センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

Developmental Biology

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Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (118), e54650, doi:10.3791/54650 (2016).

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Abstract

人間の人工多能性幹細胞(hiPSCs)の最近の開発は成熟した体細胞が未分化多能性の状態に戻ることができることを証明しました。 などケラチノサイト、尿細胞、線維芽細胞、初期の実験は、通常、皮膚線維芽細胞を用いて行った:今、再プログラミングは、成体の体細胞の様々なタイプを使用して行われます。しかしながら、これは、患者からの線維芽細胞を得るために侵襲的な外科的処置を必要としました。したがって、そのような血液および尿細胞などの懸濁細胞を、なぜなら一次細胞を得るための利便性の再プログラミングのために理想的と考えられました。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)からのIPSCを生成するための効率的なプロトコルを報告します。遠心分離を使用して、新しい、マトリックスでコーティングされたプレートにシリアルに形質導入したPBMCをメッキすることにより、このプロトコルは、簡単にIPSCのコロニーを提供することができます。この方法はまた、臍帯血単核細胞(CBMCs)にも適用可能です。この研究は、シンプルかつ効率的PROTを提示しますPBMCおよびCBMCsの再プログラミングのためのocol。

Introduction

幹細胞は、過去数十年の1のための臨床治療の中で最も魅力的な材料の一つとなっています。幹細胞の魅力的な特性は、多分化能と自己再生する能力です。 1981年、第一の胚性幹細胞(ESC)は、マウス胚2から単離しました。技術は、ヒト胚に適用した場合しかし、それはいくつかの倫理的な問題に直面しました。

博士は山中と彼のチームは、マウスの体細胞から最初の多能性細胞を再プログラムするとき、2006年に、幹細胞のフィールドは、その可能性を取り戻し、関心が3が再燃ました。いくつかの定義された因子を送達することによって、多能性幹細胞は、成体体細胞から「誘導され」、したがって、命名された成功した「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」を2007年には、この技術は、ESCの正確な特徴を有する細胞を得、ヒト細胞4に適用されたが、倫理的な議論のどれも。理論的には、のiPSCsは、任意の個体または患者から得られる任意の細胞型から生成することができます。患者特異的iPS細胞は、疾患の表現型および個々の患者のエピジェネティックな条件をシミュレートすることができます潜在的なツールとして上昇しています。遺伝子編集または病原性の状態を逆にすることができ、他の方法を使用して、患者特異的iPS細胞はまた、オーダーメイド医療5で使用することができます。彼らはドナーと同じ免疫アイデンティティを持っているので、また、性IPSCは少ない6自動移植より現実作り、免疫拒絶と関連しています。したがって、性IPSCは、疾患のモデリング、薬剤スクリーニング、および再生治療で最も有望なプラットフォームとなっています。これらの利点を考慮すると、最小の細胞源から最短の時間でより純粋な、より高い収率を与えることができる改良されたプロトコルが開発中で常にあります。将来のアプリケーションのための最も効率的なプロトコルを見つけることの1つの主要な考慮事項は、主要な細胞型です。早期IPSC生成プロトの大半colsのは、元のIPSCラインが皮膚線維芽細胞4から誘導されたので、接着細胞用に最適化されています。しかし、これらの細胞の単離および調製は、労働集約的です。また、皮膚線維芽細胞の単離は、より広範なアプリケーションのための主要な欠点になることができます侵襲性外科手術手順が含まれています。

したがって、iPS細胞をさらなる使用のために、便利な収集を有する細胞源が必要とされます。それはむしろ低侵襲手順7-9を介して取得されるので、血液は、理想的な細胞源とみなされます。本研究では、末梢血単核細胞(PBMC)からhiPSCs生成プロトコルに簡単な変更を開発しました。そのようなCD34 +細胞のような特定の細胞型の困難な膨張処理なしで、全血細胞またはPBMCを連続山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入した後、遠心分離によりマトリックスでコーティングされたプレート上にプレーティングしました。この方法は、に必要な時間を減少しました形質導入浮遊細胞の付着とは、自分で取り付けることができませんでした再プログラミングされた細胞の損失を減少させました。

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Protocol

倫理に関する声明:本研究プロトコルは、カトリック大学校(KC12TISI0861)の施設内倫理委員会によって承認されました。

血からの単球細胞の1の単離

  1. 単球細胞の単離(日-5)
    1. 細胞調製チューブ(CPT)に採血から新鮮な血液の少なくとも10ミリリットルを取得します。
    2. 新しい50mlのコニカルチューブに血液を移し、1で滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれを希釈:4の比率。
      注:希釈の比率が高いが、より高純度のために使用することができます。
    3. 新しい50 mlのコニカルチューブに密度勾配媒体の10ミリリットルを追加し、慎重に密度勾配媒体の上に希釈した血液をレイヤー。遠心ブレーキなしで室温(RT)で30分間、750×gで遠心分離します。
    4. 慎重に、新しい50 mlのコニカルチューブにバフィー層を転送管にPBSの30ミリリットルを追加し、細胞を洗浄。
    5. 室温で5分間、515×gで細胞を遠心</李>
    6. PBSを捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を懸濁します。
    7. 細胞をカウントし、24ウェルプレートのウェルあたり1×10 6細胞をプレート。蒸発を防ぐために、周囲のウェルにPBSを追加します。
    8. 形質導入の前に5%CO 2中、37℃で5日間、細胞を安定化させます。細胞を乱すことなく、日3-4に新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルを追加します。

センダイウイルス2.伝達

  1. トランスダクション(0日目)
    1. 収集し、15mlのコニカルチューブに血液細胞を転送し、血球計数器を使用してそれらを数えます。
    2. 伝達あたり3×10 5細胞を調製し、室温で5分間、515×gで細胞を遠心します。
    3. 吸引により上清を捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を再懸濁します。
    4. 非コーティングした24ウェルプレートのウェルに細胞を移します。
    5. 氷の中にセンダイウイルスの混合物を解凍し、suコマンドに追加spended細胞。メーカーの推奨に基づいて細胞にセンダイウイルスを追加します。
    6. 封止フィルムでプレートを密封し、30℃で30分間1,150×gで、それを遠心。
    7. 遠心分離後、5%CO 2で一晩(O / N)で37℃で細胞をインキュベートします。
  2. フィーダーマトリックスへの細胞移動(1日目)
    1. 翌日、コートビトロネクチンとの24ウェルプレート。最終5μg/ mlの濃度のために、PBS中のビトロネクチン液を希釈します。 24ウェルプレートのウェルにビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。使用前にコーティング溶液を除去します。コーティングしたプレートを3日間室温で保存することができます。
    2. コーティングしたウェルに細胞やウイルスを含むすべてのメディアを転送します。
    3. 新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルと残りの細胞を収集し、細胞含有ウェルにそれを追加します。
    4. 35℃で10分間、1150×gでプレートを遠心。
    5. セント後rifugation、上清を除去しIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5%CO 2、O / Nで、37℃で細胞を維持します。
  3. 第二の細胞移動(2日目)
    1. コートステップ2.2.1で説明したように5μg/ mlのビトロネクチンとの新しい24ウェルプレートのウェル、。各形質導入のためのプレートの1つのウェルを使用してください。
    2. 新たにコーティングされたビトロネクチンプレートに第一プレートから細胞懸濁液を転送します。
      注:必要でない場合、懸濁細胞を廃棄することができます。ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。手順が繰り返される場合は、細胞を採取します。
    3. また、メンテナンスのため、第一プレートのウェルにIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5%CO 2、O / Nで37℃で静置します。
    4. 37℃で付着した細胞を維持し、5%CO 2、新鮮なIPSCメディアを毎日培地交換を行います。コロニーは形質導入後の日14-21に表示されます。
    5. Centrifug10分間1,150×gで35℃で懸濁細胞を含む電子新たにコーティングされたプレート。
    6. 遠心分離後、5%CO 2、O / N中37℃で細胞をインキュベートします。
    7. 翌日、上清を除去し、新鮮なIPSCメディアと交換してください。
      注:ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。ステップが繰り返される場合は、上清中の細胞を採取し、ステップ2.3を繰り返します。
    8. 80%の密集度に到達するまで毎日メディアの変化と付着した細胞を維持します。

3.再プログラムされた細胞のメンテナンス

  1. 24ウェルプレートの培養後の早期のメンテナンス
    1. 細胞がコンフルエントとしたら7-10日形質導入後、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。最終5μg/ mlの濃度PBS中のビトロネクチン液を希釈します。皿にビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。
    2. 洗いますPBSで細胞と細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。
    3. 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5%CO 2。
    4. 細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。上清を除去し、新鮮なIPSC培地3mlに細胞を再懸濁。
    5. プレートは、すべて新たにコーティングされた60-mmディッシュに細胞を再懸濁しました。
    6. 細胞が80%コンフルエントになるまで、5%CO 2中37℃でそれらを細胞に10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加して維持します。
  2. コロニーの外観のためのスプリット(サブクローニング調製)
    1. ステップ3.1.2で説明したように、ビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュを準備します。
    2. PBSで細胞を洗浄し、細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。
    3. 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5%CO 2。
    4. 細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。
    5. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、ディッシュあたり1×10 4細胞を調製。
    6. 250×gで細胞を遠心分離し、室温で2分間。
    7. IPSCメディアの6ミリリットル、再懸濁1×10 4細胞は、コーティングされた100-mmディッシュにそれらをめっきし、メディアに10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加します。
    8. 大きなコロニーが現れるまで一週間、37℃、5%CO 2で細胞をインキュベートします。
      注:サブクローニングのためのコロニーを維持し、展開します。サブクローニングは、通常、5継代の下で行われています。
  3. ソリューションを外すIPSCのコロニーを使用してピッキングコロニー
    1. コロニーピッキング、種子ステップ3.2.7で述べたようにビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュで1×10 4細胞、前の週。
    2. ビトロネクチン溶液2mlを添加し、少なくとも1時間室温でインキュベートすることにより、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。
    3. 顕微鏡(40Xまたは100X倍率)を介して観察することにより、マーカーペンを使用して、明確な境界を有するコロニーをマーク。ステップ3.3.2で行われた新しいプレートからビトロネクチン溶液を除去し、6ミリリットルを追加します。IPSCのメディアは、10 mMのRhoキナーゼを補充しました。
    4. 細胞から培養培地を除去し、PBSの3ミリリットルでそれらを洗ってください。
    5. IPSCコロニー取り外し溶液1mlを加え、室温で30秒のためにそれらをインキュベートします。
    6. プレートから溶液を除去し、さらに30秒間、室温で静置します。
    7. P200のピペットを用いて、プレートから200μlの培地を描き、ピペッティングによって標的コロニーを切り離します。新しい100-mmディッシュに飛散コロニーを転送します。
    8. インキュベートし、5%CO 2中37℃で細胞を維持します
      注:これらは10の特徴付けが、少なくとも10継代後に行われた通路に到達するまで、純粋なIPSCのコロニーを得た後、細胞を維持しました。抗体希釈プライマー情報を表1及び2に示されています。

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Representative Results

このプロトコルは、血液から単離したPBMCを再プログラムするための簡単な方法を提示します。シリアルめっきおよび遠心分離の組み合わせを使用して、iPS細胞が正常に生成されました。この方法では、性IPSCは、特定の細胞型を単離するか、拡大することなく、全血細胞の少量生成することができます。我々は成功し、小細胞培養プレートにのみ1×10 4細胞からiPS細胞を生成しました。

再プログラミングの前に、血液細胞は、密度勾配培地を用いて単離しました。血液細胞を5日間単離後に形質導入しました。 図1Aは、懸濁細胞のための再プログラミング法のスキームを示します。単離後、PBMCをよく非コートに山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入しました。翌日、懸濁細胞は、遠心分離を用いてビトロネクチンでコーティングしたプレート上に採取し、播種した細胞ATT一方非コーティングされたウェルに痛んだが廃棄されました。ビトロネクチンでコーティングされたプレート上に出現付着した細胞を保持し、さらに拡大しました。付着した細胞は、IPSCのメディアを使用して、毎日培地交換して維持しました。遠心分離でめっきプロセスは、残りの懸濁細胞について繰り返しました。

再プログラム性IPSCは、数日間形質導入後、その明確な形態によって区別することができました。しかし、再プログラミングの間に、純粋な形で再プログラムされた細胞を拡大することは困難でした。再プログラミングの初期段階で、性IPSCが取り付けられ、非再プログラミング分化した細胞( 図2A)と混合しました。 図2A中の矢印は、画像内のIPSC様細胞の種類を示しています。展開する前に、iPS細胞および他の細胞を区別することは困難でした。したがって、純粋なコロニーのみコロニーピッキングプロセスによって得られました。低密度で細胞を播種することにより、リットルコロニー図2Bに示すように、ピッキングのための十分なARGEが得られました。コロニーを単離した後、細胞塊は、単一の細胞培養( 図2C)に解離しました。純粋なIPSCのコロニーが( 図2D)、その後見られました。純粋性IPSCを拡大した後、細胞の品質を試験しました。細胞がiPS細胞( 図3A)の未分化状態を確認するために、アルカリホスファターゼで染色しました。孤立性IPSCすべての由来コロニーは陽性染色を示しました。多能性マーカーは、図3Bに示す免疫蛍光染色によって確認しました。再プログラムされた細胞は非常に、このような最も重要なSSEA4、OCT4、SOX2、TRA-1-81、KLF4、および、TRA-1-60のような多能性マーカーを発現しました。多能性マーカーの発現は、 図3Cに示すRT-PCRによって確認しました。蛍光データに示すように、OCT4及びSOX2は、検出されました。このようなNANOG、DPPA5、TDGF1のような追加のマーカーがpositivましたエリーも同様に発現しました。

さらなる分析のために、核型分析を行いました。 図4Aに示すように、生成されたiPS細胞は、正常な染色体パターンを示しました。真の多能性を確認するために、細胞は外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化しました。生成されたiPS細胞は、正常に、図4Bに見られる3つのすべての胚葉へ分化しました。センダイウイルスは、その統合フリー性のために知られているので、ウイルスDNAの除去は、 図4Cに示されています。ウイルスDNAを持っている傾向にあった三つのセルのうち一つでもいくつかの継代後、残っています。しかし、組み込まれた遺伝子は、プロセスをサブクローニングすることにより、取り外し可能でした。

結論として、我々は浮動PBMCからiPS細胞を生成するプロトコルを示しています。プロトコルは、高い効率を示し、血液の少量を必要としました。生成されたiPS細胞は、高い多能性を持っていたし、viのを回避しました RAL統合。

図3
図1:PBMCからIPSC生成プロトコルのスキーム。メディアタイプとタイムラインに基づいて設計されたプロトコルの詳細図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図2:PBMCから生成されたiPS細胞の明視野像。 (A)再プログラムされた細胞の初期の形態。 (B)ピッキング前コロニーのイメージ。コロニーピッキング精製工程後(C)細胞。 (D)の純粋なコロニーの形態。すべてのスケールバーは200μmで示しています。 /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "ターゲット=" _空白"> この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:iPS 細胞の多能性は、PBMCから生成されました。 (A)コロニーをアルカリホスファターゼで染色しました。生成されたiPS細胞の(B)蛍光画像。抗体希釈率を表1に示します。 (C)多能性マーカーのPCR分析。プライマーについては、 表2に提供されます。すべてのスケールバーは200μmで示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図4: 生成されたiPS細胞のさらなる分析。 (A)IPSCのノーマルkaryogram。 (B)三胚葉の分化後の細胞の蛍光画像。 (C)センダイウイルスベクターのPCR分析。非形質導入した細胞を陰性対照として使用し、そして細胞を形質導入は、陽性対照として使用した後の日に回収しました。プライマーについては、 表2に提供されます。すべてのスケールバーは200μmで示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

抗体名前 濃度
SSEA4 1:200
Oct3 / 4 1:100
TRA-1-60 1:200
Sox2の 1:100
TRA-1-81 1:100
Klf4の 1:250
アレクサフルオロ488ヤギ抗マウスIgG(H + L)抗体 1:400
アレクサフルオロ594ヤギ抗ウサギIgG(H + L)抗体 1:400

表1抗体の希釈液。

ターゲット名 方向 プライマー配列 サイズ
OCT3 / 4 フォワード ACC CCT GGT GCC GTG AA 190
GGC TGA ATA CCT TCC CAATA
SOX2 フォワード CAG CGC ATG GAC AGT TAC 321
GGA GTG GGA GGA AGA GGT
NANOG フォワード AAA GGC AAA CAA CCCのACT 270
GCT ATT CTT CGG CCA GTT
LIN28 フォワード GTT CGG CTT CCTのGTCのCAT 122
CTG C​​CT CAC CCT CCT TCA
DPPB5 フォワード CGG CTG C​​TG AAA GCC ATT TT 215
AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC
TDGF1 フォワード TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG 140
AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA
センダイウイルスフォワード GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C 181
ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC
KOS フォワード ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 528
ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG
Klf4のフォワード TTC CTG C​​AT GCC AGA GGA GCC C 410
AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA

表2.プライマー情報。

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Discussion

胚性幹細胞(ESC)は、いくつかの欠点を示しているので、代替ツールの必要性が必要とされました。したがって、山中によって誘導多能性幹細胞(iPS細胞)の開発が国際的なスポットライトの下に来ました。山中は、多能性成体体細胞にのみ4つの遺伝子を添加することによって誘導することができることを発見して以来、約10年間でした。 iPS細胞は、成熟した体細胞から「誘導され」ているので、彼らはかつてのESCに関連する懸念されていた倫理的な問題を回避することができます。 ESCは異なり、性IPSCは、各個体から生成することができます。したがって、それらは、パーソナライズされた医学研究、薬物スクリーニング、疾患モデル、または再生薬のような他の研究において使用され得ます。

最初のヒトのIPSCが正常にこの細胞型の再プログラミング2007の様々なグループに皮膚線維芽細胞から生成されたが、侵襲的な外科的処置は、この一次電池を得ることが必要でした。したがって、それは考えではありませんでした様々な疾患iPS細胞を生成するか、再生医療を設計するためのリットルソース。代替的かつ容易に得られる細胞型は、ケラチノサイト、尿単球、および血液細胞として、必要でした。しかしながら、これらの細胞が膨張しにくい、そのうちのいくつかは、汚染10のより高い可能性を有しています。

本研究では、我々が正常などのPBMCのような全血細胞からiPS細胞を生成することができるプロトコルを提示しました。特定の細胞型のいずれかの膨張過程なしに、このプロトコルは、さらに、一次血液細胞の少量から、iPS細胞を生成するための比較的簡単な方法が提案されています。 PBMCを血液から単離した後、細胞を5日間血液細胞培地中で安定化させました。導入前の安定化工程は、このプロトコルで重要でした。再プログラミング効率は、血液細胞培地中で細胞をインキュベートした後に良好でした。この培地は、CD34 +細胞の増殖のために使用しました。しかし、全血細胞は、この私の中で維持された場合5日間の直径は、細胞数は、最初の数とほぼ同じでした。全血細胞を使用して、CD34 +細胞が拡大されていたかどうかを確認することは困難でした。それにもかかわらず、安定化工程自体は成功した再プログラミングのために重要であると思われました。

形質導入後、我々は連続的遠心分離によってビトロネクチンでコーティングしたプレート上に細胞を播種しました。もともと、再プログラムされた細胞は、形質導入後、ウェルの底に沈みました。機械的な力または遠心分離で細胞を昇圧し、形質導入した細胞は付着し、増殖することができました。プロトコルは、全血の細胞を使用するので拡張しかし、異なる試料と試み試験の半分は、形態の様々なタイプをもたらしました。したがって、コロニーピッキングによって純粋なIPSCコロニーの単離は、このプロトコルで重要でした。単離されたコロニーから増殖した細胞は、純粋なiPS細胞のすべての特性を示しました。

他の利点にもかかわらず、性IPSCは持っていますいくつかのハードルを克服します。いくつかの山中因子は癌遺伝子として知られているので、性IPSCは、in vivoで腫瘍に開発することができます懸念があります。したがって、再プログラムされた細胞は、統合によって残存外因性の遺伝子発現を有していないことが重要です。 iPS細胞の現像後の早い時期には、このようなレトロウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルスは、再プログラミングのために使用しました。再プログラミングの速度が正常高い、まだこれらのウイルスは、細胞ゲノムへのランダムな組み込みを必要としました。この理由のために、他のいくつかの方法が開発されています。センダイウイルスなどのウイルスを統合せずに細胞を形質導入することが知られており、小分子およびエピソームベクターを使用して、他の方法も開発されています。本研究では、再プログラミングのためのセンダイウイルスを使用していました。積分率は、レンチウイルスに比べて比較的低かったです。我々はまた、いくつかの残りのウイルス成分が生成されたiPS細胞であったことを確認しました。 3回の試験のうち一つはintegratをもたらしましたイオン、後でも15から20の通路。しかし、この統合は、1つの単一細胞由来コロニーをサブクローニングすることにより、取り外し可能でした。我々の経験では、単一細胞由来の健康なコロニーを得るための密度は、100-mmディッシュあたり1×10 4細胞でした。完璧な円形状を生じたコロニーを採取し、残りのウイルス成分のPCRの再確認のために拡大しました。非統合された細胞由来のコロニーをさらなる使用のために維持しました。削除されると、細胞は、非統合の状態を維持します。

本研究では、血液細胞の再プログラミングのためのプロトコルを提案します。我々は、浮遊細胞の再プログラミングの速度を増加させるために、そのような連続めっきや遠心分離などのいくつかのステップを追加しました。この方法は、PBMCおよび臍帯血単核細胞(CBMCs)を用いて行きました。このプロトコルは、韓国のGMP施設でのホモ接合体性IPSCを生成するために使用されました。当社グループは、使用してIPSCの再プログラミングプロセスの加速を楽しみにしています私たちのプロトコル。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP  93100
6-well Plate TPP 92006
50 ml Cornical Tube SPL 50050
15 ml Cornical Tube SPL 50015
10 ml Disposable Pipette Falcon 7551
5 ml Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
24-well Plate TPP 92024
PBMC Isolation Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03
StemSpan STEMCELL Technologies 9805 Blood cell media
CC110 STEMCELL Technologies 8697 Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A16518
TeSR-E8 Media STEMCELL Technologies 5940 iPSC media
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TrypLE express (TrypLE) Life Technologies 12604-039
ReleSR STEMCELL Technologies 12604-039 Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin  Vector Lab SP-5050 
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated  Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer  Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Rinse Buffer
Sodium Chloride Duchefa Biochemie S0520.1000 Rinse Buffer
Tween-20 BIOSESANG T1027 Rinse Buffer
Hydrochloric Acid Duksan 1129 Rinse Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, (6), 350-359 (2012).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  5. Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44, (4), 245-255 (2011).
  6. Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7, (1), 116-125 (2015).
  7. Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
  8. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, (1), 15-19 (2010).
  9. Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2, (6), (2011).
  10. Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).

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