenetic की स्थिति अनुकरण कर सकते हैं के रूप में बढ़ रहे हैं। जीन संपादन या अन्य तरीकों कि रोगजनक हालत रिवर्स कर सकते हैं का उपयोग करना, रोगी विशेष IPSCs भी व्यक्तिगत दवा 5 में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, IPSCs कम प्रतिरक्षा अस्वीकृति के साथ जुड़े रहे हैं क्योंकि वे दाता के रूप में ही प्रतिरक्षा पहचान है, ऑटो प्रत्यारोपण और अधिक व्यावहारिक 6 बना रही है। इसलिए, IPSCs रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा में सबसे होनहार मंच बन गए हैं। इन लाभों, सुधार प्रोटोकॉल है कि छोटी से छोटी सेल स्रोत से समय कम से कम राशि में शुद्ध और अधिक पैदावार दे सकते लगातार विकास के तहत कर रहे हैं दी। भविष्य के आवेदन के लिए सबसे कुशल प्रोटोकॉल को खोजने का एक प्रमुख विचार प्राथमिक सेल प्रकार है। जल्दी IPSC पीढ़ी के अधिकांश आद्यकर्नल पक्षपाती कोशिकाओं के बाद से मूल IPSC लाइनों त्वचा fibroblasts 4 से प्रेरित थे के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। हालांकि, अलगाव और इन कोशिकाओं की तैयारी श्रम गहन हैं। इसके अलावा, त्वचा fibroblasts के अलगाव इनवेसिव शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं है कि व्यापक आवेदन के लिए एक बड़ी कमी बन सकता है शामिल है।

इसलिए, IPSCs के आगे उपयोग के लिए सुविधाजनक अधिग्रहण के साथ एक सेल स्रोत की आवश्यकता है। क्योंकि यह एक नहीं बल्कि न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया 7-9 के माध्यम से प्राप्त किया जाता है खून एक आदर्श सेल स्रोत के रूप में माना जाता है। इस अध्ययन में, हम प्रोटोकॉल परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से hiPSCs पैदा करने के लिए एक सरल संशोधन विकसित की है। ऐसे CD34 + कोशिकाओं के रूप में एक विशेष सेल प्रकार की मुश्किल विस्तार की प्रक्रिया के बिना, पूरे रक्त कोशिकाओं या PBMCs क्रमानुसार मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर centrifugation द्वारा यामानाका कारकों युक्त सेंडाइ वायरस से पारगमन के बाद चढ़ाया गया। इस विधि समय के लिए आवश्यक समय को कमट्रांसड्यूस अस्थायी कोशिकाओं की कुर्की और reprogrammed कोशिकाओं है कि अपने दम पर संलग्न करने के लिए सक्षम नहीं थे के नुकसान में कमी आई है।

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Protocol

आचार कथन: इस अध्ययन प्रोटोकॉल कोरिया के कैथोलिक विश्वविद्यालय (KC12TISI0861) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. रक्त से monocytic कोशिकाओं के अलगाव

  1. monocytic कोशिकाओं का अलगाव दिवस (-5)
    1. एक सेल तैयारी ट्यूब (सीपीटी) में खून का ड्रा से ताजा रक्त के कम से कम 10 मिलीलीटर प्राप्त करते हैं।
    2. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए रक्त का स्थानांतरण और बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) एक 1 के साथ पतला: 4 अनुपात।
      ध्यान दें: कमजोर पड़ने के एक उच्च अनुपात उच्च शुद्धता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब घनत्व ढाल मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ध्यान घनत्व ढाल मीडिया के शीर्ष पर पतला खून परत। एक centrifugation ब्रेक के बिना कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए 750 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. ध्यान से, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बफी परत हस्तांतरण ट्यूब के लिए पीबीएस के 30 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और कोशिकाओं धो लें।
    5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 515 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। </ Li>
    6. पीबीएस त्यागें और रक्त कोशिका मीडिया के 0.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    7. कोशिकाओं की गणना और एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं थाली। वाष्पीकरण को रोकने के लिए आसपास के कुओं के लिए पीबीएस जोड़ें।
    8. 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% में पारगमन से पहले सीओ 2 को स्थिर। कोशिकाओं के बिना परेशान दिनों 3-4 पर ताजा रक्त कोशिका मीडिया के एक अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।

2. सेंडाइ वायरस से पारगमन

  1. पारगमन दिवस (0)
    1. लीजिए और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रक्त कोशिकाओं को हस्तांतरण और एक hemocytometer का उपयोग कर उन्हें गिनती।
    2. पारगमन के प्रति 3 x 10 5 कोशिकाओं को तैयार है और आरटी पर 5 मिनट के लिए 515 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    3. सक्शन से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और रक्त कोशिका मीडिया के 0.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    4. एक गैर-लेपित 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से कोशिकाओं स्थानांतरण।
    5. बर्फ में सेंडाइ वायरस मिश्रण गला लें और सु करने के लिए इसे जोड़नेspended कोशिकाओं। निर्माता की सिफारिशों के आधार पर कोशिकाओं को सेंडाइ वायरस जोड़ें।
    6. एक सील फिल्म के साथ थाली को सील करने और 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1150 XG पर यह अपकेंद्रित्र।
    7. Centrifugation के बाद, 5% सीओ 2 रातोंरात (हे / एन) में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
  2. फीडर मैट्रिक्स के लिए सेल हस्तांतरण (1 दिन)
    1. अगले दिन, कोट vitronectin के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली। एक अंतिम 5 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए पीबीएस में vitronectin समाधान पतला। 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए vitronectin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर यह सेते हैं। उपयोग करने से पहले कोटिंग समाधान निकालें। लेपित प्लेट 3 दिन के लिए आरटी में संग्रहित किया जा सकता है।
    2. सभी अच्छी तरह से लेपित करने के लिए कोशिकाओं और वायरस युक्त मीडिया स्थानांतरण।
    3. ताजा रक्त कोशिका मीडिया के एक अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर के साथ शेष कोशिकाओं को इकट्ठा और सेल युक्त अच्छी तरह से जोड़ें।
    4. 35 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1150 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
    5. प्रतिशत के बादrifugation, सतह पर तैरनेवाला हटाने IPSC मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ने, और 5% सीओ 2 हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
  3. दूसरा सेल हस्तांतरण (2 दिन)
    1. कोट 5 माइक्रोग्राम / एमएल vitronectin के साथ एक नया 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं, कदम 2.2.1 में वर्णित है। प्रत्येक पारगमन के लिए थाली में से एक अच्छी तरह से प्रयोग करें।
    2. नव लेपित vitronectin थाली करने के लिए पहली थाली से सेल निलंबन स्थानांतरण।
      नोट: यदि आवश्यक नहीं, निलंबन की कोशिकाओं को खारिज किया जा सकता है। प्रक्रिया 2.3 कदम में उल्लेख निलंबन कोशिकाओं के साथ 2-3 बार दोहराया जा सकता है। कदम दोहराया जाएगा, तो कोशिकाओं फसल।
    3. इस बीच, IPSC मीडिया के 1 मिलीलीटर पहले थाली की अच्छी तरह से करने के लिए, रखरखाव के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 हे / एन में जोड़ने के लिए, और यह सेते हैं।
    4. और 37 डिग्री सेल्सियस पर जुड़ी कोशिकाओं को बनाए रखने 5% सीओ 2 और ताजा IPSC मीडिया के साथ एक दैनिक मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं। कालोनियों के दिनों में पारगमन के बाद 14-21 दिखाई देगा।
    5. Centrifugई नव लेपित प्लेट 1,150 XG और 10 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन कोशिकाओं से युक्त।
    6. Centrifugation के बाद, 5% सीओ 2 हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
    7. अगले दिन, तैरनेवाला निकालें और ताजा IPSC मीडिया के साथ बदलें।
      नोट: प्रक्रिया 2.3 कदम में उल्लेख निलंबन कोशिकाओं के साथ 2-3 बार दोहराया जा सकता है। कदम दोहराया जाएगा, तो सतह पर तैरनेवाला में कोशिकाओं फसल और 2.3 कदम दोहराएँ।
    8. जब तक 80% confluency तक पहुँच जाता है दैनिक मीडिया परिवर्तन के साथ संलग्न कोशिकाओं को बनाए रखें।

3. reprogrammed सेल रखरखाव

  1. 24 अच्छी तरह से थाली संस्कृति के बाद जल्दी रखरखाव
    1. 7-10 दिनों के पारगमन के बाद, एक बार कोशिकाओं मिला हुआ हैं, एक vitronectin में लिपटे, 60 मिमी पकवान तैयार करते हैं। एक अंतिम 5 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए पीबीएस में vitronectin समाधान पतला। डिश के लिए vitronectin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर यह सेते हैं।
    2. धोएंपीबीएस के साथ कोशिकाओं और कोशिकाओं को अलग करने के लिए पीबीएस / 1 मिमी EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं और 5% सीओ 2।
    4. कोशिकाओं फसल और उन्हें 250 XG और आरटी 2 मिनट के लिए पर अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और ताजा IPSC मीडिया के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    5. नव लेपित 60 मिमी पकवान पर सभी resuspended कोशिकाओं थाली।
    6. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के लिए 10 मिमी रो kinase अवरोध जोड़ें और उन्हें बनाए रखने के लिए जब तक कोशिकाओं 80% मिला हुआ हैं।
  2. कॉलोनी उपस्थिति के लिए अलग (subcloning तैयारी)
    1. एक vitronectin में लिपटे, 100 मिमी पकवान, कदम 3.1.2 में वर्णित के रूप में तैयार करें।
    2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए पीबीएस / 1 मिमी EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं और 5% सीओ 2।
    4. कोशिकाओं फसल और उन्हें 250 XG और आरटी 2 मिनट के लिए पर अपकेंद्रित्र।
    5. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और पकवान प्रति 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं तैयार करते हैं।
    6. 250 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और 2 मिनट के लिए आरटी।
    7. Resuspend 1 एक्स 10 4 IPSC मीडिया के 6 मिलीलीटर, कोशिकाओं में उन्हें लेपित 100 मिमी पकवान पर थाली, और मीडिया के लिए 10 मिमी रो kinase अवरोध जोड़ें।
    8. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर जब तक बड़ी कालोनियों दिखाई देते हैं एक सप्ताह के लिए सीओ 2 5% में सेते हैं।
      नोट: बनाए रखें और subcloning के लिए कालोनियों का विस्तार। Subcloning आमतौर पर 5 मार्ग के तहत किया जाता है।
  3. कालोनी IPSC कॉलोनी समाधान detaching का उपयोग कर उठा
    1. कॉलोनी उठा, बीज 1 एक्स 10 4 एक vitronectin में लिपटे, 100 मिमी डिश में कोशिकाओं, कदम 3.2.7 में वर्णित के रूप में पहले एक सप्ताह।
    2. vitronectin समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ने और कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर incubating द्वारा एक vitronectin में लिपटे, 60 मिमी पकवान तैयार करें।
    3. एक माइक्रोस्कोप (40X या 100X बढ़ाई) के माध्यम से देख कर, स्पष्ट सीमाओं एक मार्कर पेन का उपयोग कर के साथ कालोनियों के निशान। कदम 3.3.2 में किए गए नए थाली से vitronectin समाधान निकालें और 6 मिलीलीटर जोड़नेIPSC के मीडिया 10 मिमी रो kinase के साथ पूरक।
    4. कोशिकाओं से संस्कृति के माध्यम से निकालें और उन्हें पीबीएस के 3 मिलीलीटर से धो लें।
    5. IPSC कॉलोनी detaching समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 30 एस के लिए उन्हें सेते हैं।
    6. थाली से समाधान निकालें और अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए आरटी पर यह सेते हैं।
    7. एक P200 विंदुक का प्रयोग, थाली से मीडिया के 200 μl आकर्षित और pipetting द्वारा लक्षित कालोनियों अलग। नई 100 मिमी पकवान को तितर-बितर कालोनियों स्थानांतरण।
    8. सेते हैं और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
      ध्यान दें: एक शुद्ध IPSC कॉलोनी प्राप्त करने के बाद, कोशिकाओं जब तक वे पारित होने तक पहुँच 10 विशेषता कम से कम 10 मार्ग के बाद किया गया था बनाए रखा गया। एंटीबॉडी dilutions और प्राइमर जानकारी तालिका 1 और 2 में दिखाया जाता है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल रक्त से अलग PBMCs reprogram करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करता है। सीरियल चढ़ाना और centrifugation के संयोजन का उपयोग करना, IPSCs सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया। इस विधि के साथ, अलग-थलग IPSCs या एक विशेष सेल प्रकार के विस्तार के बिना पूरे रक्त कोशिकाओं की एक छोटी राशि के साथ उत्पन्न किया जा सकता है। हम सफलतापूर्वक एक छोटे से सेल संस्कृति की थाली में केवल 1x10 4 कोशिकाओं से IPSCs उत्पन्न।

reprogramming से पहले, रक्त कोशिकाओं घनत्व ढाल मीडिया का उपयोग कर अलग कर दिया गया। रक्त कोशिकाओं 5 दिनों के अलगाव के बाद transduced थे। चित्रा 1 ए निलंबन की कोशिकाओं के लिए reprogramming विधि की योजना को दिखाता है। अलगाव के बाद, PBMCs सेंडाइ वायरस में एक गैर-लेपित अच्छी तरह यामानाका कारकों युक्त के साथ transduced थे। अगले दिन, निलंबन की कोशिकाओं को काटा गया और एक vitronectin लेपित प्लेट centrifugation का उपयोग पर चढ़ाया जबकि कोशिकाओं एटीटीगैर लेपित अच्छी तरह से करने के लिए बैठ जाता खारिज कर दिया गया था। जुड़ी कोशिकाओं है कि vitronectin लेपित प्लेट पर दिखाई बनाए रखा और आगे विस्तार किया गया। संलग्न कोशिकाओं IPSC मीडिया का उपयोग दैनिक मीडिया परिवर्तन के साथ बनाए रखा गया। centrifugation के साथ चढ़ाना प्रक्रिया शेष निलंबन की कोशिकाओं के लिए दोहराया गया था।

Reprogrammed IPSCs पारगमन के बाद उनके विशिष्ट आकृति विज्ञान कई दिनों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। हालांकि, reprogramming के दौरान, यह मुश्किल एक शुद्ध रूप में reprogrammed कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए किया गया था। Reprogramming के प्रारंभिक चरण में, IPSCs जुड़ी गैर reprogrammed विभेदित कोशिकाओं (2A चित्रा) के साथ मिलाया गया। चित्रा 2A में तीर छवि में IPSC-जैसे प्रकार की कोशिकाओं से पता चलता है। विस्तार से पहले, IPSCs और अन्य कोशिकाओं भेदभाव करने के लिए मुश्किल थे। इसलिए, एक शुद्ध कॉलोनी केवल कॉलोनी उठा प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किया गया था। एक कम घनत्व में कोशिकाओं को बोने कालोनियों कि एल थे द्वाराARGE चुनने के लिए पर्याप्त है, के रूप में प्राप्त किया गया चित्रा 2B में दिखाया गया है। कॉलोनी को अलग-थलग करने के बाद, सेल clumps एकल कक्षों और सुसंस्कृत (चित्रा -2) में अलग किया गया। शुद्ध IPSC कालोनियों (चित्रा 2 डी) बाद में देखा गया था। बाद शुद्ध IPSCs विस्तार किया गया, कोशिकाओं की गुणवत्ता का परीक्षण किया गया था। प्रकोष्ठों IPSCs (चित्रा 3 ए) के undifferentiated राज्य पुष्टि करने के लिए alkaline फॉस्फेट के साथ दाग रहे थे। पृथक IPSCs सब से निकाली गई कालोनियों सकारात्मक धुंधला दिखाया। Pluripotent मार्कर immunofluorescence धुंधला, चित्रा 3 बी में दिखाया द्वारा पुष्टि की गई। reprogrammed कोशिकाओं को अत्यधिक ऐसे SSEA4, OCT4, Sox2, टीआरए-1-81, KLF4, और सबसे महत्वपूर्ण बात, टीआरए-1-60 के रूप में pluripotent मार्कर व्यक्त किया। Pluripotent मार्करों की अभिव्यक्ति आरटी पीसीआर, चित्रा -3 सी में दिखाया द्वारा पुष्टि की गई। OCT4 और Sox2, का पता चला के रूप में प्रतिदीप्ति आंकड़ों में दिखाया गया। ऐसे NANOG, DPPA5, TDGF1 के रूप में अतिरिक्त मार्कर Positiv थेइली के रूप में अच्छी तरह से व्यक्त किया।

आगे के विश्लेषण के लिए, एक कुपोषण विश्लेषण किया गया था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है -4 ए, उत्पन्न IPSCs एक सामान्य गुणसूत्र पैटर्न से पता चला है। सच pluripotency पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं को बाहरी झिल्ली, mesoderm, और एण्डोडर्म में भेदभाव कर रहे थे। उत्पन्न IPSCs सफलतापूर्वक सभी तीन रोगाणु परतों, चित्रा 4 बी में देखा में विभेदित। चूंकि सेंडाइ वायरस अपने एकीकरण से मुक्त संपत्ति के लिए जाना जाता है, वायरल डीएनए को हटाने की चित्रा 4C में दिखाया गया है। वायरल डीएनए है खड़ा तीन कक्षों में से एक, रहने के कई मार्ग के बाद भी। हालांकि, एकीकृत जीन प्रक्रियाओं subcloning से हटाने योग्य था।

अंत में, हम एक प्रोटोकॉल चल PBMCs से IPSCs पैदा करने से पता चला है। प्रोटोकॉल उच्च दक्षता दिखाया और केवल रक्त की एक छोटी राशि की आवश्यकता है। उत्पन्न IPSCs उच्च pluripotency था और छठी से बचा RAL एकीकरण।

चित्र तीन
चित्रा 1: PBMCs से IPSC पीढ़ी प्रोटोकॉल की योजना। मध्यम प्रकार और समय के आधार पर तैयार प्रोटोकॉल का एक विस्तृत चित्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 2: PBMCs से उत्पन्न IPSCs के उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (ए) reprogrammed कोशिकाओं के प्रारंभिक आकृति विज्ञान। (बी) चुनने से पहले एक कॉलोनी की छवि। (सी) कॉलोनी उठा शुद्धिकरण की प्रक्रिया के बाद कोशिकाओं। (डी) एक शुद्ध कॉलोनी की आकृति विज्ञान। सभी स्केल सलाखों 200 माइक्रोन से संकेत मिलता है। /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: IPSCs की pluripotency PBMCs से उत्पन्न। (ए) कालोनियों alkaline फॉस्फेट के साथ दाग। उत्पन्न IPSCs का (बी) प्रतिदीप्ति छवि। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने अनुपात तालिका 1 में दिखाया गया है। Pluripotent मार्कर (सी) पीसीआर विश्लेषण। प्राइमर जानकारी तालिका 2 में प्रदान की जाती है। सभी स्केल सलाखों 200 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4: उत्पन्न IPSCs के आगे विश्लेषण। (ए) IPSC के सामान्य karyogram। तीन रोगाणु परत भेदभाव के बाद कोशिकाओं के (बी) प्रतिदीप्ति छवि। (सी) पीसीआर सेंडाइ वायरल वैक्टर का विश्लेषण। गैर-transduced कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया, और कोशिकाओं के एक दिन बाद काटा पारगमन सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। प्राइमर जानकारी तालिका 2 में प्रदान की जाती है। सभी स्केल सलाखों 200 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीबॉडी का नाम एकाग्रता
SSEA4 1: 200
Oct3 / 4 1: 100
टीआरए-1-60 1: 200
Sox2 1: 100
टीआरए-1-81 1: 100
Klf4 1: 250
एलेक्सा स्त्राव 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + L) एंटीबॉडी 1: 400
एलेक्सा स्त्राव 594 बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + L) एंटीबॉडी 1: 400

तालिका 1 एंटीबॉडी dilutions।

लक्ष्य का नाम दिशा प्राइमर अनुक्रम आकार
OCT3 / 4 आगे एसीसी सी सी टी GGT जीसीसी GTG ए.ए. 190
रिवर्स GGC TGA अता सी सी टी टीसीसी सीएएक अता
Sox2 आगे कैग CGC ATG जीएसी AGT टीएसी 321
रिवर्स GGA GTG GGA GGA आगा GGT
NANOG आगे एएए जीजीसी एएए CAA सीसीसी अधिनियम 270
रिवर्स GCT एटीटी सीटीटी CGG सीसीए GTT
LIN28 आगे GTT CGG सीटीटी सी सी टी जीटीसी कैट 122
रिवर्स CTG सी सी टी सी सी टी सी सी टी सीएसी टीसीए
DPPB5 आगे CGG CTG CTG एएए जीसीसी एटीटी टीटी 215
रिवर्स AGT टीटीजी एजीसी एटीसी सी सी टी CGC टीसी
TDGF1 आगे टीसीसी टीटीसी टीएसी GGA CGG एएसी टीजी 140
रिवर्स आगा AAT जीसीसी TGA GGA आग सीए
Sev आगे GGA टीसीए सीटीए GGT GAT एटीसी भूमिकाः सी 181
रिवर्स एसीसी आगा CAA भूमिकाः TTT आग आगा जैसे जीटीए टीसी
KOS आगे ATG सीएसी CGC टीएसी जीएसी GTG एजीसी जीसी 528
रिवर्स एसीसी टीटीजी एसीए एटीसी CTG ATG TGG
Klf4 आगे टीटीसी CTG कैट जीसीसी आगा GGA जीसीसी सी 410
रिवर्स AAT जीटीए टीसीजी आग GTG सीटीसी ए.ए.

तालिका 2 प्राइमर जानकारी।

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Discussion

चूंकि भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) कई कमियों से पता चला है, एक वैकल्पिक उपकरण की जरूरत के लिए आवश्यक था। इसलिए, (IPSCs) प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के विकास यामानाका द्वारा अंतरराष्ट्रीय सुर्खियों में आया था। यह लगभग एक दशक के बाद से किया गया है यामानाका को पता चला कि pluripotency वयस्क दैहिक कोशिकाओं में केवल चार जीन जोड़कर प्रेरित किया जा सकता है। चूंकि IPSCs परिपक्व दैहिक कोशिकाओं से 'प्रेरित' हैं, वे नैतिक मुद्दों है कि एक बार ESCs से संबंधित चिंता का विषय थी बचने कर सकते हैं। ESCs के विपरीत, IPSCs प्रत्येक व्यक्ति से उत्पन्न हो सकता है। इसलिए, वे व्यक्तिगत चिकित्सा अनुसंधान और ऐसी दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग, या पुनर्जन्म का दवाओं के रूप में अन्य अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

पहले मानव IPSC त्वचीय fibroblasts 2007 विभिन्न समूहों में सफलतापूर्वक इस सेल प्रकार reprogrammed से उत्पन्न किया गया था, लेकिन एक इनवेसिव शल्य प्रक्रिया इस प्राथमिक सेल प्राप्त करने के लिए आवश्यक था। इसलिए, यह विचार नहीं थाविभिन्न रोग पैदा करने IPSCs या पुनर्योजी चिकित्सा डिजाइन करने के लिए एल स्रोत है। एक विकल्प है और आसानी से प्राप्त सेल प्रकार के ऐसे केरेटिनकोशिकाओं, मूत्र monocytes, और रक्त कोशिकाओं के रूप में, की जरूरत थी। हालांकि, इन कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए मेहनत कर रहे हैं, और उनमें से कुछ संदूषण 10 के एक उच्च मौका है।

इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक ऐसी PBMCs के रूप में पूरे रक्त कोशिकाओं से IPSCs उत्पन्न कर सकते हैं प्रस्तुत किया। एक विशेष सेल प्रकार के किसी भी विस्तार की प्रक्रिया के बिना, इस प्रोटोकॉल प्राथमिक रक्त कोशिकाओं की एक छोटी राशि से भी IPSCs उत्पन्न करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि चलता है। एक बार जब PBMCs खून से अलग थे, कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए रक्त कोशिका मीडिया में स्थिर हो गया था। पारगमन से पहले स्थिरीकरण कदम इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण था। reprogramming दक्षता रक्त कोशिका मीडिया में कोशिकाओं incubating के बाद बेहतर था। यह मीडिया CD34 + कोशिकाओं के विस्तार के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, जब पूरे रक्त कोशिकाओं को इस मुझ में बनाए रखा गया5 दिनों के लिए व्यास, सेल नंबर पहले गिनती के साथ लगभग समान थी। पूरे रक्त कोशिकाओं का उपयोग करना, यह अगर CD34 + कोशिकाओं का विस्तार किया गया था इस बात की पुष्टि करना मुश्किल था। फिर भी, स्थिरीकरण कदम से ही सफल reprogramming के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए लग रहा था।

पारगमन के बाद, हम क्रमानुसार centrifugation द्वारा एक vitronectin लेपित प्लेट पर कोशिकाओं चढ़ाया। मूल रूप से, reprogrammed कोशिकाओं पारगमन के बाद अच्छी तरह से की तह तक डूब गया। यांत्रिक बल या centrifugation साथ कोशिकाओं को बढ़ाने के द्वारा, transduced कोशिकाओं देते हैं और पैदा करने में सक्षम थे। हालांकि, बाद से प्रोटोकॉल पूरे रक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल किया, विभिन्न नमूनों के साथ प्रयास किया परीक्षणों के आधे morphologies के विभिन्न प्रकारों में जब से विस्तार हुआ है। इसलिए, कॉलोनी उठा द्वारा शुद्ध IPSC कालोनियों के अलगाव के इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण था। कोशिकाओं को अलग कॉलोनी से विस्तार एक शुद्ध IPSCs की सभी विशेषताओं दिखाया।

अन्य लाभ के बावजूद, IPSCs हैकई बाधाओं को पार करने के लिए। कई कारकों यामानाका ओंकोजीन में जाना जाता है के बाद से, वहाँ चिंता है कि IPSCs विवो में ट्यूमर में विकसित कर सकते हैं। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि reprogrammed कोशिकाओं एकीकरण से कोई शेष बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति है। ऐसे रेट्रोवायरस और lentiviruses के रूप में IPSCs, वायरस, के विकास के बाद प्रारंभिक वर्षों में, reprogramming के लिए इस्तेमाल किया गया। reprogramming दर सफलतापूर्वक उच्च था, अभी तक इन वायरस सेल जीनोम में यादृच्छिक एकीकरण की आवश्यकता है। इस कारण से, कई अन्य तरीकों से विकसित किया गया है। सेंडाइ वायरस की तरह वायरस एकीकरण के बिना कोशिकाओं transduce के लिए जाना जाता है, और छोटे अणुओं और episomal वैक्टर का उपयोग अन्य तरीकों के रूप में अच्छी तरह से विकसित किया गया है। इस अध्ययन में, हम reprogramming के लिए सेंडाइ वायरस का इस्तेमाल किया। एकीकरण दर lentiviruses की तुलना में अपेक्षाकृत कम था। हम यह भी पुष्टि की है कि वहाँ उत्पन्न IPSCs में कुछ शेष वायरल घटकों थे। तीन परीक्षणों में से एक को एकीकृत में हुईआयन, 15-20 के बाद भी मार्ग। हालांकि, इस एकीकरण कालोनियों एक एकल कोशिका से ली गई subcloning से हटाने योग्य था। हमारे अनुभव में, घनत्व एक स्वस्थ कॉलोनी एक एकल कक्ष से प्राप्त होता प्राप्त करने के लिए 100 मिमी पकवान प्रति 1x10 4 कोशिकाओं था। कालोनियों कि एक आदर्श परिपत्र रूप में हुई उठाया और शेष वायरल घटकों के पीसीआर फिर से पुष्टि करने के लिए विस्तार किया गया। कालोनियों गैर समेकित कोशिकाओं से व्युत्पन्न आगे उपयोग के लिए बनाए रखा गया। एक बार नष्ट कर दिया, कोशिकाओं गैर एकीकृत राज्य बनाए रखा।

इस अध्ययन में, हम रक्त कोशिका reprogramming के लिए एक प्रोटोकॉल का सुझाव। हम अस्थायी कोशिकाओं के reprogramming दर को बढ़ाने के लिए इस तरह के सीरियल चढ़ाना और centrifugation के रूप में कई कदम उठाए, कहा,। इस विधि PBMCs और गर्भनाल रक्त कोशिकाओं mononuclear (CBMCs) के साथ किया गया था। इस प्रोटोकॉल दक्षिण कोरिया में जीएमपी सुविधाओं में homozygote IPSCs उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हमारे समूह का उपयोग कर IPSC reprogramming प्रक्रिया की गति को आगे लग रहा हैहमारे प्रोटोकॉल।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

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References

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