Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction

Immunology and Infection

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Summary

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

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Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

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Abstract

Introduction

L'objectif global de cette méthode est d'évaluer et de quantifier en phagocytose microgliale vivo avec précision. Les microglies sont les macrophages du système nerveux central (SNC) résidentes du tissu. Ils effectuent une variété de fonctions pour assurer le maintien de l'homéostasie tissulaire. Ceux - ci comprennent la surveillance immunitaire, la sécrétion de facteurs neurotrophiques et, d' une importance cruciale, la phagocytose 1. Phagocytose microgliale est la clé de plusieurs événements importants au cours du développement du cerveau et de la rétine, comme la phagocytose des synapses non pertinentes (élagage synaptique) et l' élimination des neurones apoptotiques 2-4. En outre, la phagocytose microgliale de neurones endommagés ou apoptotiques, des débris cellulaires et des microbes envahisseurs a été révélée indispensable au maintien de l' homéostasie du système nerveux central jusqu'à l' âge adulte 5. Enfin, la phagocytose microgliale a été impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer et liée à l'âgela dégénérescence maculaire, où il a été suggéré que la capacité de phagocytose défectueuse ou insuffisante peut contribuer à l'accumulation de l' amyloïde ß (Aß) , des plaques et des druses, respectivement 6,7.

fonction de la microglie est étroitement régulée par leur micro-environnement, notamment par des facteurs solubles tels que le facteur β de croissance tumorale ou les interactions cellule-cellule. Les neurones expriment constitutivement plusieurs ligands de surface cellulaire, tels que le CD200 et CX3CL1, tandis que les microglies expriment exclusivement les récepteurs respectifs CD200R et CX3CR1. Ces récepteurs contiennent immunorécepteur motifs d'inhibition à base de tyrosine (ITIM) dans leur partie intracellulaire. Ces récepteurs inhibiteurs sont essentiels pour empêcher la sur-stimulation de la microglie, ce qui peut contribuer à une neuroinflammation. Ainsi, dans des conditions physiologiques normales, les interactions cellule-cellule entre les neurones et les microglies garder microglie dans un état de repos. Pendant une lésion tissulaire, cependant, les neurones peuvent réguler vers le bas expression de ces ligands, en supprimant leur effet inhibiteur sur la microglie activation. Fonction microglial (y compris la phagocytose) est donc étroitement liée à leur microenvironnement 8. Néanmoins, à ce jour, il n'y a pas des tests standardisés pour étudier la microglie phagocytose dans un contexte physiologique ou d'une manière qui reproduit pleinement leur microenvironnement CNS.

Plusieurs dosages ont été développés pour mesurer l' activité phagocytaire des microglies in vitro, où les cellules microgliales primaires ou de lignées de cellules microgliales sont cultivées avec des cellules cibles (par exemple, les neurones apoptotiques) ou des billes marquées par fluorescence. L' absorption de la cible est alors déterminée en utilisant la microscopie à imagerie de fluorescence ou cytométrie de flux 12/09. Ces essais permettent de tester comment la manipulation pharmacologique ou génétique peut affecter la phagocytose microgliale et, tandis que d' information, ne parviennent pas à répliquer totalement le complexe dans un environnement in vivo. Les méthodes indirectes pour l'examen de la phagocytose microglialein vivo ont été rapportés: ceux - ci sont réalisés par coloration des molécules censées être impliquées dans la phagocytose (par exemple, CD68), l' évaluation de la proximité physique des microglies et des cibles pour la phagocytose (par exemple, des neurones compromis ou éléments synaptiques), soit par détection immunohistochimique de phagocytose cibles dans les cellules microgliales (par exemple, Aß) 13-17. Deux études ont utilisé des approches plus directes pour évaluer la microglie phagocytose in vivo. Hughes et ses collègues ont utilisé des techniques d'imagerie pour mesurer l' absorption de la microglie de perles livrées par voie intracrânienne 18. Sierra et al. A développé une méthode raffinée pour évaluer quantitativement la microglie phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant des techniques d'imagerie complexes 4. Cependant, ces procédés impliquent des protocoles compliqués pour la préparation des tissus, le sectionnement, l'imagerie et l'analyse. Nous avons déjà utilisé une analyse de cytométrie de flux pour évaluer la phagocytose du photorécepteur surer segments de cellules rétiniennes épithélium pigmentaire (RPE) dans la culture 19. Ici, nous décrivons un protocole pour évaluer rapidement l' absorption de particules marquées par fluorescence par microglie rétiniennes comme une mesure quantitative de la microglie in vivo phagocytose.

Le protocole que nous décrivons ici permet une mesure fiable et quantitative de la phagocytose microgliale rétinienne dans un peu moins de six heures en trois étapes essentielles: (1) la livraison de intravitréenne de particules marquées par fluorescence, (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien, et (3) Flux l'analyse cytométrique. La méthode que nous avons mis au point une méthode robuste pour évaluer la phagocytose microgliale dans la rétine, et il peut être utilisé avec succès pour tester la façon dont divers composés ou manipulation génétique modifient cette fonction clé dans la microglie paramètres physiologiques. En tant que domaine spécialisé de la CNS, la rétine est un système modèle facilement accessible pour étudier la fonction de microglies 20. Bien que cette méthode a été développée en til oeil, nous croyons qu'il peut être utile pour tous les neuroscientifiques enquête fonction microglie phagocytaire.

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Protocol

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les lignes directrices éthiques établies par l'Institut de recherche Scripps.

1. Préparation du matériel pour injection

  1. Stériliser une aiguille de 33 G et la seringue: démonter et autoclave à 115 ο C. Préparer des aiguilles d'injection par l'augmentation dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Décongeler les particules marquées par fluorescence à température ambiante pendant 5 - 10 min. Préparer une solution pour injection de particules en reconstituant une solution à 50 mg / ml dans du PBS stérile avec Ca 2+ / Mg 2+.
    NOTE: Les particules AF488 marquées d'origine fongique qui ont été validées pour des essais de phagocytose sont utilisés dans ce protocole 21-23. Pour l'absorption optimale, préparer des particules fraîches et immédiatement avant l'injection.
    Note 2: particules concentrations peuvent être optimisées pour chaque expérience spécifique.

2. intravitréenne Injection de solution Bead

NOTE: Deux people sont nécessaires pour effectuer l'injection, d'une manière telle que la personne qui effectue l'injection peut contenir la souris et maintenir la focalisation sur le globe oculaire, tandis que l'autre passe à la seringue chargée et pousse le piston.

  1. Anesthésier le rongeur par une injection intrapéritonéale de 100 mg / ml de kétamine et 10 mg / ml de xylazine à une dose de 20 pl / 10 g de poids corporel. Avant injection, utiliser pincement de l'orteil pour évaluer le niveau de l'anesthésie.
    NOTE: L' isoflurane a un effet profond sur la fonction des cellules myéloïdes, par conséquent, son utilisation tout au long de cet essai doit être évité 24,25.
  2. l'aiguille de charge avec une solution de particules de 0,5 ul d'marqué par fluorescence.
  3. Placez la souris sur le côté sous un microscope chirurgical (Figure 1A-B). Utiliser un matériau mou, par exemple un sachet de gel, pour un meilleur positionnement de la souris. Pour les jeunes souris dont les yeux ne sont pas encore ouvert, ouvrez doucement les paupières à l'aide de fines 45 o pince à angle en créant un fissure le long de la fente à partir de laquelle les paupières sera finalement ouvert.
    1. Avec l'aide d' une pince fine 45 o angle appliquer soigneusement la pression autour de la paupière, de sorte que le globe oculaire apparaît légèrement hors de la prise. Tenir la tête avec deux doigts juste au-dessus de l'oreille et par sa mâchoire et étirer doucement la peau en parallèle aux paupières pour garder l'œil légèrement hors de la prise. Veillez à ne pas saisir trop près de la gorge (figure 1B).
  4. Pour percer le globe oculaire, insérer l'aiguille de la seringue dans le limbe cornéen (où la cornée et de la sclérotique se connecter). Ceci est visible comme un cercle gris souris pigmentées. Dégager l'aiguille légèrement pour expulser un petit volume de fluide vitré, puis injecter. La personne qui effectue l'injection doit tenir doucement la souris avec une main et l'aiguille avec l'autre; la deuxième personne devrait lentement pousser le piston.
  5. Rentrez la seringue lentement. hydratante Appliquer des gouttes oculaires pour garder l'oeil hydraté. </ Li>
  6. Laissez le rongeur récupérer dans une cage sur un tampon de chaleur et de continuer à surveiller l'animal. Si vous travaillez avec des chiots, ne pas retourner l'animal dans une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il respire et capable de mouvement spontané. Si vous travaillez avec des adultes, ne pas retourner le rongeur dans une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il regagne décubitus sternale.

3. La récolte de tissu rétinien

REMARQUE: le tissu rétinien des yeux injectés non avec des particules marquées par fluorescence doivent être collectées en tant que témoin pour l'analyse cytométrique de flux. Bien que le test peut être réalisé en utilisant une seule rétine, pour une meilleure performance, deux rétines devraient être regroupées.

  1. Collecter rétinienne tissu 3 heures après l'injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence.
    REMARQUE: Pendant le temps après l'injection de la solution de particules peut être optimisée pour chaque expérience spécifique, on a trouvé que 3 heures après l'injection, l'absorption des particules pourrait être considérée dans la plupart des couches of la rétine (figure 1C-D).
  2. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale.
  3. Collecter les globes oculaires en appuyant doucement contre la paupière à l'aide de fines 45 o pince à angle pour proptose le globe oculaire. Placez la pince derrière le globe oculaire et pull.
  4. Disséquer la rétine sous un microscope à dissection. Transférez le globe oculaire à une boîte de Pétri contenant une petite quantité de PBS avec Ca 2+ / Mg 2+. Dans une zone sèche de la boîte de Pétri, perforer le globe oculaire dans le limbe cornéen avec la pointe d'une pince ultrafines.
  5. Tenez le globe oculaire avec l'aide de fines 45 o pince à angle et utiliser des ciseaux à ressort pour couper autour du limbe cornéen, jusqu'à environ la moitié de la circonférence limbe cornéen est coupé.
  6. Tenez le globe oculaire avec les fines 45 o pince à angle et porter le globe oculaire dans du PBS. Avec une deuxième paire de fines 45 o pince à angle déchirer la cornée et de la sclérotique à part. Le cristallin et la rétine sortiront intact.
  7. Séparez le cristallin et la rétine. Recueillir la rétine et transférer dans un tube à essai 5,4 ml de polystyrène contenant 2 ml de PBS avec Ca2 + / Mg2 +.

4. Préparation d'une suspension cellulaire unique

  1. Préparer des suspensions de cellules uniques en utilisant un kit de dissociation de tissu neuronal avec des modifications mineures aux instructions du fabricant. En bref, rétines Broyez par pipetage de haut en bas avec une pipette P1000 et en effectuant une digestion enzymatique à 37 ° C sans agitation.

5. Coloration Suspensions cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux

  1. Resuspendre les cellules dans 200 pi de tampon de coloration (la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec de l'albumine de sérum bovin à 0,2% (BSA) et de l'azoture de sodium à 0,09%) et transfert dans une plaque à fond en U à 96 puits. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g.
    NOTE: L'azoture de sodium est nocif pour les humains et l'environnement. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié unnd jeter les déchets conformément à la réglementation locale.
  2. Inversez la plaque sur un évier pour éliminer le surnageant. Pour bloquer les récepteurs Fc, des cellules de remettre en suspension dans 25 pi de tampon de coloration contenant 5 pg / ml d'anticorps anti-souris CD16 / CD32 par puits. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  3. Ajouter 25 pi de tampon de coloration contenant 0,5 pg / ml d'anti-souris Ly6C-APC-Cy7, 0,5 pg / ml d'anti-souris Ly6G-Pe-Cy7 et 2,5 ug / ml d'anti-souris CD11b AF650. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
  4. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g. Inversez la plaque pour éliminer le surnageant. Laver en remettant en suspension les cellules dans 200 pi de tampon de coloration.
  5. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g. Remettre en suspension dans 200 pi de tampon de coloration contenant 0,5 pg / ml d'iodure de propidium (PI). Transfert à tubes de microtitrage 1,2 ml.
  6. Laver les puits avec 100 ul un supplémentaires de tampon de coloration contenant 0,5 pg / ml de PI et une piscine avec 200 ul précédentes dans la1,2 ml des tubes de microtitrage. Un volume total de 300 ul de cellules colorées est obtenue.

6. Analyse par cytométrie en flux

  1. L'utilisation d'un trois laser classique (violet, bleu, et le laser rouge), évitez PE, PerCP-Cy5.5, BV510, et des colorants de PI en raison de retombées significatives des AF488-particules fluorescentes extrêmement lumineux. Utiliser une quatrième (jaune) laser afin d' optimiser cet essai, car elle permet un anticorps et PI marqué PE (mCherry dans le canal au lieu du canal PerCP-Cy5.5) à être utilisé (figure 2).
    NOTE: Si un laser jaune ne sont pas disponibles, utilisez un colorant mort d'exclusion de cellules dans un autre canal.
  2. Gate PI cellules négatives (PI) pour exclure les cellules mortes (figure 2B).
  3. Après exclusion des cellules mortes, porte sur des cellules positives CD11b (CD11b +), cela comprendra toutes les cellules myéloïdes (figure 2C).
  4. Au sein de la population CD11b +, porte sur Ly6C - / Ly6G - à exclureneutrophiles (CD11b + / Ly6G +) et les monocytes (CD11b + / Ly6C +; Figure 2D). Après gating sur la microglie (définie ici comme CD11b + / Ly6C - / Ly6G - pour simplifier), deux populations claires doivent être visibles; un négatif et un positif pour les particules marquées par fluorescence. Les cellules phagocytaires auront pris des particules et sont donc AF488 + (figure 2E).
    NOTE: les populations positives Ly6C positive ou Ly6G peut également être analysé pour mesurer l'absorption de particules en utilisant cette approche de coloration. Le pourcentage de cellules phagocytaires CD11b + est en bonne corrélation avec le pourcentage de phagocytose microglie (figure 2F). Pour les chercheurs sans expérience de cytométrie en flux, une analyse plus simple avec une coloration CD11b seule peut être effectuée, bien que cela comprendra des neutrophiles et des monocytes phagocytose, ainsi que des microglies. Dans ce CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> population, ces cellules sont> 99% à en juger par la microglie coloration avec les marqueurs F4 / 80 et CX3CR1; ces marqueurs peuvent être ajoutés, mais ne sont pas nécessaires dans nos mains.

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Representative Results

Ici , nous décrivons une méthode pour quantifier rapidement et de façon fiable le nombre de microglie de la rétine phagocytaires dans un milieu physiologique , en utilisant une analyse par cytométrie de flux (Figure 2). Cette méthode peut être adaptée pour tester l'effet des composés et / ou la manipulation génétique de la capacité phagocytaire microglie (figures 3A, 3B). Il peut également être utilisé chez les jeunes (10 - 20 jours après la naissance) ou des souris adultes (figure 3C). doses variables de lipopolysaccharide (LPS) ont été administrés par voie intrapéritonéale. 24 h après LPS, le protocole décrit ici a été utilisé pour évaluer la fonction microglie phagocytaire rétinienne (figure 3A). Une dose de 1,42 mg / kg de LPS a induit une augmentation statistiquement significative du pourcentage de la microglie phagocytose par rapport au véhicule témoin (figure 3B), comme on pouvait s'y attendre 26.


Figure 1: Configuration d'injection intravitréenne et représentant Retinal Section montrant des particules marquées par fluorescence dans les couches rétiniennes. (A) un bloc de gel est placé sous le microscope de dissection. (B) un rongeur est maintenu comme montré sur la position de l'œil pour l' injection intravitréenne (C) . Trois heures après l' injection des particules marquées par fluorescence peuvent être considérées couches pendant la majeure partie de la rétine. (D , les souris E) CX3CR1 GFP / GFP et des particules marquées avec un fluorochrome rouge ont été utilisés pour visualiser l' absorption de particules par la microglie. Microglie dans le plus profond (D) et (E) ont des couches superficielles des particules. Barres d'échelle -. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Stratégie Gating pour sélectionner phagocytaire microglie (A) cellules simples suspensions de tissu rétinien d'une souris de p10 sont analysés (B) Après avoir exclu les cellules mortes (PI +), (C) CD11b + cellules sont sélectionnées (D) Pour... sélectionner uniquement pour les microglies, CD11b + neutrophiles (Ly6G +) et les monocytes (Ly6C +) sont exclus. (E) microglie phagocytaire aura pris des particules marquées par fluorescence. (F) , le nombre de CD11b cellules phagocytaires + est similaire à celle de la microglie (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, regroupés à partir de trois expériences indépendantes; barres d'erreur représentent la moyenne ± SEM.rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Microglia phagocytaire Fonction peut être évaluée après LPS Challenge et dans Pups et souris adultes (A) Jeunes souris (p10) ont été contestées avec LPS intrapéritonéale à des doses variables, 24 heures avant d' évaluer la phagocytose (B) Défi avec 1,42 mg /. kg a donné lieu à un pourcentage nettement plus élevé de la microglie rétinienne phagocytaire par rapport aux commandes du véhicule (p = 0,0021). (C) Ce protocole peut être utilisé pour mesurer la fonction phagocytaire microgliale rétinienne chez les souris adultes et chiot de même. Il y a un pourcentage significativement plus faible de la microglie phagocytaire chez les souris adultes par rapport aux jeunes (p10) souris (p = 0,019) pas contesté par le LPS. n = 9 -12, mis en commun trois à quatreexpérience indépendante; barres d'erreur représentent la moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Il y a trois étapes critiques dans cette méthode: (1) l'injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence; (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien; et (3) l'écoulement analyse cytométrique. Nous recommandons que les chercheurs pratiquent des injections intravitréennes avant d'effectuer la méthode que nous présentons ici. Souris albinos (par exemple, BALB / c) et une solution de couleur (par exemple, des particules marquées par fluorescence) peuvent être utilisés pour faciliter la visualisation de l'aiguille et de la solution injectée. injections intravitréennes sont difficiles et si pas effectué correctement conduiront à des résultats biaisés et variables. Les problèmes courants associés à la mauvaise technique d'injection sont perforation de la lentille et / ou des dommages à la rétine, ce qui peut entraîner des saignements et l'inflammation. Pour réduire au minimum le risque de traumatisme à l'œil, le rongeur devrait être dans une position stable avec le mouvement de la tête minimale. Pour pénétrer dans le globe oculaire, la seringue doit être inséré lentement et ne pas pousser trop loin pour éviter de heurterla lentille. Une autre complication fréquente est le reflux de la matière injectée hors de l'œil. Pour éviter cela, le plongeur doit être enfoncé lentement et, après l'injection, le globe devrait être autorisé à se rétracter dans l'orbite de l'œil et de la seringue doit être rétracté lentement. Les meilleures injections intravitréennes activent les microglies à des niveaux faibles, mais des différences claires entre les groupes traités et non traités peuvent être mesurés. Il est essentiel que les contrôles appropriés (par exemple, les souris non contestées) sont utilisés dans chaque expérience pour établir les niveaux de référence phagocytaires. Un autre aspect de cette méthode qui exige la pratique est la dissection de la rétine. Pour assurer des préparations de cellules unique comparables entre les spécimens, le tissu rétinien doit être collecté rapidement et avec une perturbation minimale de tissu possible. Effectuer les dernières étapes de la dissection dans du PBS (voir 03.04 à 03.07) va faciliter la collecte. Enfin, il est important de préparer le tissu rétinien pour cytométrie en flux correctement. microglies activées régulent positivement Fcrécepteurs et donc une liaison non spécifique à la partie Fc des anticorps peuvent se produire 7. Un bloc Fc doit être effectuée afin d'éviter une coloration non spécifique. Sélection des fluorophores et indemnisation mis en place appropriées est également important 27.

Nous utilisons régulièrement des souris âgées de 10 à 20 jours après la naissance pour ces expériences. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour évaluer la fonction de phagocytose microgliale chez la souris adulte (figure 3C). Il convient de noter, en raison de la présence de la vascularisation hyaloïde, les populations de cellules myéloïdes exogènes (Ly6C + ou Ly6G +) sont plus importants chez les jeunes souris (environ 40 - 50% de toutes les cellules CD11b +) que chez les adultes (environ 5% de tous CD11b + cellules). Les chercheurs devraient déterminer l'âge le plus approprié pour leurs expériences. Le protocole présenté ici permet une détection robuste des niveaux de microglie phagocytaire dans la rétine. Cependant, nous recommandons que trois à quatre biologiqueal réplicats être utilisé dans chaque expérience et qu'au moins trois expériences indépendantes sont effectuées. Bien que les particules utilisées dans ce protocole ont été validés pour des essais de phagocytaires 21-23, si la validation supplémentaire est nécessaire, immunohistochimique co-localisation des particules avec des marqueurs phagocytaires spécifiques pourrait être effectuée.

Une limitation potentielle de cette méthode est l'accès différentiel de la microglie aux particules. Dans la rétine normale, se trouvent dans la microglie deux couches, la couche la plus profonde plexiforme externe et la couche plexiforme interne plus superficielle qui est plus proche du corps vitré 7. Lors de la stimulation, ou au cours du vieillissement, les microglies peuvent migrer dans toutes les couches de la rétine. Dans ce procédé, les particules marquées par fluorescence sont injectées dans le corps vitré. Trois heures après l'injection il en résulte une accumulation de particules à travers la rétine, et en particulier le long de la surface vitréenne. Les chercheurs peuvent en outre optimiser les concentrations dsur des particules ou de temps après l'injection pour leurs expériences. Il est probable que la microglie à proximité plus proche du corps vitré auront plus facilement accès aux particules. Cependant, nous montrons que les particules réparties sur la rétine et sont absorbés par les cellules microgliales dans toutes les couches , mais non dans les cellules de la rétine épithélium pigmentaire (RPE), probablement en raison d' un accès limité à billes (figure 1C-E). Nous avons encore à déterminer si les microglies sous-rétinien (qui peut accumuler avec l'âge) aurait accès aux particules. Si cela est important pour le chercheur, ce protocole pourrait être effectuée après l'injection sous-rétinien attention des particules. Une autre considération importante est qu'il peut y avoir intrinsèquement différents comportements entre les microglies rétinienne et microglie dans d'autres régions du SNC. Il est bien connu que certaines régions du cerveau ont des sensibilités différentes à la maladie. Par exemple, dans la maladie de Parkinson, les neurones du locus niger sont le plus souvent affectés, tandis que dans Alzla maladie de heimer, les neurones hippocampiques sont principalement affecté 28. Ainsi, lors de l'étude de la pathologie d'une maladie spécifique, dans la région du cerveau est susceptible d'être un facteur important. Un protocole similaire à celui décrit ici pourrait être effectuée après l'injection intra-crânienne pour explorer les différences possibles dans la réponse phagocytaire entre la microglie de la rétine et du cerveau. La rétine a de nombreuses caractéristiques communes avec d' autres régions du cerveau, y compris la présence d'un hémato-rétinienne barrière 20. Microglie Retina et le cerveau microglie proviennent des mêmes progéniteurs jaune-sac et semblent très similaires à l' égard de la morphologie et de la surface cellulaire marqueur expression 7,29. En outre, plusieurs maladies du cerveau (par exemple, la maladie d'Alzheimer, accident vasculaire cérébral et la sclérose en plaques) ont des manifestations oculaires, ce qui indique que la rétine est également affecté 20. Bien que les chercheurs doivent être conscients des différences régionales potentielles, nous pensons que cela est un modèle d'information pourtoutes les recherches de la microglie, et suggèrent que tous les neuroscientifiques étudient phagocytose microgliale pourraient utiliser ce protocole.

Un avantage distinct d'effectuer ce test dans l'oeil est que de multiples techniques ont été développées pour induire diverses contraintes neurogènes dans la rétine, et les réactions de stress peuvent être surveillés in vivo et quantifiés en utilisant des protocoles normalisés 30. En induisant le stress neurogène et ensuite effectuer le test décrit ici, les chercheurs peuvent analyser la fonction de la microglie dans un large éventail d'insultes qui varient en gravité. Enfin, lorsqu'il est combiné avec de cytométrie de flux techniques de tri, ce protocole a l'avantage sur immunohistochimie qu'il peut permettre à une analyse approfondie de la microglie phagocytaire (par exemple, qPCR, culture cellulaire, protéomique).

L' absorption de particules a déjà été utilisé pour mesurer la fonction phagocytaire, à la fois in vitro et in vivo. Le latter impliqué injection intracrânienne de particules, la récolte et la congélation des tissus du cerveau, cryosectioning, immunomarquage, l' imagerie et l' analyse post-imagerie 18. Le protocole présenté ici permet une quantification plus rapide de la fonction rétinienne microglie phagocytaire. Il a l'avantage par rapport aux systèmes in vitro que les microglies très sensibles ne sont pas retirés de leur microenvironnement, permettant l' évaluation de la fonction phagocytaire dans un contexte physiologique. Plus précisément, elle doit permettre le test de la façon dont des défauts dans d' autres types cellulaires (par exemple, l' ablation génétique de gènes dans les neurones) influent sur la fonction de phagocytose microgliale. Il a également l'avantage par rapport précédent essais in vivo qui utilise la cytométrie en flux, ce qui permet une détection rapide, quantitative et précise des populations de cellules phagocytaires.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

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References

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