Developmental Biology
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गर्भनाल रक्त से 3 डी त्वचा Organoid का उत्पादन-व्युत्पन्न प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल
Chapters
Summary April 18th, 2019
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हम एक प्रोटोकॉल है कि पता चलता है कि कैसे प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के अंतर को keratinocytes और fibroblasts और एक 3 डी त्वचा organoid उत्पंन, इन keratinocytes और फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करने का प्रस्ताव है । इस प्रोटोकॉल एक humanized चूहों मॉडल पैदा करने का एक अतिरिक्त कदम शामिल हैं । तकनीक यहां प्रस्तुत dermatologic अनुसंधान में सुधार होगा ।
Transcript
कॉर्ड रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं, या सीबीएमसी, पुनर्योजी दवा के लिए एक संभावित सेल स्रोत के रूप में उभरी हैं, क्योंकि मानव ल्यूकोसिट एंटीजन टाइपिंग सेल बैंकिंग प्रणाली के लिए आवश्यक है। सीबीएमसी-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, या सीएमबीसी-आईपीएससी, keratinocytes और फाइब्रोब्लास्ट में विभेदित किया जा सकता है । 3डी स्किन ऑर्गेनॉइड जेनरेट करने के लिए, हम त्वचा संबंधी शोध का उपयोग कर रहे हैं।
सीबीएमसी-आईपीएससी को विट्रोनेक्टिन-लेपित 100-मिलीलीटर प्लेटों पर 37 डिग्री सेल्सियस और 10% कार्बन डाइऑक्साइड पर बनाकर शुरू करें। जब कोशिकाएं 80% तक पहुंच गई हैं, तो संस्कृतियों को पीबीएस के साथ धोएं, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो मिनट के लिए प्रति प्लेट एक मिलीमोलर EDTA के एक मिलीलीटर के साथ व्यवहार करें। जब कोशिकाओं को अलग कर दिया है, प्रति प्लेट E8 माध्यम के तीन मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया बंद करो, और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
मतगणना के लिए ई-8 माध्यम के पांच मिलीलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें, और अपकेंद्रित्र के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु नली में एक बार-10-से-छठी कोशिकाओं को स्थानांतरित करें । 2.5-मिलीलीटर भ्रूणीय शरीर निर्माण माध्यम के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, 10-माइक्रोमोलर रो-संबद्ध किनेज़, या रॉक अवरोधक के साथ पूरक। एक अनकोटेड कल्चर प्लेट ढक्कन पर कोशिकाओं की 125-माइक्रोलीटर बूंदों को स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
जब सभी बूंदों को रखा गया है, तो बूंदों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 24 घंटे के लिए ढक्कन से लटकाने की अनुमति देने के लिए पकवान को चालू करें। अगले दिन, ताजा E8 माध्यम के साथ ढक्कन धोएं, और भ्रूणीय शरीर के समाधान को 50-मिलीलीटर शंकुदाता में स्थानांतरित करें। भ्रूण निकायों को कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें, सुपरनैंट को एस्पिर करने से पहले और उनके भेदभाव तक ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर ९० मिलीमीटर पेट्री डिश में अपनी संस्कृति के लिए ताजा E8 माध्यम के साथ भ्रूणीय निकायों को फिर से निलंबित करें ।
सीबीएमसी-आईपीएससी केराटिनोसाइट भेदभाव के लिए, ताजा ई 8 माध्यम के साथ भ्रूणीय शरीर संस्कृति से ई 8 माध्यम को प्रतिस्थापित करें, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 24 घंटे के इनक्यूबेशन के लिए हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 के एक नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक। अगले दिन, भ्रूण के शरीर को 50-मिलीलीटर शंकु नली में फसल दें, और शरीर को कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। इसके बाद, केराटिनोसिटे विभेदन माध्यम 1, या केडीएम1 के छह मिलीलीटर के साथ सुपरनैटर को प्रतिस्थापित करें, 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ पूरक हों, और भ्रूणीय निकायों को टाइप IV कोलेजन-लेपित 100 मिलीमीटर डिश में स्थानांतरित करें।
संस्कृति के आठ के माध्यम से शून्य दिन पर, ताजा KDM1 के साथ हर दूसरे दिन माध्यम की जगह, तीन माइक्रोमोलर रेटिनोइक एसिड और 25 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर हड्डी मॉर्मोजेनेटिक प्रोटीन 4 और एपिडर्मल विकास कारक के प्रत्येक के साथ पूरक । 12 के माध्यम से नौ दिनों के बीच, माध्यम को हर दूसरे दिन KDM2 के साथ प्रतिस्थापित करें, तीन माइक्रोमोलर रेटिनोइक एसिड के साथ पूरक, बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 के 25 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर के 20 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर। 13 से 30 दिनों के बीच, माध्यम को हर दूसरे दिन केडीएम 3 में बदलें, हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 के 10 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर के मिलीलीटर प्रति 20 नैनोग्राम।
सीबीएमसी-आईपीएससी फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव के लिए, फाइब्रोब्लास्ट विभेदन माध्यम 1 के छह मिलीलीटर में भ्रूणीय शरीर संस्कृति को फिर से निलंबित करें, 10-माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ पूरक, और भ्रूण शरीर निलंबन को एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 100 मिलीमीटर डिश में स्थानांतरित करें। तीन दिनों के इनक्यूबेशन के बाद, मध्यम को फाइब्रोब्लास्ट विभेदन माध्यम 2 में बदलने से पहले, चार दिनों के लिए 0.5-नैनोमोलर बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 के साथ संस्कृति का इलाज करें। संस्कृति के सात दिन पर, एक सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन FDM2 के लिए माध्यम बदल जाते हैं ।
संस्कृति के दिन 14 पर, एक मिलीमोलर EDTA के साथ कोशिकाओं को अलग कर के रूप में प्रदर्शन किया, और अपकेंद्रित्र के लिए फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव माध्यम 2 के तीन मिलीलीटर में कोशिकाओं को इकट्ठा । गिनती के लिए फाइब्रोब्लास्ट विभेदन माध्यम 1 के पांच मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और दो बार-10-से-छठी कोशिकाओं को एक गैर-लेपित पकवान में स्थानांतरित करें। संस्कृति के 21 दिन, दो बार हस्तांतरण-10-से-संस्कृति से छठी कोशिकाओं को एक प्रकार मैं कोलेजन-लेपित १००-मिलीमीटर पकवान ताजा फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव माध्यम में 1 ।
संस्कृति के 28 दिन, दो बार-10-10-10-10-10-10-आईपीएससी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट के एक नए गैर-लेपित पकवान में स्थानांतरित करें। त्रि-आयामी त्वचा ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए, संस्कृति से आईपीएससी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट को फसल करें, और अपकेंद्रित्र के लिए दो गुना-10-से-पांचवीं कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकुस ट्यूब में स्थानांतरित करें। फाइब्रोब्लास्ट विभेदन माध्यम 1 के 1.5 मिलीलीटर में फाइब्रोब्लास्ट गोली को फिर से निलंबित करें, और 1.5 मिलीलीटर बेअसर टाइप आई कोलेजन समाधान।
कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक छह अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में एक सम्मिलन पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट । जब समाधान जम जाता है, तो डालने के शीर्ष पर मध्यम के दो मिलीलीटर और कुएं के नीचे तीन मिलीलीटर जोड़ें। फिर फाइब्रोब्लास्ट मैट्रिक्स को पांच से सात दिनों तक इनक्यूबेटर में रखें, जब तक कि जेलेशन पूरा न हो जाए, और मैट्रिक्स अब अनुबंध नहीं करता है।
इनक्यूबेशन के अंत में, आईपीएससी-व्युत्पन्न केराटिनोसाइट्स को फसल करें, और अपकेंद्रित्र के लिए एक बार-10-से-छठी कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। कम कैल्शियम एपिथेलियल माध्यम 1 के 50 से 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें, और फाइब्रोब्लास्ट मैट्रिक्स पर माध्यम को केराटिनोसाइट सेल समाधान के साथ बदल दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के बाद, एपिथेलियल माध्यम 1 के दो मिलीलीटर के साथ सम्मिलित के शीर्ष पर माध्यम की जगह लें, और नीचे के माध्यम में उसी के तीन मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से, और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस करें।
दो दिनों के बाद, डालने में माध्यम और अच्छी तरह से संस्कृति के दो अतिरिक्त दिनों के लिए सामान्य कैल्शियम एपिथेलियल माध्यम 2 के साथ बदलें। संस्कृति के चार दिन, माध्यम के सभी को हटा दें, और एक एयर-लिक्विड इंटरफेस उत्पन्न करने के लिए, केवल नीचे अच्छी तरह से कॉर्निफिकेशन माध्यम के तीन मिलीलीटर जोड़ें। फिर डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए 3डी स्किन ऑर्गेनॉइड की कटाई से पहले 14 दिनों तक इनक्यूबेटर में प्लेट वापस करें।
सीबीएमसी-आईपीएससी-व्युत्पन्न केराटिनोसाइट्स में प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के समान आकृति विज्ञान होता है, और इन कोशिकाओं में केराटिनोसिट मार्कर की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। सीबीएमसी-आईपीएससी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट में प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट के समान आकृति विज्ञान होता है, और प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल मार्कर अक्टूबर-4 की अभिव्यक्ति डाउन-रेगुएनियमित है, जबकि फाइब्रोब्लास्ट मार्कर को विनियमित किया जाता है। 3डी स्किन ऑर्गेनॉइड की मोटाई 3डी कल्चर के दौरान बढ़ जाती है, जिससे इस बात की पुष्टि होती है कि 3डी स्किन ऑर्गेनॉइड आईपीएससी-व्युत्पन्न केराटिनाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट से जेनरेट होता है ।
दो सप्ताह के बाद, एक प्रत्यारोपित 3 डी त्वचा ऑर्गेनॉइड भ्रष्टाचार कुशलतापूर्वक एक प्राप्तकर्ता माउस त्वचा में शामिल है, जैसा कि एचएनई विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है। इसके अलावा, सीबीएमसी-आईपीएससी-व्युत्पन्न 3डी त्वचा ऑर्गेनॉइड में केराटिनोसाइट परिपक्वता और एपिडर्मल भेदभाव मार्कर व्यक्त किए जाते हैं, जो माउस त्वचा दोषों के कार्यात्मक भेदभाव, कुशल ग्राफ्टिंग और प्रभावी उपचार का प्रदर्शन करते हैं। हम अतीत में उच्च कैल्शियम माध्यम के साथ उपयोग करते हैं जो त्वचा के पास नकल करने के लिए 3 डी त्वचा ऑर्गेनॉइड की स्तरीकृत परतों को प्रेरित करता है।
विश्लेषण से पता चलता है कि त्वचा स्तरीकृत है। सीबीएमसी-आईपीएससी त्वचा ग्राफ्ट के लिए एक संभावित सेल स्रोत हैं, और सीबीएमसी-आईपीएससी-व्युत्पन्न 3डी त्वचा ऑर्गेनॉइड का उपयोग त्वचा विज्ञान, कॉस्मेटिक स्क्रीनिंग और पुनर्योजी दवा से संबंधित अध्ययनों में किया जा सकता है।
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