שיטה חדשנית עבור chemiluminescence יצירה וההתבוננות בסביבה ביולוגית

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

בעשורים האחרונים, טכנולוגיות הדמיה חוללו מהפכה באופן שבו רופאים לאבחן ולנטר מחלות. טכנולוגיות הדמיה אלה, עם זאת, היו מוגבלים בעיקר למערכות הדמיה הגוף כולו, כגון טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), תהודה מגנטית (MRI). תשומת לב מיוחדת הוקדשה סרטן, ופריצות דרך הדמיה טכנולוגית שיפרו באופן ניכר את הדרך כי מחלה זו מאובחנת ומטופלת. למרות ההתפתחויות הללו, יש מקום אחד שבו טכנולוגיות הדמיה אלה פשוט לא מתאימים: בחדר הניתוח. בעוד שיטות הדמיה הגוף יכול לעזור בתכנון כירורגי, הם בדרך כלל חסרי החלטות מרחבית גבוהה מספיק כדי לעזור לרופאים לקבוע בזמן אמת אם כל רקמת הגידול הוסר או רקמת הגידול שיורית נשאר מוסתר בשולי כירורגית 1. שים לב שאף infiltrativeשולי גידול נשארים מאחור הוא אחת המטרות כירורגי החשובות ביותר, ומנתחים חייבים ללכת על חבל בין כריתת רקמה הקפדנית וזהירה. אם יותר מדי מוסר, תופעות לוואי בלתי רצויות עבור המטופל הם החריפו; אם מעט מדי מוסר, שיעורי הישנות גדלו 2, 3. לכן, חשוב להתוות שולי גידול מדויקים, ואנו מאמינים כי הדמיה תוך ניתוחית chemiluminescent יכולה לעזור לשפר את הדיוק של זיהוי של שולי גידול על ידי עוזר למנתחים לדמיין רקמות ממאירות שיכול אחרת להישאר מבלי שיבחין בו עם טכניקות הוקמו.

ישנן טכנולוגיות הדמיה רבות נחקרות כעת עבור השירות האפשרי שלהם כמו מערכות הדמיה תוך ניתוחיות. אלה כוללים בדיקות β- ו פולט γ-קרינה 4, אופטית קרינה 5, ספקטרוסקופיית ראמאן 6 >, 7, ו Cherenkov הארה 8, 9. עד כה, עם זאת, כל אלה לא הפכו הוקם ככלים קליניים רגילים. דימות פלואורסצנטי אופטי עד כה הוכיחה להיות המבטיחים ביותר של טכניקות אלה היא אפוא בחנו ביותר. אמנם זה כבר הוכח להיות כלי רב ערך עבור יישומים רבים, זה לא בלי המגבלות. ואכן, החסרון העיקרי שלה היא קרינת הרקע שנוצרה על ידי רקמה ביולוגית מטבעו autofluorescent. אות הרקע autofluorescent זהו מוצר של עירור של הרקמה הסובבת, בנוסף fluorophore, על ידי מקור אור חיצוני הדרושים לייצור אות ניאון. מנקודת מבט מעשי, autofluorescence הללו עשויים להוביל יחסי אות לרעש נמוכים, אשר יכול להגביל את התועלת של טכנולוגיה זו בחדר הניתוח.

המנהליתרון של הדמית chemiluminescence על דימות פלואורסצנטי הוא שאף אור עירור הוא הכרחי. כתוצאה מכך, אין autofluorescence רקע. בשנת הדמית chemiluminescence, אנרגית עירור במקום מופקת כימית. תהליך זה לא מייצר אות רקע לא מכוונת ולכן יכול לגרום יחסי אות לרעש גבוהים. בסופו של דבר זה עלול לגרום זיהוי מדויק יותר ומדויק של שולים כירורגית. באופן מפתיע במקצת, את התועלת של גישה זו כטכניקת הדמיה תוך ניתוחית נותרה 10 נחקרה. ואכן, הדוגמה הקרובה ביותר בטכניקה זו הוא חמצון של לומינול ידי myeloperoxidase בעכברים 11, 12, 13. הדמית ביו Chemiluminescent לכן אזור נחקר למדי של מחקר שיכול להציע את היתרונות הבאים: (1) autofluorescence המינימאלית וכתוצאה מכך אות רקע נמוכה עם ההייאות לרעש gher יחסי; (2) באורכי גל מתכונן פליטות chemiluminescent החל גלוי קרוב אינפרא אדום; ו (3) מתחמי chemiluminescent functionalizable כי, בשילוב עם טכנולוגיות מקשרות וממוקדים ביומולקולות שכבר קיימות, לספק גישה לספריות שלמות של בדיקות הדמיה מולקולריות ממוקדות 14.

הוכחה של עיקרון זה מחקר ממחיש את התועלת הפוטנציאלית של הדמית chemiluminescent בסביבה ביו באמצעות סוכן הדמיה מבוסס רותניום. המאפיינים chemiluminescent של תרכובת זו נלמדים היטב, עם חקירות שראשיתה באמצע שנות ה -1960 15. עם ההפעלה כימית, הסוכן מפיק אור בסביבות 600 ננומטר 16, וזה גם מתאים למטרות הדמיה רפואיות. אנרגיית השפעול מסופק על ידי תגובה חיזור שמוביל מדינה-אשר נרגש יש תוחלת חיים של 650 ננו-שניות במים 17 -follחוב על ידי הדור של פוטונים על הרפיה של מדינה מתרגשת זה. באמצעות השימוש של nebulizer מרחוק ומעוצב, הצלחנו לזהות את המתחם הוא vivo לשעבר in vivo. תוצאות הניסויים הראשוניים הם מאוד מבטיח, דבר המצביע על חקירה נוספת של טכנולוגיה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בבעלי חי in vivo תארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ותחת ההנחיות האתיות של מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג (MSK) המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. בניית תקן Nebulizing

  1. צרף עץ חלק (12.5 x 2.5 x 1.8 ס"מ 3) זקוף במרכז B חלק (12.7 x 10.7 x 1.8 ס"מ 3) באמצעות שני ברגים (4 x 25 מ"מ 2). צרף C חלק עץ (11 × 2.5 × 1.8 ס"מ 3) עד אמצע חלק (12.5 x 2.5 x 1.8 ס"מ 3) באמצעות בורג אחד, כך חלק ג (11 x 2.5 x 1.8 ס"מ 3) עדיין יכול להתרגש. ראה איור 1.
  2. מקדחה שני חורים דרך הקצה התחתון של הדק תרסיס בקבוק מרסס מיני פלסטיק 3 עוז (D) ולדחוף מוט נירוסטה (10 סנטימטרים של 1/16 "פלדה) (E) דרך ליצירת שתי לולאות, אחד משני הצד של ההדק. לעטוף את החלק התחתון של בקבוק ספריי עם סרט דביק (F) כדי למנוע קשרים כבל מלהחליק וליפול. צרף את בקבוק התרסיס ל- C עץ חלק (11 x 2.5 x 1.8 ס"מ 3) באמצעות שני קשרים כבל פלסטיק (28 ס"מ) (G).
  3. חותך את מנוע סרוו 011 (I) ולחבר אותו עם הכבלים הרופפים של שרת השליטה (H). לאחר מכן, לצרף את מנוע סרוו לחלק העליון של עץ חלק (12.5 x 2.5 x 1.8 ס"מ 3) באמצעות סרט דביק.
  4. צרף עיפרון (J) אל ידית מנוע סרוו באמצעות מהדק נייר (K). בחוזקה לחבר את החלקים החיצוניים ביותר של עיפרון לולאות מוט פלדה באמצעות חוטי טוויסט מכוסה פלסטיק (L) ולאבטח את הקצוות על העיפרון עם סרט דביק.
  5. חותכים את מחבר כבל מגנטי של יחידת הבקרה מנוע סרוו (M) ולחבר אותו לכבל הרמקול (N). לאחר מכן, תדביקו את יחידת בקרת מנוע סרוו עץ חלק ב '(12.7 x 10.7 x 1.8 ס"מ 3). חותך כבל W1 עם מחברים מגנטיים לשניים לצרף חלק אחד אל קצה החוט של ים הנחושתכבל peaker (1 מ '). חבר את המתג למתג i2 (המגנטי) וכוח p1 לכבל W1 הזמין וסוללת 9V.

קביעת רגישות 2. של השיטה

  1. בתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, להכין פתרונות של [Ru (bpy) 3] Cl 2 במים אוסמוזה הפוכה (100 μL) בסכומים של 260 מיקרוגרם (347 nmol), 52 מיקרוגרם (69 nmol), 26 מיקרוגרם (34 nmol) , 5 מיקרוגרם (6.9 nmol), 3 מיקרוגרם (3.5 nmol), 520 ננוגרם (694 pmol), 260 ננוגרם (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6.9 pmol), ו -3 ng (3.5 pmol).
  2. מערבבים 100 μL של כל [Ru (bpy) 3] Cl 2 פתרון עם 100 μL של בתמיסה מימית של חנקת cerium אמוניום ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) במים (25 מ"מ) בשקופית מיקרוסקופ.
  3. הגדר את הרכישה אצל קורא פליטת האור על ידי אתחול תוכנת ההדמיה.
    1. כניסה לפרופיל המשתמש ולחפש את Acquiלוח הבקרה sition. לחץ על "אתחול" ולהמתין עד שהמכשיר מוכן.
    2. חפש "הדמיה מצב" ולוודא "פלורסנט" ו- "תצלום" נבדקים וכי "פלורסנט" אינה מסומנת.
    3. שינוי "זמן חשיפה" הגדרה "פלורסנט" כדי 20 שניות. הגדר את שאר ההגדרות עבור "פלורסנט" כדלקמן: "כלי קיבול": בינוני; "F / stop": 1; ו "מסנן פליטה": Open.
      הערה: זמני חשיפה אולי צריך להיות מותאם לפי מכשור הגדרת הניסוי נעשה שימוש, אם שונה מההגדרה של המוצגים.
    4. עבור "צילום" השתמש בהגדרות הבאות: "זמן חשיפה": Auto; "כלי קיבול": בינוני; ו "F / stop": 8. להתאים את "גובה נושא" על פי הדמיה target.Look עבור "תצוגה של שדה" התפריט הנפתח. ההגדרה הראשונית היא "ג" עבור ל"מצב סימון "B" (14 מרחק ס"מ בין גamera ושלב מדגם).
  4. הגדרת nebulizer ידי צבת שקופיות מיקרוסקופיות על גיליון נייר הבנייה שחור על הרצפה של חדר ההדמיה כדי להגן עליו מפני חמצון הסוכן. מערבבים 100 μLdroplet של [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution עם 100 μL של בתמיסה מימית של (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. שים את הכוונת הקופסה הירוקה.
    1. מניח את נושא ההדמיה על נייר הבנייה השחור, כך השטח של עניין נמצא במרכז כוונת תיבת האור הירוקה מוצג על הבמה המדגמת. הכן את nebulizer ידי ניתוק בקבוק ספריי פלסטיק מתמיכת העץ. מלאו פתרון של triethylamine (1: 3 במים / אתנול) לתוך מאגר הפלסטיק שלה לחבר אותה מחדש לתמיכת העץ.
    2. מניח את nebulizer בתוך קורא פליטת האור ולוודא כי כבל החשמל מנותק מן כבל nebulizer. ודא שמתג ההפעלהעל הוא, שהמתג נמצא במצב כבוי, ואת הנורית האדומה דולקת מניחים את nebulizer כזה שהזרימה ספריי הוא הצביע לעבר שטח של עניין בנושא הדמיה, תוך מזעור החסימה להציג מהמצלמה אל נושא הדמיה ידי ראש זרבובית תרסיס.
    3. מקום קטן, כלים שחורים של נייר הבנייה במשך כל נקודות חמות פוטנציאל (למשל, סימנים לבנים על שקופיות מיקרוסקופיות או מוזרקים) כדי להגן עליהם מפני תרסיס. מקום לפחות 40 סנטימטר של החוט מרחוק nebulizer בתוך חדר ההדמיה, כך שהיא לא תפריע עם נושא ההדמיה, nebulizer, או את בריח הדלת המגנטי. סגור את דלת מערכת הדמיה.
      הערה: crosshair ישתנה גודל מבוסס על "השדה של תצוגה" הגדרה "Living תמונה;" לוודא כי זה מוגדר "B".
  5. לרכוש תמונה על ידי ייזום רצף הדמיה. לחץ "לרכוש" את "לוח בקרת הרכישה". על sequ ההדמיה הראשוןence, לאפשר שמירה אוטומטית במקרה הצורך (מומלץ) ובחר בתיקיית הנתונים. התעלם בתיבת הדו-שיח 'תוויות הדמיה הערוכה "עד סוף את הרצף.
    הערה: תוכנות שליטה ומציג את הפעולות של המכשיר שלב-אחר-צעד בזמן אמת. לאחר הכנת המדידה והזזת הבמה מדגם אל המיקום הנכון, זה פותח את תריס המצלמה וסופרת את זמן המדידה. פתיחת התריס ניתן לשמוע גם על ידי צליל קליק שנוצר על ידי מכונה.
  6. כמו תריס נפתח, לרסס שלוש התפרצויות של פתרון של triethylamine (1: 3 במים / אתנול, 0.24 ± 0.04 מ"ל לכל פרץ ספריי) על ידי החלפת מתג למתג שלוש פעמים כדי ליצור chemiluminescence.
    הערה: השלב המדגם יעבור במהלך המדידה. השאירו מספיק (מינימום 40 ס"מ) כבל בתוך המכשיר כדי לאפשר זאת. ודא כי הפתרון להיות מרוסס על ידי nebulizer ניתן שאפו על ידי צינור עולה וכי אין בועות אוויר בצינור. יש כמה batterie חילוףים עבור nebulizer מוכן למקרה הצורך.

3. הדמיה Vivo לאחר הזרקת מערכתית תוך ורידי

  1. בתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, להכין 100 μL של בופר פוספט (PBS) בתמיסה המכילה בין 8 ל 33 nmol של [Ru (bpy) 3] Cl 2. הכן תמיסה מימית של (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 במים (25 מ"מ) בעת ובעונה אחת.
  2. לווריד להזריק 100 μL של [Ru (bpy) 3] Cl 2 לווריד הזנב של עכברים בריאים (n = 5).
  3. להרדים את העכברים 10 דקות לאחר ההזרקה באמצעות מחנק CO 2.
    1. הסר את העור עם בחיתוך Y מהגוף, ולאחר מכן להסיר את קשת costal בצורת U-כדי לחשוף את הלב והריאות. Perfuse את העכברים על ידי חיתוך פורקן אטריום ימין והזרקת 20 מ"ל של PBS באמצעות מחט 24 מד לתוך החדר השמאלי 18. בזהירות לחתוך דרך הבטןהעור ולחשוף את הכליות והכבד. חותכים longitudinally דרך איברים ליצור חתך גלוי.
  4. הגדרת הרכישה כמתואר בשלבי 2.3-2.6, בשינויים הבאים.
    1. לאחר ביסודיות שטיפת המאגר פלסטיק nebulizer, למלא אותו עם תמיסה של (4 NH) 2 Ce (NO 3) 6 במים (25 מ"מ) במקום triethylamine.
      הערה: חשוב לשטוף את הפייה nebulizer ביסודיות לאחר כל שימוש, מאז גיבוש (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 עלול להרוס את זרבובית תרסיס לאחר מספר שימושים.
  5. השתמש בדגימות חיים או איבר שלם הדמיה.
    1. עבור הדמיה הבטן כולה, מקם את פגר עכבר עם הבטן פתוחה עם הפנים למצלמה וראש מצביע על החלק האחורי של המכשיר. מרכז את האיבר להיות צלם (למשל, כבד או כליה) מול כוונת תיבת האור הירוקה.
    2. Fאו בודדים הדמיה וכימות איבר, להסיר את העכבר מהמכשיר הדמיה בזיהוי מדויק. החל מחלל הגוף כבר נפתח, שיחתוך את האיברים הפנימיים (למשל, כליות, כבד, ריאות, שרירים, טחול, מוח ולב). חותך דרך עור הרגל האחורי שיחתוך רקמת שריר. בזהירות לפתוח את הגולגולת עם אזמל שיחתוך את המוח.
      1. אם האיבר של עניין הוא כבד, כליות או טחול, לחתוך את כל האיברים בחצי אורכים, במקום כל איבר על צלחת או חתיכת פטרי של נייר הבנייה שחור.
    3. בצע את ההליך מתואר צעדים 2.3-2.6 להקים הפליטה היחסית של נותב chemiluminescent עבור איברים יחידים.

4. Vivo הדמיה של בלוטות לימפה

  1. הכן 10 μL של פתרון PBS המכיל 80 nmol של [Ru (bpy) 3] Cl 2. הכן תמיסה מימית של (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 ב water (25 מ"מ) בעת ובעונה אחת.
  2. להזריק 10 μL של הפתרון subdermally לתוך הכף האחורית של עכברים בריאים (n = 5). כביקורת שלילית, להזריק את הכף הנגדית עם 10 μL של PBS הטהור. להקריב את העכברים באמצעות מחנק CO 2 15 דקות לאחר ההזרקה. הסר את העור על שתי רגליו האחוריות כדי לחשוף את תעלות הלימפה עד בלוטות הלימפה popliteal.
  3. הגדר את הרכישה כפי שמתואר בשלב 3.4.
  4. הסר את בלוטות הלימפה popliteal משני הרגליים האחוריות, לחתוך אותם לשניים, ולרסס אותם עם חמצון על צלחת פטרי, כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.5.3), לצורך כימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכת nebulizer בסעיף פרוטוקול 1 ניתן לבנות מחומרים-זמינים בקלות ובעלות נמוכה. היא נועדה להיות הבלעה לריסוס מרחוק מופעל של סוכן ההפחתה / חמצון בתוך קורא bioluminescent (איור 1). העיצוב שלנו מאפשר הפעלה בטוחה של nebulizer בתוך הקורא פליטת אור ממרחק 14 ס"מ מהעדשה. אין אדים או טשטוש של העדשה נצפו במהלך המבצע. בחרנו סוכן chemiluminescent-הזמין המסחרי [Ru (bpy) 3] Cl 2 לפיתוח השיטה שלנו מבוסס על המחיר הנמוך שלה, יציבות בתמיסה מימית, התנהגות חיזור-מיטיבים לתאר, ומאפייני chemiluminescent (איור 2) 19. האות ניתן לגילוי מינימלי ניתן לקבוע כמפורט בסעיף פרוטוקול 2 על ידי חמצון טיפה אחת של [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 μL, 6.9 pmol- 347 nmol ב H 2 O) עם (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 μL, 25 מ"מ) בשקופית מיקרוסקופ. לאחר מכן, באמצעות nebulizer וריסוס על פתרון של triethylamine (1: 3 במים / אתנול), האות chemiluminescent מופעלת. במקרה שלנו, את האות לזיהוי מינימלי היה נחוש בדעתו להיות 6.9 pmol / 2 ס"מ (איור 3). זה מתקבל על דעת, אם כי, כי אופטימיזציה תנאי תגובה, רגישויות מצלמה, פעמי תריס, כרכים, וריכוזים מגיבים עלולים להוביל ספי זיהוי נמוכים עוד יותר. תנאי תגובה אלה יכולים לשמש גם עבור חקר ובדיקת chemiluminescence של כל שילוב נתון של מתחמי מתכת, סוכני חמצון, ו reductants.

מעבר לשימוש בניסויים vivo בסעיפים פרוטוקול 3 ו -4, עכברים בעירום (outbred) נקבה בת 5-6 שבועות עכברים זכרים NU / J 6-8 שבועות היו בשימוש. עבור זריקות תוך ורידים, סכומים8-33 nmol של [Ru (bpy) 3] Cl 2 ב 100 μL של PBS לכל עכבר (n = 5) נבחרו. החיות הוקרבו 10 דקות לאחר ההזרקה, ואת חלל הבטן נחשף. העכברים הונחו קורא bioluminescent עם nebulizer והצביע לעבר ברקמות של עניין (איור 4). עבור הדמיה עם-מוזרק לווריד [Ru (bpy) 3] Cl 2, האות chemiluminescent זוהה בעיקר בכליות, דבר המצביע על חיסול כליות חריפה של מולקולה קטנה הידרופילי (איור 5). אות לרעש יחס עבור עכברים שהוזרק עם [Ru (bpy) 3] Cl 2 לעומת PBS היו 27/1 עבור כליות 21/1 עבור הכבד. עבור הדמיה של בלוטת לימפה, 80 nmol של [Ru (bpy) 3] Cl 2 ב 10 μL של PBS הוזרקו subdermally לתוך כרית הרגל האחורית של עכברים (n = 5). עכברים הוקרבו 15 הזרקת דקות פוסט בחנק CO 2. העור המכסה הוא את ווה רגליים האחורי הפנימיs הוסר כדי לחשוף את השרירים, בלוטות הלימפה וכלי הלימפה. להדמיה chemiluminescent העוקבת של בלוטות לימפה popliteal הוביל התצפית כי בלוטות לימפה המכילים [Ru (bpy) 3] 2+ להראות 10 ± 4.3 לקפל זוהר גבוהים מבתי מטופל (167,000 p / (ים × SR × 2 ס"מ) ו 17,000 p / (ים × SR × 2 ס"מ); P <0.028) (איור 6).

איור 1
איור 1: צילום של Nebulizer. חלקים בשימוש: חלקי מבנה עץ (A, B, C), בקבוק ספריי (D), מוט פלדה מכופפת (E), סרט דביק (F), קשרי כבל פלסטיק (G), 011 חלק מחבר סרוו (H), מנוע סרוו (I), עיפרון ( J) המוחזקות על ידי מהדק נייר מכופף (K), קשרי טוויסט תיל מכוסה פלסטיק (L) מחבר חוט W1 (M) ואת כבל רמקול (N) מוביל אל הסוללה. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור נ"צ erence 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. על מאפיינים של [Ru (bpy) 3] 2+. מבנה (א) ו עירור ספקטרום הפליטה (B) של [Ru (bpy) 3] 2+. חמצון / הפחתה מבוסס מחזור קטליטי chemiluminescent (C). נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בהתייחס 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

page = "1"> איור 3
איור 3: איתור סף [Ru (bpy) 3] 2+. עוצמות אות נציג בריכוזים שונים של [Ru (bpy) 3] 2+ בשקופית מיקרוסקופ (א). כימות אות הדמיה עם סף זיהוי (קו מקווקו אדום) ורקע (קו מקווקו שחור) (B). נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בהתייחס 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הדמיה chemiluminescence. ציור סכמטי של עכבר וכן nebulizer מיקומו של קורא פליטת האור g>) ו ציור סכמטי (B) של nebulizer ריסוס על עכבר. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בהתייחס 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: איתור של [Ru (bpy) 3] 2 + לאחר מנהל מערכתי. אור לבן, chemiluminescence, ואת הכיסוי (משמאל לימין). תמונות של חלל הגוף העכבר כי הזריקו 33 nmol של [Ru (bpy) 3] 2+ וריסס עם (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. נקודות החץ הלבנות לכיוון בכליה הימנית. נתון זה מבוסס על מחקר שפורסם במקור בהתייחס 19."Target =" ftp_upload / 54,694 / 54694fig5large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: איתור של [Ru (bpy) 3] 2 + לאחר מינהל subdermal. Popliteal הדמיה בלוטת לימפה בקע אור, chemiluminescence לבן, ותמונות מרוכבים עבור עכברים שהוזרק עם [Ru (bpy) 3] 2 + (למעלה) ו- PBS (למטה) בגפיים האחוריות; 80 nmol ב 10 μL של PBS, צלם 15 דקות לאחר ההזרקה (א). אור לבן תמונות מרוכבים עבור [Ru (bpy) 3] 2 + (למעלה) ו- PBS (למטה) -treated ניכרים בלוטות לימפה popliteal (B). כימות של אותות chemiluminescent עבור PBS ו [Ru (bpy) 3] 2 + בלוטות הלימפה -treated (C) נתונים .the מייצג את ממוצע ± סטיית תקן. נתון זה מבוסס על מחקר במקורפרסם inreference 19. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנה, יש לנו הצגתי טכנולוגיה שמסוגלת המגדיר רקמות אופטיות באמצעות פליטת הפוטונים נוצרו על ידי עיתונאי chemiluminescent. בניגוד אחר, מבוסס יותר, טכנולוגיות 4, 5, 6, 7, 8, 9, מערכת הכתב chemiluminescent זו מעסיקה חללית הדמיה כי הוא לא רדיואקטיבי ומקל זיהוי ברמות רגישויות גבוהות מאוד. אולי אפילו יותר חשוב, הדמית chemiluminescence אינה דורשת מקור אור אירוע (כמו דימות פלואורסצנטי אופטית) 20, תכונת ממזער autofluorescence ו דרסטי מפחית אותות רקע.

הכתב רותניום [Ru (bpy) 3] Cl 2 יש in vivo רעילות נסבלת למטרות הדמיה (intLD העכבר raperitoneal 50: 20 מ"ג / ק"ג) 21, הוא מסיס במים (עד 8 מ"מ), והוא יציב בזרם הדם. מאפייני physicochemical של מתחם המתכת הם היטב מאופיינים וכבר נחקרו עבור טיפול פוטודינמי לסרטן 22, 23. סוכן החמצון (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 דווח יש רעילות נמוכה מאוד (LD חולדה אוראלי 50: 1600-3200 מ"ג / קילו) 24 והוא מסיס במים בריכוזים של עד 2.57 M ב 20 ° C 25. במאמר זה, הפגנה ויזואלית כמו גם הדרכה מבוססת טקסט לבניית מכשיר nebulizing מרחוק מופעל מוצגות. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקולים עמידים לביצוע הדמיה chemiluminescence במכשיר הדמיה פליטת אור רגיל. אנו מדגימים את השימוש [Ru (bpy) 3] Cl 2 עבור visualizatiעל רקמות לאחר זריקות תוך ורידית subdermal הן בעכברים.

עם זאת, כמו כל טכנולוגית הדמיה מתהווה אחרת, יש מקום לשיפור של הפרוטוקולים שלנו. אנו מאמינים כי ההוכחה של עיקרון זה מחקר יכול לדרבן את הפיתוח של יישומי chemiluminescence מרובים עבור חי מערכות. הנקודות הבאות ניתן לטפל על מנת לשפר יותר את הטכנולוגיה ולהרחיב את היקפה.

דור השני קטן של מכשירי ריסוס מופעלים מרחוק יאפשר את המדגם כדי להיות קרוב יותר אל המצלמה, ומכאן שיפור ברזולוציה מרחבית. ציוד אופטי משופר עשוי לשפר עוד יותר את מגבלות זיהוי של השיטה. הפרוטוקול יכול להיות גם מורחב הדמיה בבעלי חיים. שליטה מדויקת של מומנט (על ידי זרם ומתח) תאפשר שליטה מדויקת יותר של היקף מגיב שוחרר עם כל ספריי. חשוב לשמור על nebulizer מתוחזק היטב. לא שטיפת nebulizer עלול להרוס את nozzle. מצבר טרי הוא חיוני לביצוע התקין של nebulizer. עם זאת, כל החומרים המשמשים עבור nebulizer זולים וזמינים מסחרי. בעקבות פרוטוקולים סינטטיים הוקמו, [Ru (bpy) 3] 2 + מורכבים ניתן לשנות בקלות עם linkers השונה, כולל maleimides 26, אמין 27, אסטרים NHS 28, 29. הדבר יאפשר bioconjugation מולקולות קטנות, פפטידים, או נוגדנים, ושהם ובכך להקל ספציפיים מולקולרית מיקוד 30, 31, 32, 33. בסופו של דבר, אספקה ​​בדיקה ממוקדת עשויה לאפשר למנתחים לזהות נגעים קטנים להתוות שוליים כירורגיים במדויק בחדר הניתוח עם ייחוד גבוה מאוד. כמו כן, אנקפסולציה של [Ru (bpy) מסיסים במים מאוד 3] 2 + ננו-הוא ממוקד ממוקד-עשוי גם לאפשר ההדמיה של נגעים בזמן שהם סולקו בניתוח 34, 35, 36. לבסוף, השינוי בתחום התיאום של כתב המתכת המורכב ו / או לשנות את מרכז המתכות מעבר עוצמה לייצג מסלולים אטרקטיביים לווסת וללטש אורכי גל הפליטה בתוך הגלוי NIR נע 37, 38.

הדמיה chemiluminescence Intraoperative צריך עיתונאי chemiluminescent, ובמקרה שלנו, מחמצן, אשר ניתן להשתמש בהם רק בגבולות של רעילות מסיסות שלהם. ממברנות רקמות יכולות מהוות חסם אפקטיבי עבור דיפוזיה של החמצון לתוך הרקמה, ומכאן, דור האות. מאז כתב chemiluminescent הוא רק יצירת פוטון אחת למחזור, האות שנוצר היא די חלשה.אור הסביבה בחדר הניתוח ולכן צריך יהיה מנוע מלהיכנס המצלמה בעוד הטכניקה נמצאת בשימוש. זה עלול להפוך את ICI מעניין במיוחד לפיתוח יישומים לפרוסקופי, שבו האור הסביבתי אינו נכלל באופן טבעי.

אנו מקווים כי שיטה זו עשויה להפוך כלי רב ערך עבור מנתחים בחדר הניתוח. העדר הרדיואקטיביות מועיל צוות המטופל ותפעולי כאחד והופך אמצעי בטיחות פחות הכרחי, פוטנציאל טיוח ששיטה זו תוכל להפוך לאלטרנטיבה אטרקטיבית יותר.

הפעולה החלקה של nebulizer ואת מיצובה לשחק תפקיד מכריע להשגת תוצאות טובות. זוויות ושטחים לא טובים עשויות לתרום לאותת שונות. כבל השליטה חייב שיקשר את הדלת בזהירות, וכבל מספיק יש להישאר בתוך קורא פליטת האור כך שזה לא צפוף או נתלש.

בסופו של דבר, chemiluהדמית minescence היא גישה חדשה אטרקטיבית מאוד הדמיה מולקולרית. היא מבוססת על יסודות כימיה ומבוססת, שימוש בחומרים זולים וזמינים, ובדרך כלל נמנע הוא קרינה ומקורות אור העירור. כתוצאה מכך, אנחנו גם תקווה ובטוח שבעתיד, הדמיה chemiluminescence יכול להיות בעל השפעה עמוקה על הטיפול הכירורגי של המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics