עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

את המנגנונים שבאמצעותם המעי מסדיר עיבוד שומנים בתזונה, הכבד שולט מטבוליזם סינתזה ליפופרוטאין שומנים מורכב, ואיך האיברים האלה לעבוד עם מערכת העצבים המרכזית לשלוט על צריכת מזון מובן. מעניין ביו להבהיר ביולוגיה זה לאור המגיפות הנוכחיות של השמנת יתר, מחלות לב וכלי דם, סוכרת, מחלת כבד שומני לא אלכוהולי. מחקרים בתרבות ועכברים תא סיפקו את רוב הבנתנו את היחסים מכניסטית בין שומנים תזונתיים ומחלות, ו דג הזברה (Danio rerio) הם מתעוררים כמו מודל אידיאלי כדי להשלים את העבודה הזאת.

דג הזברה יש עיכול דומה (GI) איברים, מטבוליזם של שומנים, תחבורה ליפופרוטאין לבעלי חוליות גבוהות 1,2, לפתח במהירות, והם גנטיים צייתנים. בהירות אופטית של דג הזברה הזחל הופך לפשוט במחקרים vivo, particulaיתרון r עבור חקר מערכת העיכול כמו הסביבה התאית שלה (כלומר, מרה, חיידקים, איתות האנדוקרינית) היא כמעט בלתי אפשרי לבנות מודל vivo לשעבר. בהתאם, גוף מחקר המשלב את העקיבות הגנטיות conduciveness לחיות הדמיה של זחלי דג זברה עם מגוון רחב של מניפולציות תזונתיות (עתיר שומן 3,4, -cholesterol 5, ודיאטות -carbohydrate 6,7), ומודלים של מחלות לב וכלי דם 8, סוכרת 9,10, בכבד steatosis 11-13, והשמנת 14-16, הם מתעוררים, כדי לספק שורה של תובנות מטבולית.

היבט חיוני של מעבר דג הזברה זחל לתוך מחקר מטבולית הוא אופטימיזציה של טכניקות שפותחו בחיות מודל אחרות אל דג הזברה לבין ההתפתחות של מבחני רומן המנצלים את נקודות החוזק הייחודיות של דג הזברה. פרוטוקול זה מציג טכניקות שפותחו והותאמו במיוחד להאכיל דג הזברה הזחל lipiד-עשיר הארוחה, לדמיין עיבוד השומנים תזונתיים מהגוף כולו ברזולוציה subcellular, ולמדוד את צריכת המזון. חלמון עוף ביצה נבחר להלחין הארוחה עשיר שומנים בדם כפי שהוא מכיל רמות גבוהות של שומנים וכולסטרול (ליפידים להלחין ~ 58% של חלמון עוף ביצה, מתוכם ~ 5% הוא כולסטרול, 60% הם טריגליצרידים, ו -35% הם פוספוליפידים ). חלמון עוף ביצה מספק יותר שומן מאשר מזונות micropellet דג זברה מסחריים טיפוסיים (~ 15% שומנים) ויתרון שזה הזנה סטנדרטית עם אחוזים ידועים של מיני חומצות שומן ספציפיים, כמו דיאטות דג זברה וגדודי האכלה טרם טופלו על פני מעבדות 17. יתר על כן, תחליפי שומני ניאון שנקבעו חלמון הביצה לדמיין תחבורה וצבירת שומנים תזונתיים 18, מרכיבים תאיים תמונה כולל טיפות שומנים ידי ששמש הוא צבעים חיוניים כמו 3 ובאמצעות שילוב קוולנטיים לתוך שומנים מורכבים, לחקור את חילוף חומרים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 19 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקולים אלה אושרו על ידי מכון קרנגי טיפול בבעלי חיים מוסדי מדע ועדת שימוש (פרוטוקול לא. 139).

1. הכנת בעלי חיים

  1. לשמור על מבוגרים וזחלים על 28 מעלות צלזיוס על 14 שעות: 10 שעות אור: מחזור כהה. Feed מבוגרים פעמיים ביום עם הארטמיה בחינם פגז (decapsulated, הבקיעה-עישון, החל מהשעה 14 DPF) ו micropellets מסחרי.
  2. פרוטוקולים אלה מותאמים לשימוש זחלי 6-7 DPF שנאסף על ידי השרצה טבעית של רקע AB. פרוטוקולים יכולים להיות שונים עבור זחלים של גיל ורקע אחרים. אל תספק מזון אקסוגניים לפני 6 DPF.
  3. להרדים הזחלים עם Tricaine במדיה העובר (EM) (4.2 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל ​​לכל Tricaine EM 100 מ"ל) בטמפרטורת החדר (RT).

2. הכנת Feed חלמון ביצה ליפידים עשירי

  1. כן ולאחסן את חלמוני ביצת עוף. הפרד את החלמון ולבן של 12 ביצי תרנגולת. פינת את החלמונים, aliquot 1 מ"ל לתוך 1.5צינורות מ"ל, ולאחסן ב עד -80 ° C עד 1 לשנה (12 חלמוני יגרום ~ 80 aliquots). פינת הלבנים, לשמור אותם ולהשתמש בהם כמו להאכיל השומנים-עניים, עשירים בחלבון.
  2. כן אנלוגי שומני ניאון (ים) שיש להוסיף ל- RSS חלמון ביצה אם ארצה בכך.
    1. להשעות את שנרכש, אנלוגי שומנים פלורסנט האבקה באתנול 100% או 100% כלורופורם על 0.1 מיקרוגרם / μl (ראה הערה הבאה דנים ממסים), aliquot צינורות זכוכית אטומים, חותם עם parafilm, ולאחסן על פי הוראות היצרן. בשל אידוי מהיר של ממיסים אורגניים לא משתמשים באמצעי אחסון aliquot פחות מ ~ 400 μl עבור אחסון לטווח ארוך.
      הערה: אם אנלוגי השומנים מושעים באתנול, כמויות גדולות של אנלוגי השומנים תשמשנה כי הוא מתייבש מהר תחת N 2 מ כלורופורם. אם אנלוגי השומנים מושעה באתנול זה לא חייב להיות יבשים resuspended לפני הוספתו להאכיל ליפוזום בשלב 2.2.4, אך ריכוז אתנול הכולל לא יעלה על 0.1% בהזנת liposome כדי למנוע תופעות פיסיולוגיות בלבול הפוטנציאלי של אתנול.
    2. עבור אנלוגים חומצת שומן ניאון: כן בנפח כולל של 20 מיליליטר תחליב חלמון 5% ביצה ב EM. מאותו להכין 5 מ"ל aliquots עם ריכוז סופי של 6.4 מיקרומטר 4,4-difluoro-4-בורה-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY C 16) עבור מבחני הדמיה צריכת המזון confocal לחיות או 1 מיקרוגרם / מ"ל BODIPY C 12 הדמיה סטראו. מעבירים את הכמות הרצויה של אנלוגי השומנים פלורסנט לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל. ייבש את השומנים תחת זרם של N 2, נזהר שלא לתקוע שומנים מתוך הצינור.
    3. מיד, resuspend ב 5 μl 100% אתנול על ידי pipetting זרם לאורך צידי הצינור, להוסיף 95 μl EM, ומערבבים היטב.
      הערה: התערובת צריכה להופיע הומוגנית; אם בצבע השומנים נשאר על הצדדים של הצינור או הנוזל מופיע clumpy, השומנים לא solubilized מלא דורש יותר אתנול. הגן על הצינור הלוך ושובמ אור ולאחסן על הקרח.
    4. עבור אנלוגי כולסטרול ניאון: להכין ריכוז סופי של כולסטרול 2.4 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 5 מ"ל תחליב 0.5-5% חלמון ביצה ללימודי הדמיה לחיות. מעבירים את הכמות הרצויה של כולסטרול לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל. ייבש את השומנים תחת זרם של N 2, נזהר שלא לתקוע שומנים מתוך הצינור.
    5. מיד, resuspend ב 15 μl של אתנול 100% RT ידי pipetting זרם לאורך צידי הצינור ומערבבים עם 85 μl של BSA נטול חומצה שומן RT 1% ב H 2 O. מטוהרים הגן על הצינור מן האור ולאחסן על הקרח.
  3. כן Feed Liposome חלמון הביצה.
    1. הוספת aliquot מופשר של חלמון ביצה EM צינור חרוטי 50 מ"ל. וורטקס את תערובת חלמון ביצה המדוללת במשך 1-2 דקות; התערובת צריכה להיראות אמולסיה הומוגנית.
    2. יוצקים את התערובת דרך מסננת רשת בסדר להסיר קונגלומרטים חלבון ולאסוף צינור חרוטי 50 מ"ל חדש, טרי.
    3. sonica Pulsete תערובת הביצה עם microtip מחודדת אינץ רבע (5 פעמים (5 x 1 שניות על, 1 שניות כבויות) השהיית 5-10 שניות בין כל סט; עוצמת פלט: 6 W) ב RT ליצור ליפוזומים. הגדרות צריכת חשמל sonicator הם מכשיר תלוי ולכן דורשות אופטימיזציה עבור כל מכשיר ו microtip.
      הערה: ברציפות רוק תערובת ליפוזום ב RT לשמור הומוגניות עד השימוש.
  4. מוסיפים את אנלוגי השומנים פלורסנט אל ליפוזומים חלמון ביצה, אם תרצה בכך. מיד לאחר sonication, pipet את השומנים מוכנים לתוך התערובת liposome ו מערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי לשלב ליפוזומים. הגן על התערובת מן האור על ידי עטיפת הצינור בנייר ולהמשיך נדנדה ב RT.

פרדיגמה האכלה 3.

  1. הכן את הזחלים עבור האכלה.
    1. לפני התחילה להאכיל, זחלי מסך פגמים מורפולוגיים ברורים שעשויות לעכב האכלה. העברת זחלים עד 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי או 6- או 12 גם PLAtes, להפחית EM עד למינימום, ולהחליף עם 5 מ"ל של הפתרון liposome מוכן.
    2. במידת הצורך, להעביר זחלים מלאים יאכילו אותם עד 5 מיליליטר EM ו / או 5 מיליליטר 5% חלבון ביצה ב EM ולטפל במקביל.
  2. נער בעדינות את הזחלים על כיסא נדנדה וטופח (29-31 מעלות צלזיוס ב 30 סל"ד) אורך העדכון לעודד צריכת מזון תוך המשך לגונן מפני אור אם תחליפי שומנים פלורסנט נוכחים. אם צורך הזחלים להיחשף לאור, למזער את החשיפה עם כיסוי חממת זכוכית כהה.
  3. בסוף תקופת ההאכלה, יש לשטוף את הזחלים בחופשיות השוחים EM 3 פעמים.
    הערה: הזחלים עשויים להתחיל לצרוך ליפוזומים בכל נקודה במהלך ההזנה. אם זה קריטי, כי הזחלים להתחיל האכלה בעת ובעונה אחת, מסך עבור צריכת המזון (ראה 3.4) אחרי שעה 1 של האכלה ולחזור הזחלים רק כי החלו להאכיל את התחליב חלמון ביצה כדי להשלים את העדכון.
  4. מסך הזחלים בשלב זה עבור צריכת מזון כמספר קטן אולי לא eat (בדרך כלל ~ 0-5%). בדוק את המעיים של זחלים כי כבר הרדימו או מקורר מעט על גוש מתכת על קרח כדי לקבוע אם הם האכילו: זחלים שכילו ליפוזומים יהיו מעי חשוך (איור 1).
  5. זחלי תמונה או תהליך צריכת מזון מייד. לחלופין, זחלי מקום EM הטרי לדגור על 28 ° C כדי לאפשר עיבוד מטבולית להתרחש.

4. הרכבת זחלים עבור הדמיה חיה

  1. מכין את תקשורת ההרכבה.
    1. עבור תאית מתיל 3%: להוסיף תאית מתיל 0.75 גרם ל -25 מ"ל של רתיחה ליד EM, מערבולת, רוק ב RT 2-3 ימים עד שהיא נמסה לחלוטין, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך שנים ב -20 ° C. מחזורים חוזרים של הקפאה להפשרה ב 4 ° C יסירו בועות אוויר. אחסן תאיים מתיל 3% על קרח בזמן הרכבת זחלים.
    2. לקבלת 1.2% agarose נמוכה הר: להוסיף 0.3 גרם של נמוכה להמיס agarose 25 מ"ל EM לפזר ידי הבאת לרתיחה, aliquot לתוך 2 מ"ל tubes, ולשמור על C ° 26-28 על גוש חום. aliquots שאינו בשימוש ניתן לאחסן ב RT או -20 מעלות צלזיוס, מבושל שוב במועד השימוש. הקפד כי agarose הוא מגניב מספיק כדי להתמודד לפני החשיפה כדי זחלים או שהם עשויים להיות מחוממים יתר על מידה.
  2. לקבלה-בהגדלה נמוכה, הדמיה לחיות תפוקה בינונית, מקום שקופית זכוכית על רקמה על גוש מתכת על קרח ולחכות השקופיות להתקרר. למרוח כמות נדיבה של תאית מתיל 3% (אשר נשמר על 4 מעלות צלזיוס על הקרח) לשקופית, להעביר זחל על תאית 3% מתיל, באמצעות פוקר דיג אונליין (חוט דיג בקוטר 0.41 מ"מ מודבק סוף צינור נימי זכוכית) ליצור troth לניקוז עודף EM (כך תאי מתיל לא להיות מדוללת) ומקמו את הזחלים כרצונכם.
  3. עבור לטווח קצר (<20 דק '), הדמיה חיה גבוהה הגדלה עם מטרה emersion שמן זקוף, הר הזחלים עם coverslip רזה-לשיטה.
    1. להשתמש בדבק cyanoacrylate מבוסס (הפלא) כדילצרף aa coverslip 22 מ"מ x 30 מ"מ עד קצה אחד של זכוכית שקופית. השתמש פוקר לשים קו דק של תאית מתיל 3% בשקופית הסמוכה coverslip ולהעביר זחלים לשקופית עם pipet פסטר רחב לשעמם. הסר EM עודף אז זה לא לדלל את תאית מתיל.
    2. באמצעות פוקר, מקם זחלים בעדין תאי מהתיל על צדם (בצד שמאל עד תמונה יותר של הכבד, בצד ימין למעלה כדי שזה יקלוט את כיס המרה) עם ראשיהם ליד coverslip.
    3. ספוט דבק מגע בפינות של coverslip השני ומניחים בעדינות קצה אחד של coverslip על coverslip רכוב והשני בשקופית, לגשר על הזחלים. יש להיזהר שלא להפעיל לחץ עודף במהלך שלב זה או במטרה תוך הדמיה כך הזחלים נשארים ללא פגע.
  4. עבור לטווח ארוך, הדמיה בהגדלה גבוהה עם טבילה אובייקטיבית זקופה, הר זחלי agarose. הוספת זחל aliquot קטן של נמוך להמס 1.2% agarose מכן להעביר אתזחל בנפח קטן של agarose כדי בצלחת פטרי.
    1. במהירות למקם את הזחלים עם פוקר לפני agarose מתמצק. אפשר agarose להתייבש במשך 2-3 דקות ומכסים את agarose מלא עם EM טריים למנוע התייבשותו.
  5. עבור לטווח ארוך, הדמיה בהגדלה גבוהה עם מטרה הפוכה, הר זחלים על צלחת זכוכית התחתונה ב agarose.
    1. מגניב גוש מתכת על קרח. מניח את התבנית על גוש המתכת המופרד על ידי רקמות כדי למנוע קירור יתר והקפאת זחל. העברת זחל כדי בצלחת ולהסיר את EM ידי פתילה עם רקמה.
    2. מניחים ירידה של 28 ° C נמוכה להמיס agarose (1.2%) על גבי הזחל ומיד למקם עם פוקר (בצד שמאל למטה התמונה הטובה ביותר בכבד, בצד ימין למטה כדי שזה יקלוט את כיס המרה). סר צלחת מהגוש הקר, לאפשר לו להתייבש במשך 2-3 דקות, ולהוסיף נפח מספיק של EM הטרי כדי לכסות את agarose (~ 2-5 מיליליטר).

צריכת מזון 5.assay

  1. בסוף עדכון ליפוזום חלמון ביצה המכיל 6.4 מיקרומטר BODIPY C 16, בריכת מינימום של 10 זחלים שטף בצינור מ"ל פלסטיק 1.5 או 2, להסיר EM, ולהצמיד ההקפאה. הדגימות ניתן לאחסן ב -80 ° C מוגן מפני אור במשך כמה חודשים.
    הערה: במידת האפשר, לאסוף משכפל מרובים. חשוב לאסוף זחלים יאכילו אותם בשלב זה לנרמל עבור קרינת שומני רקע (רצוי זחלים של אותו מחזור הרבייה משמשים).
  2. בצע מיצוי שומנים בליי-דייר שונה 3,21.
    1. הוספת 100 חיץ המגון μl (20 מ"מ טריס-Cl, 1 mM EDTA) המדגם על הקרח (H מטוהרים לחילופין 2 O יכול לשמש). Homogenize על קרח עם sonicator microtip (5 שניות כולל: שניות 1 על 1 שניות כבויות). בדקו זחלים כי הם לגמרי הומוגני; אם לא, חזור. מעבירים צינור תרבות זכוכית הפנויה מ"ל 13 (צינורות זכוכית אחרים עשויים לשמש).
      הערה: כלורופורם הוא מסוכן; לבצע את כל לשעבר עוקב השומניםצעדי מתיחה ב RT במנדף כימי.
    2. עבור כל 100 μl של חיץ המגון בשימוש, להוסיף 375 μl של 1: 2 (כלורופורם: מתנול). שניות וורטקס 30-60, דגירה 10 דקות, להוסיף 125 μl של כלורופורם לכל 100 חיץ המגון μl בשימוש, ו מערבולת 30 שניות.
    3. להוסיף 125 μl של 200 מ"מ טריס pH 7.5 ל -100 חיץ המגון μl בשימוש, מערבולת 30 שניות, ו צנטריפוגות (2,000 x גרם, 5 דקות, RT, מוגן מפני אור). מוציאים בזהירות את דגימות מתוך צנטריפוגה. הם יופרדו לשני שלבים: שלב עליון הוא מימי, ממשק של פסולת זחל, ושלב אורגני נמוך (מכיל שומנים).
    4. עם טפטפת זכוכית נקי לאסוף התחתון, בשלב אורגני ולהעביר אותו לתוך צינור זכוכית נקי 13 מ"ל.
      הערה: ישמור על עצמך כדי למנוע את השלב מהימי ופסולת זחל על הממשק; אם הזיהום מתרחש, חזור על שלב צנטריפוגה נזכרים בו. מחק את השלב העליון, מימית; זה עשוי להיות מועיל כדי להסיר ולסלק זושלב לפני האיסוף בשלב האורגני. המדגם יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
    5. יבש את השלב האורגני תחת ואקום (0.12 ATM) תוך הגנה מפני אור. אל תמשיכו לייבש את דגימות לאחר הנוזלים התאדו כפי שהיא תפחית מסיסות שומנים. Resuspend את השומנים 2: 1 (כלורופורם: מתנול) ולאחסן על הקרח. ההיקף האופטימלי של כלורופורם: פתרון מתנול תלוי בשיטת הזיהוי המשמשת; להתחיל נמוכה וממשיכים לדלל לפי הצורך. הנחיה כללית היא להשתמש 10 μl למשך 10 זחלים נקוו.
  3. ספוט הכרכים המדגמים במרווחים מחולקים באופן שווה על צלחת TLC מתועלת ולסרוק את הצלחת עם סורק ליזר בשימוש שיגרתי עבור הדמית biomolecular (למשל, קורא צלחת ניאון). עבור אנלוגים השומנים פלורסנט נכלל ברשימת החומרים שיש להם מקסימום עירור מן 500-650 ננומטר מקסימום פליטה 510-665 ננומטר, שימוש בלייזר 488 ננומטר עם אוסף פליטה ב 520 ננומטר.
    1. לכמת את הקרינה הכוללת של כל נקודה עם תוכנת הדמיה.
      הערה: נכון עבור טבע קרינת שומנים רקעו על ידי הפחתת הקרינה של זיווג, דגימות זחל תאכלנה אותם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר מוזן על כיסא נדנדה ב 29-31 מעלות צלזיוס, רוב הזחלים בריאים (≥95%) יאכל בתוך השעה 1. עם רב תחליב חלמון ביצה, מעי הזחל מכהה בצבע. מאוד מעיים כהים ניתן להבחין ב -2 שעות (איור 1). אם זחלים הם יאכילו אותם או לא מוזנים, מעי שרידים ברור. זחלים נמאסים ביצת תערוכה לבנה לומן מעי נפוח שאינו להכהות בצבע.

איור 1
איור 1:. הקרנת זחלים עבור צריכת מזון סוג Wild 6-DPF זחלים הואכלו 5% חלמון ביצה ב EM עבור שעה 2 או מטופלים במקביל EM להשיג שולטת תאכיל אותם. יש זחלים יאכילו אותם מעיים ברורים בעוד זחלים הפד שכילו חלמון ביצה יש מעיים כהים כאשר צלמו ב 10X על סטריאוסקופ. ברי סולם מייצגים 0.1 מ"מ.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

האכלה עם אנלוגים שומני פלורסנט היתרים להדמיה של תחבורה מערכתית הצטברות subcellular של שומנים תזונתיים. אות הניאון הוא מתקיים בכל אברי העיכול (מעי, כבד, לבלב) של חלמון ביצת זחלים הפד 5% עם 6.4 מיקרומטר אנלוגי פלורסנט C 16 עבור 8 שעות רכובות עם coverslip סככת שיטת הדמיה עם מטרה זקופה (איור 2) 3.

איור 2
איור 2:. אנלוגים ליפידים פלורסנט דמיינו תזונתיים ליפידים התחבורה תמונה מורכבת נציג של הזחל 6-DPF (ראש פונה ימינה) נמאס חלמון 5% ב EM עם 6.4 מיקרומטר BODIPY FL C 16 עבור 8 שעות. הזחלים הוצבו ב תאי מתיל 3% על ידי coverslip להישען-לשיטה צלמו עם זקוף 63X מטרת טבילת שמן על מיקרוסקופ confocal פוטון יחיד עם ליזר ארגון. ברי סולם מייצגים 20 מיקרומטר. כבד, L; מעי, אני; לבלב, P, כיס מרה, GB; נדפס באישור Dev ביו 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנלוגים שומנים שונים לאפשר ויזואליזציה של ערכות ייחודיות של מבנים הסלולר מאז שהם עוברים מטבוליזם באופן דיפרנציאלי לתוך שומנים מורכבים (כלומר, טריגליצרידים, כולסטרול אסטרים, פוספוליפידים). בעקבות 4 - 8 שעות הזנות, C פלורסנט 16 ו- C 12 אנלוגים תווית טיפות שומנים, טיפות שומני פלורסנט FL C 5 תוויות, צינוריות כבדות ולבלב, קרום תא, ורשתות עורקות, ואנלוגיים C 2 ניאון תוויות כבדים ותעלות לבלב הסלולר ממברנות (איור 3) 3.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 3
איור 3:. לייבל אנלוגים ליפידים ניאון שונה איברים נייד ייחודי תמונות מרוכבים נציג של הזחלים נמאס חלמון ביצה 5% ב EM עם 6.4 מיקרומטר BODIPY FL C 16, ג '12, C 5, או C 2 עבור 4-8 שעות (6 DPF) . C 16 אנלוגי הוא ציין טיפות השומנים (LD) של enterocytes, C 12 ו- C 5 אנלוגית LD האנתרוציט ואת חלל המעי, ו- C 2 אנלוגי חלל המעי. הזחלים היו קבועים תאית מתיל 3% על ידי coverslip להישען-לשיטה צילמו עם טבילה אובייקטיבי זקוף 63X שמן על מיקרוסקופ confocal פוטון יחיד עם לייזר ארגון. ברי סולם מייצגים 20 מיקרון. הודפס מחדש באישור והתרופות וגילו היום דיס מודלי 22. _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

את assay צריכת מזון הזחל פותחה כדי לחקור כיצד מוטציות גנטיות, ביטוי יתר גן מהונדס, ו / או טיפול אקסוגניים המשפיע צריכת מזון זחל. זחלים ניזונים ארוחת שומנים עשירים מתובלת אנלוגי שומני ניאון כדי לציין את כמות המזון הנצרכת. זחלים יאכילו אותם נאספים במקביל לנרמל עבור כמות קרינת רקע נוכח זחלים, הגדלת הרגישות שבה אנלוגי שומני פלורסנט ניתן לאתר. assay זה שימש כדי להראות ביטוי יתר של אפוליפופרוטאין A-IVb.1 (apoA-IVb.1) מקטין את צריכת המזון. בעבר יאכילו אותם Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) הזחלים fed 10% חלמון ביצה עם 6.4 מיקרומטר פלורסנט C 16 אנלוגי עבור 4 שעות ב 7 DPF צרכו כ 30% שומנים פחות מ הזחלים סוג בר (איור 4) 20.

ge = "1"> איור 4
איור 4:. Assay צריכת המזון נציג סוג Wild (WT) ו Tg (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) (TG) הזחלים הואכלו 10% חלמון ביצה עוף עם 6.4 מיקרומטר BODIPY FL C16 עבור 4 שעות (הפד) או מטופלים במקביל EM (תאכיל אותם). (א) הזחלים היו נקווה (n = 10), שומנים חולצו, ותמציות נראו על צלחת TLC. (ב) קרינה סה"כ הייתה לכמת, המבוטא ביחידות פלורסנט שרירותיות (עפו), מנורמלות עבור קרינת רקע אחים יאכילו אותם על ידי חיסור, והביע ביחס WT. זחלי Tg overexpressing ApoA-IVb.1 להיבלע אנלוגים שומנים פחות שכותרתו fluorescently כפי שמוצג על ידי בהשוואת WT (לזווג מבחן t, p <0.001; n = 9, 20 זחלים לכל ניסוי). תיבת מייצג העשירונים 25-75 th, ואת החציוני הוא הצביע. הזיפים להראות העשירונים 10-90 ה. הודפס מחדשבאישור דיס דגם Mech 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקות המתוארות כאן לאפשר לחוקרים לטיפול דג זברת זחל עם הזנת שומנים עשירים, לדמיין עיבוד שומנים תזונתי זחלים חיים, ולכמת את צריכת מזון זחל. כדי להבטיח הצלחה, תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן כמה שלבים קריטיים. ביצי תרנגולת מסחריות להשתנות; אנו למזער השתנות פוטנציאל לבצע את כל מבחני על ביצים אורגניות מתרנגולות כלוב ללא שלא היה מועשר עבור חומצות שומן אומגה -3. שיעורי האכלה עשויים להיות נמוכים בדגים מתחת לגיל 6 DPF עם יתרת אספקת אנרגית חלמון אנדוגני, דגים בריאים, או דג עם מוטציות התפתחותיות מעכבות צריכת מזון (כלומר, לסת או מום מעי, חוסר יכולת לשחות כמו שצריך). המעבדה פרבר מבצעת בדרך כלל מחקרים האכלה בשעה שלאחר ההפריה 6-7 ימים (DPF) כי הזחלים אינם דורשים מזון אקסוגניים עד חנויות חלמון אנדוגני שלהם מותשים ודלדול חלמון מאפשר ויזואליזציה טובה יותר של מערכת העיכול. הַאֲכָלָהגם ב RT מקטין באופן משמעותי את מספר הזחלים אוכלים. אי זחלי מסך עבור צריכת מזון וכלה לא מכוונת של זחלים יאכילו אותם בניסויים הבאים עשויים לבלבל תוצאות. בנוסף, חשוב להגן על תחליפי השומנים ניאון, וכל דגימות הזחל ניזון עם אנלוגים, מפני אור במידת האפשר לשמור הקרינה המרבית, ובכך הרגישות assay. לבסוף, אם צריכת המזון תימדד, אינם מאפשרים את ההזנה ולרדוף (תקופת חילוף החומרים שלאחר feed) יעלה על סך של 4 שעות, מאז הארוחה תתחיל להיות מופרש. נכון לעכשיו, את הקצב שבו ארוחת אנלוגים שומנים פלורסנט הקשורים מופרשות אינו ידוע, אך קרינה יכולה להתמיד לאורך גוף הזחל עבור עדכוני פוסטים 2 ימים לפחות (JPO ו SAF נתונים שלא פורסמו).

ישנן מספר דרכים לשנות ולפתור את הפרוטוקולים כדי לענות על השאלות הניסיוניות של עניין. הזנת השומנים עשירים יכולה להתבצע לתקופות שונות של tIME: 1 hr יספק ארוחה קטנה, תוך 4 שעות תמלאנה את המעי עם כמות גדולה של שומנים בדם. עם זאת, להאכיל את הזחלים יותר מ -6 שעות לא מומלץ כמו החלמון וא"מ אינו מוכן בתנאים סטריליים יתר חיידקי חלמון ביצה / התחליב הלבן עשויים לבלבל תוצאות (כלומר, דלקת מוגברת, פרופיל חיידקים במעיים שינה). זחלים ניתן לבדוק מייד לאחר הארוחה כדי לחקור תופעות חריפות של הזנת הזחלים משותקת על ידי קירור או הרדמה קצר להתחיל במהירות נמאסת שוב לאחר rewarming, אבל קירור הוא השיטה המומלצת של חוסר תנועה כזחלים עשויים להפגין הקאה על הרדמה (תצפית לא פורסמה SAF). לחלופין, תקופות מרדף יכול להתבצע לאחר ההנקה כדי לאפשר תחבורה וחילוף החומרים של השומנים בתזונה לפני ללמוד. למרות הזנות בדרך כלל מתבצעות פתרון liposome 5 מ"ל, הזנות נערכו בהצלחה כרכים בטווח שבין 1 ל 20 מ"ל. ריכוז שונהים של חלמון ביצה יכול לשמש זנות זחל; במעבדה פרבר מבצעת ניסויים שגרתי עם חלמון ביצה 5% (1 מ"ל חלמון ביצה להוסיף 19 EM מ"ל), חלמון ביצה 0.5%, וחלמון ביצה 10%.

ישנן מגבלות פוטנציאליות של אנלוגים שומנים פלורסנט כי יש לקחת בחשבון. בעת הבחירה אנלוגי שומני ניאון חשוב לשקול כיצד שומני מעובד פיסיולוגי והיכן מחצית הניאון היא על המבנה הכימי של השומנים בדם כאשר לפרש תוצאות. לדוגמה, טריגליצרידים מפורקים לחומצות שומן חופשיות וגליצרול, אסטרים כולסטרול לחומצות כולסטרול שומן חופשיות, לומן המעי לפני הספיגה. לכן, אם אסתר טריגליצרידים או כולסטרול פלורסנט אנלוגי מסופק בתזונה הקרינה ציין בגוף תעקוב אחר חומצות שומן, כולסטרול חופשי, או גליצרול כי מחצית פלורסנט מחוברת, לא אסתר טריגליצרידים או כולסטרול המקורי. fluorescen השונהאנלוגים שומני t תווית מבנים הסלולר ייחודיים, ועובדה זו צריכה להיחשב במהלך הבחירה 3. כן, יש לציין, בהשוואה למטבוליזם של חומצות שומן מקומיות, התוספת של מחצית BODIPY שווה בערך הוספה ~ 2-3 פחמנים אורך שרשרת חומצות שומן (נתונים שלא פורסמו SAF).

הטכניקות המתוארות כאן מייצגות התקדמות משמעותית מעל מבחני קודם שתוארו בתחום. לפני הפיתוח של מזון חלמון ביצת עוף זה, שני כתבי יד מחקרים מפורטים בו זחלים הוזנו מופעלים ביצה קשה חלמון 4,23. הטכניקה המתוארת כאן מציגה את היתרון כי חלמון הביצה לא צריך להיות קשה ואבקה לפני השימוש וכי חלמון ביצת אבקה יש חיים חצי קצרים מאוד בשל החמצון המהיר שלה. חלמון ביצה נוזלי יכול גם להיות מוכן כמו ליפוזומים כי מקבלים ברצון אנלוגים שומנים פלורסנט למסירה התזונתית ביותר. לחלופין, שומנים רדיואקטיבי שניתן להשתמש בהם כדי investigate מטבוליזם שומנים תזונתי ולמדוד את צריכת מזון, אבל תחליפי שומני ניאון לא להציג את מפגעי בטיחות הקשורים רדיואקטיביות. עם זאת, אם חוקרים רוצים להשתמש שומנים רדיואקטיבי, במעבדת הפרבר בצעה מחקרים על מנת לוודא כי שומני radiolabeled ניתן לשלב, ואכילה בהצלחה עם, ליפוזומים 19. אנלוגים השומנים פלורסנט המתואר כאן נבחרו כי הם מראים מטבוליזם דומה במידה רבה לזה שומנים אנדוגני רדיואקטיבי, והיו בהיר מספיק עבור נמוכה והדמיה הספק גבוה.

שקדמו הפיתוח של הטכניקה הזו כדי להאכיל אנלוגים שומני ניאון כדי זחלים, אין שיטות אחרות היו זמינות לדמיין תחבורה וצבירת שומנים תזונתיות in vivo. להדמיה ישירה של אנלוגים שומני ניאון יכולה לספק יתרון על פני שימוש באמצעים עקיפים של פיזיולוגיה, כגון שומנים בדם. מדידה מדויקת של צריכת המזון דג הזברה הזחל היה גם STA-ארוךnding אתגר בתחום. החלופה היחידה הייתה הסנדליות תרבות, לתייג אותם עם נותב ניאון lipophilic 4- (4- (didecylamino) styryl) - N יודיד -methylpyridinium (4-Di-10-ASP), לאפשר הזחלים להאכיל, ולמדוד את הקרינה של באזור תוך בוטנים עם קורא צלחת 24. לבסוף, טכניקות אלה יש את היתרון של להיות החלים על שני המסכים בינוני התפוקה (כלומר, מסך גנטי קדימה של עיבוד שומנים תזונתי) וכן בדיקות הדמיה גבוהה גדלה ממוקדת (כלומר, להפוך גנטיים, השערת מחקרים מונעים). בעתיד, טכניקות אלה ניתן ליישם פנוטיפ ומסך מגוון באופיים מחלה מטבולית ו GI דג הזברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4, (4), 501 (2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30, (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360, (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232, (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104, (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111, (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8, (12), 81485 (2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121, (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236, (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132, (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7, (5), 36474 (2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53, (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292, (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7, (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8, (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10, (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44, (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7, (12), 52549 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics