طريقة التسليم المباشر القطاعي البينية الكبد باستخدام نموذج الفأر الكبد نقيري المشبك

Medicine
 

Summary

وقد تم وضع فريد كبد الفئران نموذج المشبك نقيري لدراسة تأثير الجزيئات الدوائية في تخفيف إصابة نقص التروية ضخه. يتضمن هذا النموذج إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء الكبد الدماغية عن طريق أحد فروع الوريد البابي، والسماح للتسليم الكبدي المباشر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Mumtaz, K., Hayes Jr., D., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model. J. Vis. Exp. (122), e54729, doi:10.3791/54729 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جراحة الكبد الكبرى مع انسداد تدفق، وزراعة الكبد، تتطلب فترة من نقص التروية الدافئ، وفترة ضخه مما يؤدي إلى نقص التروية / ضخه (I / R) إصابة مع نتائج سلبية لا تعد ولا تحصى. المحتملة إصابة I / R في أجهزة هامشية المخصصة للزراعة الكبد تساهم في نقص المانحة الحالي الثانوي إلى معدل استخدام الجهاز انخفضت. وثمة حاجة كبيرة لاستكشاف الكبدية I / إصابة R من أجل التوسط تأثيرها على وظيفة الكسب غير المشروع في الزرع. وتستخدم كبد الفئران نماذج المشبك نقيري للتحقيق في تأثير جزيئات مختلفة على الكبد إصابة I / R. اعتمادا على النموذج، وقد تم تسليم هذه الجزيئات باستخدام استنشاق، ضخ فوق الجافية، حقن داخل الصفاق، الوريد أو الحقن في الوريد المحيطي المساريقي العلوي. وقد تم تطوير نموذج نقيري المشبك كبد الفئران لاستخدامها في دراسة تأثير الجزيئات الدوائية في تخفيف الإصابة I / R. وdescribإد نموذجا للالمشبك نقيري كبد الفئران يشمل إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء كبدي الدماغية عن طريق فرع جانب من الوريد البابي، والسماح لقطعي المباشر تسليم الكبدي. نهجنا هو للحث على نقص التروية في الفص الجانبي ومتوسط ​​اليسرى لمدة 60 دقيقة، وخلال هذه الفترة هي التي غرست مادة قيد الدراسة. في هذه الحالة، pegylated-الفائق الفائق (PEG-SOD)، على القضاء على الجذور الحرة، هي التي غرست مباشرة إلى قطاع الدماغية. هذه السلسلة من التجارب تثبت أن ضخ PEG-SOD يقي الكبد إصابة I / R. وتشمل مزايا هذا النهج الحقن المباشر للجزيء في قطاع الدماغية مع ما يستتبع ذلك انخفاض في حجم التوزيع والحد من الآثار الجانبية الجهازية.

Introduction

جراحة الكبد الكبرى مع انسداد تدفق، وزراعة الكبد، تتطلب فترة من نقص التروية الدافئ، وفترة ضخه مما يؤدي إلى نقص التروية / ضخه (I / R) إصابة 1. تم تفصيل عواقب الإصابة I / R في الكبد على نطاق واسع 3. عواقب I / R إصابة المفصل في الأدب وتشمل: جيل من أنواع الاكسجين التفاعلية، بدء من تتالي الالتهابات بما في ذلك تفعيل العدلات، وخلايا كوبفر، والخلايا البطانية، وتفعيل نظام الهيم أوكسيجيناز وتنشيط مستقبلات شبيهة عدد القتلى، ل اختلال التوازن بين endothelin وأكسيد النيتريك، وتفعيل النووية عامل كيلوبايت، وتعزيز خلوى الموالية للالتهابات والتوليف 3 جزيء التصاق. هذه الأحداث الموالية للالتهابات قد لEAD إلى موت الخلايا المبرمج، نخر، ضعف الجهاز وفشل الجهاز في نهاية المطاف 3.

I / R إصابة في الأجهزة المخصصة لزراعة الكبد يمكن أن يؤدي إلى فقدان الكسب غير المشروع في وقت مبكر، ويسهم في نقص المانحة الحالي كأجهزة هامشية أكثر عرضة للإصابة 3. يوجد حاليا 15226 المستفيدين المحتملين على قائمة الانتظار لزراعة الكبد في الولايات المتحدة (4) وفقط 5950 عملية زرع كبد أجريت في عام 2015 5. ونتيجة لهذا الحد الشديد في توافر الجهاز والبحوث استكشاف وهناك حاجة الكبدية إصابة I / R من أجل تحسين وظيفة الكسب غير المشروع واستغلال الجهاز.

نماذج حيوانية تستخدم لدراسة الكبد I / R إصابة تشمل الفئران نماذج نقيري المشبك ونماذج زرع كبد الفئران. وهناك مجموعة متنوعة من نماذج المشبك الفئران نقيري قيد الاستخدام حاليا. والأكثر شيوعا هو واحد الذي الوريد البابي، الشريان الكبدي والصفراء دوط توريد وفرضت الفصوص الجانبية والوسطية اليسرى باستخدام مقاطع المجهرية 6 و 7 و 8 و 9 و 10 و 11 و 12 لمدة 30 إلى 60 دقيقة 6 و 7 و 10 و 13 و 14، ثم فترة ضخه من 60 دقيقة ل24 ساعة 10، 13، 14 يسمح. تشمل الفصوص الجانبية والوسطية تبقى من كبد الفئران حوالي 70٪ من لحمة الكبد 9. وتشمل بعض البروتوكولات صممت لدراسة شروط مسبقة الدماغية لقط متقطعة من السفن نقيريأو الخلفية الأطراف الاصطناعية قبل فترة طويلة من نقص التروية الناجم عن تحامل على السفن نقيري 9 و 13. هناك أيضا العديد من التعديلات وصفها في المؤلفات. الأول هو لكبح الوريد البابي والشريان الكبدي توريد الفصوص الجانبية والوسطية اليسرى، ولكنها تستبعد القناة الصفراوية 15. والتعديل الثاني هو للحث على مجموع نقص تروية الكبد لقط الوريد البابي، الشريان الكبدي والقناة الصفراوية قبل انقسامها 16 و 17 و 18 و 19 و 20. ويشمل التعديل الثالث لقط الأوعية نقيري إلى الفص الأيمن لمدة 30 إلى 60 دقيقة 8. ينطوي على تعديل إضافي تحامل على حزمة الأوعية الدموية في الأطراف الخلفية واحدة من أجل حمل إصابة في الكبد 13 و 21 الشكل 1A-D.

وقد استخدمت كبد الفئران نماذج المشبك نقيري لدراسة تأثير الجزيئات والمركبات المختلفة على كبدي I / R. اعتمادا على نموذج مستخدمة قد تم تسليمها باستخدام استنشاق 11، ضخ فوق الجافية 12، حقن داخل الصفاق 17 و 18 و 21 و 22 و الوريد 10، 14، 15، 19، 23، 24 أو الحقن في الوريد المحيطي المساريقي العلوي 8 هذه الجزيئات .

نموذج للكبد الفئران نقيري المشبك بالتفصيل في هذا التقرير امبوفاق إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء الدماغية عن طريق فرع جانب من الوريد البابي (الشكل 2)، والذي يسمح للقطعي المباشر تسليم الكبد للمادة الدوائية تحت الدراسة. نهجنا هو للحث على نقص التروية في الفص الجانبي ومتوسط اليسرى لمدة 60 دقيقة، وهي الفترة التي وغرست ضخ مادة قيد الدراسة، في هذه الحالة، الفائق pegylated-الفائق، وهو جذري زبال الشحن 25، مباشرة في قطاع الدماغية . يتم أخذ عينات من الدم قبل تحريض نقص التروية وفي 120 دقيقة بعد ضخه. في هذه النقطة، يتم التضحية الفئران ويتم أخذ عينات من الفص الأيسر وسيطة. بالإضافة إلى ذلك، يتم أخذ عينات من الفص الأيمن لتكون بمثابة الرقابة الداخلية.

وهناك العديد من المزايا لهذا النهج. أولا وقبل كل شيء، عندما يكون مادة دوائية قيد الدراسة يمكن حقنه مباشرة في قطاع الدماغية حجم ستوزيع و منخفض جدا بالمقارنة مع حجم توزيع الحقن في الدورة الدموية أو التجويف البريتوني. بالإضافة إلى ذلك، يقلل هذا النهج، على الرغم من أن لا يلغي، وإمكانية الآثار الجانبية الجهازية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوان المؤسسية ودليل مجلس البحوث الوطني للرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية (IACUC) وقد خضعت لموافقة لجنة جامعة ولاية أوهايو IACUC.

1. الأولي مجموعة المتابعة

  1. انشاء المجهر الجراحي وغرفة العمليات (الشكل 3، الشكل 4). تشغيل جميع المعدات بما في ذلك للحفاظ على التخدير ومراقبة العلامات الحيوية. تشغيل وحدة والاحترار الجراحة الكهربية وسادة. وضع مضخة التسريب بالقرب من طاولة العمليات.
    1. وضع 10 مل من السائل الأيزوفلورين للاستنشاق (الوزن الجزيئي 184.5) في حقنة تخدير ووضعه في وحدة التخدير.
    2. انشاء مل الحاويات 200 من النيتروجين السائل بالقرب من طاولة العمليات، وآخر بالقرب من أجهزة الطرد المركزي حيث سيتم معالجة عينات الدم.
    3. نقاط البيعition الأدوات الجراحية، 4-0 و7-0 مضفر خياطة الحرير، ومسحات القطن المعقم والإسفنج 4X4 غير المنسوجة، 5 المحاقن مل، و 27 المحاقن قياس الأنسولين بالقرب من طاولة العمليات.
  2. إعداد غرفة الأيزوفلورين وضمان وتغرس أن الأيزوفلورين كافية في النظام التخدير تحريض الولادة.

2. تحريض التخدير

  1. قبل التعامل مع الفئران وضعت على ما يلي معدات الوقاية الشخصية (PPE): قناع جراحي، والقفازات الجراحية، وثوب المتاح.
  2. وزن الفئران وتسجيل الوزن.
    ملاحظة: يجب استخدام الفئران سبراغ داولي.
  3. وضع فأر في غرفة التخدير وتشغيل الأيزوفلورين والأكسجين. حمل التخدير باستخدام غرفة الأيزوفلورين.
  4. مقطع شعر الحيوان في البطن باستخدام المقص الشعر الكهربائية للسماح للتعرض أنظف (الشكل 5).
  5. وضع الظهر الحيوان في غرفة الأيزوفلورين لadditioنال دقيقة واحدة. إجراء قرصة أخمص القدمين إلى التحقق من عمق التخدير.

3. الإجراءات

  1. ضع الفئران مع أنف الحيوان في مخروط الأنف وأربعة أطراف يجمد مع قيود أو الشريط على لوحة ظاهرة الاحتباس.
  2. مواصلة التخدير باستخدام نظام تسليم التخدير، مخروط الأنف والأيزوفلورين مع التخدير بنسبة 3.6٪ للحيوانات وزنها بين 200 و 250 غرام و 4٪ للحيوانات وزنها أكثر من 250 غرام. تأكيد عمق التخدير عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميها، وقرصة الجلد.
  3. جعل شق البطن خط الوسط من العانة إلى الخنجري من خلال الجلد باستخدام مقص حاد (الشكل 6).
  4. إجراء شق في الغشاء البريتوني على طول الخط الأبيض من العانة إلى الخنجري وأدخل العناية أخذ البطن لا تضر المثانة أو الأمعاء. كما العصي الكبد أيضا إلى الصفاق الأمامية بالقرب عملية الخنجري، تأكد من أن يطلق قبل عمل قطع في جدار البطن في هذه ععصام.
  5. جعل شق عرضية من خلال الجلد والصفاق على مستوى الحدود أدنى من الفص الأيمن من الكبد.
  6. تحويل التخدير وصولا الى 1.6٪ للحيوانات وزنها بين 200 و 250 غرام و 2٪ للحيوانات وزنها أكثر من 250 غرام.
  7. التراجع عن عملية الخنجري باستخدام المشبك البعوض المنحني.
  8. الكامشات مكان الصدري سحب الأضلاع متباعدة مثل ممكن من خط الوسط (الشكل 7). قطع المنجلي، الحجابي والأربطة المعدة. الوجه الكبد حتى باستخدام قطعة قطن مبللة معقمة.
  9. قطع الأربطة إضافية عند الضرورة للوصول إلى بورتا. أداء دوران الحشوية مع المياه المالحة مبلل الشاش (الشكل 7).
  10. إزالة النسيج الضام فضفاضة تغمر نقير المدخل باستخدام تشريح حادة أو غير حادة. إزالة النسيج الضام فضفاضة تغمر طول الوريد البابي.
  11. استخدام ملقط لدفع من خلال ر الضام فضفاضةقضية الخلفي لقناة الوريد البابي اليسرى، الشريان والصفراء جعل النافذة وتضع 4-0 بوتس خياطة ولكن لا CINCH أسفل (الشكل 8).
  12. مسح قبالة النسيج الضام فضفاضة تغمر فرع الخلفي إلى الوريد البابي الذي يأتي في حوالي الساعة مستوى الكلية اليمنى. وسيتم استخدام هذا المنوال لإقناء؛ إدخال القنية.
  13. رسم 0.5 مل من الدم من فينا كافا السفلي (IVC) مع حقنة الانسولين (الشكل 9). ضع 0.5 مل من الدم في قارورة صغيرة، وأجهزة الطرد المركزي في 135 x ج لمدة 12 دقيقة. محاولة ليسحب المصل.
    1. إذا لا يمكن تقدير خط واضح بين خلايا الدم الحمراء والمصل، في محاولة لأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 إضافية - 3 دقائق في 135 ز س. رسم من المصل ووضعه في قارورة لألانين-الألانين (ALT). التقط تجميد هذه العينة عن طريق وضعها مباشرة في النيتروجين السائل.
  14. قطع قطعتين من 7-0 خياطة ومكان بالقرب من الوريد التي سيتم استخدامها للقنيةنشوئها. وضع أول حلقة 7-0 حول هذا المنوال بقدر سطي ممكن. ربط هذه الحلقة واستخدامها لسحب باستخدام المشبك البعوض المنحني (الشكل 10). ضع الثانية 7-0 حلقة على المنوال الذي سيتم استخدامه لإقناء؛ إدخال القنية قرب تقاطعه مع الوريد البابي ووضع ربطة عنق واحدة، ولكن لا حزام السرج أسفل.
  15. إعداد مضخة التسريب مع حقنة 5 مل مع 3 مل من كاشف. رئيس الأنبوب.
  16. المشبك البعيدة الوريد البابي باستخدام المشبك المجهرية.
    ملاحظة: هذا سوف يقلل النزيف عندما يتم شق الوريد لإقناء؛ إدخال القنية.
  17. قطع حفرة 0.5 مم في الوريد في فترة ما بين 7-0 خياطة الوقف وتقاطعه مع الوريد البابي باستخدام مقص المجهرية الصغيرة. استخدام 27-0 القسطرة ليقني؛ يدخل القنية الجهاز الوريدي البابي اليسرى (الشكل 11، الشكل 12). إدراج القسطرة الماضي والتشعب من الأوردة بوابة اليسار واليمين.
  18. تحقق وضع قنية التي كتبها infusجي 1 مل من محلول ملحي ومراقبة الفصوص الجانبية والوسطية تبقى من الكبد لبلانش. تأكيد يدويا التي القسطرة الماضي الإقلاع من الصحيح الوريد البابي، ولكن ليس إلى ما بعد الاقلاع من الوريد البابي تغذية الفص المتوسط.
  19. حزام السرج أسفل خياطة بوتس ووقت البدء نقص التروية. تشديد 7-0 خياطة حول الوريد والقسطرة 27-0 ليثبت في مكانه وإزالة المشبك من الوريد البابي البعيدة.
  20. بدء ضخ البولي ايثيلين جلايكول الفائق-الفائق (PEG-الهيئة العامة للسدود، 0،00067 جم / مل) باستخدام مضخة التسريب. بدء ضخ أقرب وقت ممكن لبدء الوقت الدماغية.

4. رصد

  1. تواصل رصد العلامات الحيوية للحيوان في جميع أنحاء الحقن في الوريد. تسليم 2 مل من محلول ملحي 0.9٪ أو 2 مل من PEG-SOD (0،00067 جم / مل) الذائب في محلول ملحي 0.9٪ خلال فترة 15 دقيقة.

5. إعادة إشباع الخلايا

  1. السماح ساعة واحدة لتمرير من بداية طالوقت schemic. هذا هو 1-ح من الزمن نقص التروية الدافئ.
  2. إزالة خياطة بوتس. إزالة القسطرة 27-0. حزام السرج أسفل خياطة 7-0 حول الوريد. لاحظ الوقت. وهذه هي المرة ضخه.

6. استمرار أخذ العينات

  1. رسم 0.5 مل من الدم من IVC في 120 دقيقة بعد ضخه. رسم الدم ببطء لتجنب الناشر خلايا الدم الحمراء. بالتنقيط ببطء الدم في قارورة. تأكد من أن نزيف من IVC يتم التحكم بعد كل سحب الدم.
    1. إذا كان هناك استمرار نزيف تطبيق ضغط لطيف مع مسحة القطن المعقم أو صغيرة 1 سم في 1 سم قسم قطع من الشاش.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 135 x ج لمدة 12 دقيقة. وإذا لم يتحقق انفصال ما يكفي، في محاولة ل2 إضافية - 3 دقائق في 135 ز س.
  3. ضع نصف مصل في قارورة لمعالجة احق لALT. التقط تجميد هذه العينات.

7. القتل الرحيم

  1. في حين أن الفئران لا يزال تحت التخدير قطع IVC والصورةuperior فينا كافا (SVC)، ورصد حتى تدفق الدم والتنفس ووقف ضربات القلب.
  2. شق الحجاب الحاجز وإجراء استئصال الكبد موجز من عمل قطع في الحجاب الحاجز في دائرة وعمل قطع النسيج الضام الإضافية التي لا تزال تربط الكبد إلى التجويف البريتوني. إزالة الكبد من التجويف البريتوني.
  3. أخذ أربع عينات من الفص الأيسر وسيطة من الكبد وأربع عينات من الفص الأيمن من الكبد. يجب أن تكون العينات كبيرة بقدر الإمكان وسيتم حجمها محدود فقط من كمية أنسجة الكبد المتاحة. ضع هذه في صغيرة قارورة المسمى، والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل. تستخدم هذه للمعالجة في وقت لاحق لأدينوسين ثلاثي الفوسفات الأنسجة (ADP)، malondialdehyde (MDA) والجلوتاثيون (GSH).

8. بعد تجربة تحليل

  1. تحديد الجلوتاثيون (GSH)، malondialdehyde (MDA) والألانين ألانين (ALT) الأنشطة في أنسجة الكبد وعينات المصل باستخدام أدوات التشخيصوفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. تجانس نسيج الكبد مع العازلة تحلل وتحديد باستخدام مقايسة برادفورد. تحليل المحللة الأنسجة عن طريق دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ومناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد capase 3 ملصوق والأكتين. تحديد البقع الغربية يؤديها مع البرمجيات المتاحة للجمهور.

Representative Results

وقد أجريت هذه التجربة مع 2 مجموعات من ن = 3 فئران لكل منهما. تم حقن ثلاث كبد الفئران مع 2 مل من محلول ملحي (NS) مع مضخة التسريب على مدى 15 دقيقة. تم حقن ثلاث كبد الفئران مع 2 مل من محلول ملحي (NS) مختلطة مع pegylated-الفائق الفائق (PEG-الهيئة العامة للسدود، 0،00067 جم / مل) مع مضخة التسريب على مدى 15 دقيقة. كما هو موضح في البروتوكول المذكور أعلاه، وتم أخذ عينات الدم المشبك قبل نقيري وفي 120 دقيقة بعد ضخه. بالإضافة إلى ذلك، بعد اتخاذ الانتهاء من 120 دقيقة من ضخه أربع عينات أنسجة الكبد من اليسار وفصوص متوسط ​​وأربع عينات الكبد أخذت من الفص الأيمن للكبد الفئران.

وقد تم قياس مصل الألانين ألانين (ALT) المشبك قبل نقيري وفي 120 دقيقة بعد ضخه في التحكم (NS) والتجريبية (PEG-SOD) الحيوانات. كان هناك فرق كبير بين مستوى ALT لإدارة (NS)الحيوانات المشبك قبل نقيري وفي 120 دقيقة بعد ضخه. كان هناك فرق كبير بين مستوى ALT لإدارة (NS) وحيوانات التجارب (PEG-SOD) في 120 دقيقة (الشكل 13A). وقد تم قياس malonaldehyde الأنسجة (MDA) للسيطرة (NS) والتجريبية (PEG-SOD) الحيوانات في كلا الفصين الأيمن والأيسر من الكبد. الأنسجة MDA في الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) مع حقن التحكم (NS)، والحقن التجريبي (PEG-SOD) إثبات لا يوجد فرق كبير. الفص الأيسر (المشبك وضخه بعد نقيري) الأنسجة MDA مع حقن التحكم (NS) تختلف بشكل كبير من الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) ع <0.001. الفص الأيسر (المشبك بعد نقيري وضخه) على مستويات مختلفة إلى حد كبير من الأنسجة MDA مع حقن التحكم (NS) مقابل حقن التجريبية (PEG-SOD) ع <0.005 (الشكل 13B). وقد تم قياس الأنسجة الجلوتاثيون (GSH) والجلوتاثيون الأنسجة في الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) مع حقن التحكم (NS) لالثانية حقن التجريبية (PEG-SOD) تثبت لا يوجد فرق كبير. الفص الأيسر (المشبك وضخه بعد نقيري) الأنسجة GSH مع حقن التحكم (NS) تختلف اختلافا كبيرا من الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) مع حقن التحكم (NS) ف <0.05. الفص الأيسر (المشبك بعد نقيري وضخه) على مستويات مختلفة إلى حد كبير من الجلوتاثيون الأنسجة مع حقن التحكم (NS) مقابل حقن التجريبية (PEG-SOD) ع <0.005 (الشكل 13C). تم إجراء طخة غربية مقارنة الفص الأيمن والأيسر من الحيوانات السيطرة ويدل على زيادة المشقوق كاسباس 3 في الفص الأيسر بعد المشبك نقيري وضخه (الشكل 13D). وأجريت لطخة غربية الثانية مقارنة الفص الأيسر من الحيوانات تعامل مع الرقابة ومع PEG-SOD (الشكل 13E). هذا يدل على انخفاض كاسباس 3 المشقوق في أنسجة الكبد من الحيوانات تعامل مع PEG-الهيئة العامة للسدود. تم إجراء قياس كثافة أيضا demonstraتينغ أن مستوى المشقوق كاسباس 3 في أنسجة الكبد وزيادة كبيرة في اليسار مقابل الفص الأيمن من الحيوانات التحكم (الشكل 13F). وبمقارنة اليسرى الأنسجة الفص الكبد من حيوانات التجارب، التي غرست مع PEG-الهيئة العامة للسدود، واليسار الأنسجة الفص كبد الحيوانات السيطرة، يملؤه عادي المالحة، يدل على كثافة انخفضت بشكل ملحوظ المشقوق كاسباس 3 في الحيوانات تعامل مع PEG-SOD بالمقارنة مع الحيوانات تعامل مع سيطرة (الشكل 13G).

شكل 1
الشكل 1: تشريحية الرسوم التوضيحية. ألف التوضيح التشريحي للكبد الفئران. B. تشريحية التوضيح للكبد الفئران. يشد عنيق المدخل إلى الفص الأيسر وسيطة من الكبد. الفص الأيسر وسيطة هي الدماغية. C. تشريحيالتوضيح للكبد الفئران. يشد عنيق البوابة إلى الفص الأيسر. الفص الأيسر هو الدماغية. D. تشريحية التوضيح للكبد الفئران. يشد عنيق البوابة إلى الفص الأيمن والفص الأيمن هو الدماغية.

الشكل 2
الشكل 2: تشريحي الرسوم التوضيحية. التوضيح التشريحي للكبد الفئران مع البوابة مقنى الوريد عن طريق فرع الجانب. ويحيط عنيق المدخل إلى الفص الأيسر وسيطة من الكبد عن طريق خياطة واستخدمت المشبك microvessel لتشديد حول الحزمة الوعائية. الفص الأيسر وسيطة هي الدماغية.

الشكل (3)
الشكل (3): صك مجموعة المتابعة. يوضح هذا الرقم عشر حتى تعيين الإلكترونية الصك.

الشكل (4)
الشكل 4: غرفة عمليات مجموعة المتابعة. يوضح هذا الرقم غرفة العمليات انشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: تقليم البطن الشعر. يوضح هذا الرقم تقليم الشعر في البطن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحميل / 54729 / 54729fig6.jpg "/>
الشكل 6: الشلل وشق الجلد. يوضح هذا الرقم الشلل في الفئران وشق الجلد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: الضلع سحب للتوظيف ونزع الأحشاء. يوضح هذا الرقم الضلع ضام التنسيب والأحشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8: مكان منة من خياطة. يوضح هذا الرقم موضع خياطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9: سحب الدم من الوريد الأجوف السفلي. يوضح هذا الرقم سحب الدم من الوريد الأجوف السفلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الشكل 10: فرع الوريد تعادل معطلة ومنسحب. يوضح هذا الرقم الوريد فرع ربط قبالة وتراجع. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 11
الشكل 11: عملية كيفية تركيب الكانيولا. يوضح هذا الرقم عملية إقناء؛ إدخال القنية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 12
الشكل 12: كيفية تركيب الكانيولا. يوضح هذا الرقم إقناء؛ إدخال القنية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الرقم 13
الشكل 13: ممثل النتائج: مباشرة القطاعي داخل الكبد تسليم Pegylated-ديسموتاز فوق الأكسيد باستخدام الفئران نقيري المشبك النموذجي. NS = ملحي. PEG-SOD = pegylated-الفائق الفائق، ALT = الألانين ألانين، MDA = malondialdehyde. A. المصل الألانين ألانين (ALT، مو / مل) مقارنة بين الشبك قبل نقيري و 120 دقيقة بعد ضخه. هناك فرق كبير بين السيطرة (NS) المشبك قبل نقيري والتحكم (NS) في 120 دقيقة بعد ضخه (ع <0.001). وهناك أيضا فرق كبير بين السيطرة (NS) والمجموعات التجريبية (PEG-SOD) في 120 دقيقة بعد ضخه (ع <0.05). تم استخدام اختبار (ت) للطالب. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. B. malondialdehyde الأنسجة في الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) مع حقن التحكم (NS) لد حقن التجريبية (PEG-SOD) تثبت لا يوجد فرق كبير. غادر الفص (المشبك بعد نقيري وضخه) malondialdehyde الأنسجة مع حقن التحكم (NS) تختلف اختلافا كبيرا من الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) ع <0.001. الفص الأيسر (المشبك بعد نقيري وضخه) على مستويات مختلفة إلى حد كبير من malonaldehyde الأنسجة مع حقن التحكم (NS) مقابل حقن التجريبية (PEG-SOD) ع <0.005. تم استخدام اختبار (ت) للطالب. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. C. الأنسجة الجلوتاثيون في الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) مع حقن التحكم (NS)، والحقن التجريبي (PEG-SOD) إثبات لا يوجد فرق كبير. غادر الفص (المشبك بعد نقيري وضخه) الجلوتاثيون الأنسجة مع حقن التحكم (NS) تختلف اختلافا كبيرا من الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) مع حقن التحكم (NS) ف <0.05. غادر الفص (المشبك بعد نقيري وضخه) على مستويات مختلفة إلى حد كبير من الجلوتاثيون الأنسجة مع مباشرة صب السيطرةن (NS) مقابل حقن التجريبية (PEG-SOD) ع <0.005. تم استخدام اختبار (ت) للطالب. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. D. وصمة عار الغربية مما يدل على زيادة المشقوق كاسباس 3 في أنسجة الكبد من الفص الأيسر (المشبك بعد نقيري وضخه) مقابل الفص الأيمن (المشبك غير نقيري) من الحيوانات السيطرة (عادي المالحة). انخفض E. الغربية وصمة عار التظاهر المشقوق كاسباس 3 في أنسجة الكبد من الحيوانات تعامل مع PEG-SOD بالمقارنة مع الحيوانات تعامل مع سيطرة (عادي المالحة). يتم زيادة F. مستوى كاسباس 3 المشقوق في أنسجة الكبد بشكل كبير في المشبك وضخه الحيوانات بعد نقيري (ع <0.05). تم استخدام اختبار (ت) للطالب. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. G. وبمقارنة اليسرى الأنسجة الفص الكبد من حيوانات التجارب (يملؤه PEG-SOD) وترك الأنسجة الفص كبد الحيوانات التحكم (يملؤه عادي المالحة)، وهناك انخفاض ملحوظ المشقوق كاسباس 3 فيimals تعامل مع PEG-SOD بالمقارنة مع الحيوانات تعامل مع سيطرة (عادي المالحة). تم استخدام اختبار (ت) للطالب. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري.

Discussion

أثبتت هذه السلسلة من التجارب التي حقن PEG-SOD إلى اليسار وفصوص متوسط ​​أدى إلى انخفاض كبير في الإفراج عن ALT، بيروكسيد أغشية الخلايا (MDA)، وصيانة الجلوتاثيون (GSH) بالمقارنة مع الضوابط (المالحة عادي ). يتم تأسيس الترانساميناسات أنسجة الكبد بما في ذلك ألانين الألانين (ALT) علامات الإصابة الكبدية. انخفاض ALT عندما يتم حقن الفص الأيسر مع PEG-SOD يشير إلى وجود تأثير وقائي من PEG-الهيئة العامة للسدود. زيادة الأنسجة MDA يشير إلى زيادة بيروكسيد الدهون، ويعتبر علامة من الاكسدة وإصابة الأنسجة. الإفراط في أنواع الاكسجين التفاعلية يسبب زيادة في إنتاج MDA 26. الانخفاض الكبير في الأنسجة MDA في الفص الأيسر ومتوسط ​​الحيوان عندما تم حقنها مع PEG-SOD يدل على تأثير وقائي من PEG-الهيئة العامة للسدود. وهذا يتفق مع الفهم الحالي أن PEG-الهيئة العامة للسدود تحمي الخلايا من التلفالناجمة عن انخفاض جزئيا أنواع الاكسجين التفاعلية (27). بالإضافة إلى ذلك، في وجود أنواع الاكسجين التفاعلية، يتم تقليل ثاني كبريتيد الجلوتاثيون لالجلوتاثيون (GSH) 28. صيانة في GSH في الفص الأيسر وسيطة من الكبد حقن PEG-الهيئة العامة للسدود أخرى تعزز تأثير وقائي من PEG-الهيئة العامة للسدود. بالإضافة إلى ذلك يتضح أن هناك زيادة كاسباس 3 المشقوق، وهو منتج من موت الخلايا المبرمج، في أنسجة معرضة للإصابة نقص التروية ضخه. انخفاض كاسباس 3 المشقوق في الفص الأيسر عندما تعامل مع PEG-SOD تشير إلى أن PEG-SOD يؤدي إلى انخفاض في موت الخلايا المبرمج.

الفائق (الاحمق) هو إنزيم حاسما في علاج الإدمان من أنواع الاكسجين التفاعلية. الإنزيم يحفز تحويل اثنين من الأنيونات دسموتاز في بيروكسيد الهيدروجين والماء. إنزيم الكاتلاز ثم تحويل بيروكسيد الهيدروجين في الماء والأكسجين، واستكمال عملية 25. نصف العمر للالهيئة العامة للسدود الأصلي يقتصر استخدامه في نماذج تجريبية حتى تطوير مترافق البولي ايثيلين جلايكول الفائق-الفائق (PEG-SOD). الإقتران من الهيئة العامة للسدود والبولي ايثيلين جلايكول يزيد على نصف العمر من 6 دقائق إلى 14 ساعة. نغوين وآخرون. أثبتت قدرتها على تخفيف الدهون بيروكسيد في نقص تروية الكبد في نموذج الفئران، وذلك باستخدام تسليم النظامية 29.

وهناك مجموعة متنوعة من التعديلات المحتملة للتقنية مفصلة هنا، وقد سبق وصفها البعض في الأدب. اعتمادا على نموذج استخدام جزيئات تم تسليمها باستخدام استنشاق 11، ضخ فوق الجافية 12، حقن داخل الصفاق 17 و 18 و 21 و 22 و الوريد 10، 14، 15 19، 23، 24 أو الحقن في الوريد المحيطي المتفوق المساريقي 8.

هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. والأكثر أهمية هو إقناء؛ إدخال القنية من الوريد البابي. ويجب الحرص على أن ثقب قطع في الوريد ليست كبيرة جدا. الأنسجة غير مرن جدا وسوف حفرة تكبير من تلقاء نفسها. نوصي بالبدء بقطع الحفرة التي هي 0.5 ملم مع مقص المجهرية. قنية يمكن تغذية من خلال ثقب باستخدام أداة، والذي يسمح لقدر أكبر من المرونة مما لو تحاول تنفيذ هذا الجزء من الإجراء باليد. بالإضافة إلى ذلك، في حين تغذية البداية قنية، ينبغي أن تهدف بصورة مباشرة إلى تشعب الأوردة بوابة اليسار واليمين لتجنب بدس ثقبا في الجدار الخلفي للالوريد. عندما يصل طرف قنية والتشعب، عندئذ يمكن إدخالها في الوريد الأيسر محددحليف. مرة واحدة ويتم تغذية قنية في الوريد البابي الأيسر، التي تمد كل من اليسار وفصوص متوسط، موقفها ويمكن التأكد يدويا عن طريق الشعور به داخل الوريد. ويمكن أيضا أن موقفها تأكيد عن طريق حقن كمية صغيرة من المياه المالحة الباردة ورؤية تأثير ابيضاض على الشرائح المعروضة من الكبد.

نموذج المشبك نقيري الكبد في الفئران يوفر منصة استنساخه ومستقرة لإثبات الكبد الإصابة الدماغية ضخه. وقد استخدمت متغير نماذج المشبك نقيري من قبل الباحثين لدراسة آثار وقائية من المواد المضادة للتأكسد وغيرها من جزيئات صغيرة 10، 11، 12، 13، 14. وتشمل نقاط الاختلاف التي هي سفن المشبك الطبعه، والجزء الذي تتم الدماغية، سواء كان أو لم يتم تضمين القناة الصفراوية وطول فترة ضخه 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام هذا النموذج لدراسة تأثير إدارة جزيء مسار الإدارة هو أيضا غير متجانسة 10، 11،"> 12، 14، 15، 17، 18، 19، 21، 22، 23، 24، وهناك العديد من المزايا لهذا النهج وصفها. أولا، إقناء؛ إدخال القنية المباشر لتوريد المدخل إلى الجزء الدماغية يسمح قطعي تسليم الكبدي المباشر لل المادة الدوائية قيد الدراسة، وهذا يسمح الاستفادة من الفص الآخر من الكبد باعتبارها الرقابة الداخلية، وثانيا، إقناء؛ إدخال القنية الكبدي قطعي يسمح لانخفاض حجم التوزيع للجزيء التي تجري دراستها. هذا النهج وبالتالي يقلل من خطر الآثار الجانبية الجهازية كما يتم حقن مادة مباشرة في قطاع الكبد من الفائدة. إقناء؛ إدخال القنية المباشر للقطاع الكبدي يسمح للمادة أن يتم تسليمها قبل التروية، داخل نقص التروية أو بعد نقص التروية. وهذا يسمح لدراسة تأثير جزيء في أي نقطة في دورة إصابة نقص التروية ضخه. مع زيادة طول الوقت الدماغية وزيادة مستوى الإصابة فرصة إضافية لدراسة تجديد الكبد ستكون متاحة.

وهناك أيضا بعض القيود المفروضة على هذا النهج. الأول هو التكلفة بدء التشغيل. شراء الميكروسكوب الجراحي يمكن أن تكون تكلفة كبيرة لبدء لمختبر لا تملك بالفعل واحدة. قد يكون هذا الأسلوب من الصعب أو المستحيل بدون المجهر. والثاني هو التعلم الوقت منحنى. ورغم أن هذا الإجراء هو بسيط نسبيا كنه يتطلب بعض الممارسة وأنه من المرجح أن مبتدئ سوف تتطلب عددا كبيرا من الإجراءات ليصبح خبيرا.

باختصار، هذا النموذج يسمح لمنصة استنساخه وبسيطة، وفعالة من حيث التكلفة لدراسة الكبد إصابة نقص التروية ضخه. على الرغم من بروتوكول صفها هنا البولي ايثيلين GLycol-الفائق الفائق، وهو جذري زبال الشحن 25، وقد أكسب، وهذا النموذج يمكن أن تستخدم للبث مجموعة متنوعة من المواد الدوائية المختلفة من أجل تقييم تأثيرها على الإصابة I / R في الكبد.

Disclosures

تقرير عن الكتاب ليس لديهم الافصاحات.

Acknowledgments

ونود أن نعترف دينيس ماتياس لعمله توضيحي. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة T32AI 106704-01A1 وصندوق T فليش لزراعة الأعضاء، الإرواء والهندسة والتجديد في جامعة ولاية أوهايو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley Rat  Harlan Sprague Dawley Inc.  200- 250 grams 
Surgical Microscope  Leica  M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5  Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe   Valco Instruments Co, Inc.  SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan  MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific  HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific  SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific  PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber  Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen  Praxair 98015
27-0 Micro-Cannula Braintree Scientific  MC-28
Rib retractors  Kent Scientific  INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) Sigma Aldrich  S9549 SIGMA
GenieTouch Kent Scientific
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges  Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5 mL Syringe BD  REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical  REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific  1418-7410
Microsurgical Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Scissors  Roboz  RS-5610
Large Scissors S&T  SAA-15
Forceps - Large Angled S&T  JFCL-7
Forceps - Small Angled  S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip  S&T  FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Other Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Mosquito Clamps Generic 
Analysis 
Name Company  Catalog Number Comments
Alannine aminotransferase (ALT) assay  Biovision K752-100
Malondialdehye (MDA) assay  Abcam  ab118970
Glutathione (GSH) assay Cayman Chemical 7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin  Cell Signaling Tecnology Antibody 9661
ImageJ Software  National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer  Millipore 10-188

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
  2. Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
  3. Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
  4. OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  5. OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  6. Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
  7. Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
  8. Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
  9. Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
  10. Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
  11. Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
  12. Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
  13. Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
  14. Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
  15. Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
  16. Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
  17. Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
  18. Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. 601-607 (2015).
  19. Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. 3196431 (2016).
  20. Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
  21. Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. (2015).
  22. Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
  23. Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
  24. Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
  25. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
  26. Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
  27. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
  28. Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
  29. Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics