A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה
Chapters
Summary September 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים בודדים מעיים יתוש, כולל בידוד וזיהוי של חיידקים midgut יתושים, דלדול אנטיביוטיקה של חיידקים מעיים יתוש, ולהחזן מחדש מין אחד חיידקים ספציפיים.
Transcript
מידגוט יתושים מטפח קהילה מורכבת של מיקרואורגניזמים המשפיעים על חילוף החומרים המארח, רבייה, כושר ויכולת וטרינרית. עם כל חיידק מעיים הוא אפקט שונה. וידאו זה מציג את ההליך כדי ללמוד את התפקיד המתאים של כל זן חיידקים או פיזיולוגיה המארח.
כדי לרכוש תרבות של מושבות חיידקיות במעיים, לנתח את midgut יתוש במצב סטרילי. לקרקע את מידגוט לנתח, serotologinate, ולהפיץ על צלחת אגר. בחר מושבות בודדות מהצלחת, וזהה את מיני החיידקים באמצעות רצף הגנים שלהם 16 SRNA.
להאכיל את היתושים עם הבלטת COD המכיל אנטיביוטיקה במשך שלושה ימים רצופים כדי להסיר microbiota המעיים. האפקטיביות של טיפול אנטיביוטי ניתן לאשר על ידי ניתוח midgut של יתוש aseptic עבור המושבה להרכיב יחידה assay לפני הקיצוניים הבאים. לאחר מכן הציגו מחדש מיני חיידקים ספציפיים שבודדו בעבר ממעי יתושים באמצעות האכלה אוראלית.
ניתן להעריך את השפעת החיידקים על הפיזיולוגיה המארחת על ידי השוואת היתושים שלא טופלו, יתושים שטופלו באנטיביוטיקה, והיתושים הציגו מחדש איפוק ספציפי. ניתוח מידגוט ובידוד חיידקים מטפחים. ראשית, לאסוף את היתושים בכלוב עם שאפה תא היתושים בתיבת האיסוף.
הרדמה של היתושים על ידי ירידה לטמפרטורה של 4 מעלות למשך שלוש עד חמש דקות. שמור את היתושים הרדמה על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי קר כקרח. לחטא את הספסל, לנתח מיקרוסקופ, מדפים על ידי ריסוס 75% אתנול, כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים מהסביבה.
משטח לערפל את היתוש על ידי הקשה לנער אותם 75% אתנול במשך שלוש דקות ולשטוף פעמיים עם חיץ PBS. חצי את היתוש בנפרד על מגלשת זכוכית סטרילית המכילה את טיפת PBS שלך. בזהירות להסיר את הרגליים, הכנפיים ואת הראש של היתוש באמצעות מדפים.
מהדקים את החזה של היתוש ואת החלק האחרון של הבטן היה מלקחיים להתפרק כדי לבודד את מערכת העיכול. השתמש מדפים כדי להסיר את היבול ואת הצינור malpighian ממערכת העיכול. היבול ממוקם ב pnterior של מידגוט ובליטות לאחר בליעת מי סוכר.
צינורות מלפיגיים הם קבוצה של צינורות הפרשה דקים בצומת של מידגוט והינדגוט. מניחים את האיפור נותק לתוך צינור EP עם 200 מיקרוליטר חיץ PBS סטרילי ולטחון אותו עם הכומר שחיקה סטרילית בספסל נקי. דגנים כדי לטעון את הומוגנית לשלוש הזיות קצב ב 50 microliters של כל אשליה לצלחת אגר LB וצלחת נואשת.
הדגירה את הצלחת כמו 37 מעלות במשך יום עד יומיים עד מושבות בודדות אפשריות. בחר מושבות בודדות לתוך בקבוק חרוט 150 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר lb חזיות בינוני. לנער את החיידקים ב 37 מעלות לילה.
זיהוי מינים. לחלץ DNA טוטו על ידי ערכת בניית DNA גנומי חיידקי להגביר 16 SRDNA על ידי PCR. התאוששות וטיהור של שברי DNA ממוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אמברוז ערכת התאוששות נסע.
ביצע ריצוף דנ"א על שברי הדנ"א המטוהרים כדי לקבל רצפי שרשרת חיידקים שהושגו. הפעל חיפוש פיצוץ לשאילתה רצף הגנים 16 SRNA של לזהות את החיידקים נגד החיידקים ואת הארכאי ואת מסד הנתונים. זיהוי לרמת המין הוגדר כגדול או שווה ל- 99%16 דמיון רצף SRDNA לערך בנק הצוות הקרוב ביותר.
לבודד הוקצה אותו המתאים, סוג כאשר הוא 16 SRDNA רצף, הדמיון היה פחות מ 99%, גדול או שווה ל 95% טיפול אנטיביוטי חיידקים מחדש. לשקול את הכמות הנדרשת של פניצילין סוכרוז סטרפטומיצין להכין לנו 10% פתרון סוכרוז, כולל מנסה 20 יחידות של פניצילין ואת 20 מיקרוגרם של סטרפטומיצין למיליליטר. לחדור את כדורי כותנה בתסמת סוכרוז המכיל אנטיביוטיקה ולה מניחים אותו על החלק העליון של נייר המכיל יתוש.
מכסים את כדור הכותנה עם צלחת פטרי 10 ס"מ כדי למנוע קו המים להתאדות. החלף את כדורי הכותנה פעמיים ביום ולהאכיל את היתוש במשך שלושה ימים רצופים. יתושים מחולקים לשתי קבוצות.
הקבוצה הראשונה הונחה ב יתושים ללא כל טיפול, כל רופא כדורי כותנה עם 10% אז הצלב ניתן מדי יום. הקבוצה השנייה טופלה באנטיביוטיקה ומגישה במשך שלושה ימים. בכל קבוצה נותפו יתושים של סרגיי.
מיקה חולץ עבור מיצוי DNA הכולל QPCR בוצע באמצעות פריימרים חיידקים אוניברסליים, איור אחד מראה את הביטוי של 16 SRNA בקבוצת הביקורת ואת קבוצת הטיפול באנטיביוטיקה. התוצאות מראות כי העלות או המימוש של פניצילין וסטרפטומיצין היה מוצלח. להכין פתרון חיידקי, מודד פתרון חיידקים בנגיף עם ספקטרופוטומטר, להוסיף השעיה אחת חיידקים OT לתוך צינור EP.
צנטריפוגה ההשעיה ב 5, 000 RCA במשך חמש דקות בארבע מעלות להשליך את supernatant, לשטוף את משטח החיידקים מנסה עם חיץ PBS סטרילי. השהה מחדש את משטח החיידקים עם חיץ PBS סטרילי 200 מיקרוליטר הוסף 600 מיקרוליטר, 10% פתרון סוכרוז, 200 מיקרוליטר ATP ו 200 מתלים חיידקיים microliter לתוך צינור AP חדש לערבב היטב. לחלופין, ניתן להשעות מחדש את החיידקים בחום ולהפעיל את הדם שלך.
הכנת דם פעיל לחימום. קריש דם טרי עם צינור נוגד קרישה, לקחת שניים עד שלושה מיליליטר של דם טרי. צנטריפוגה ב 1000 במשך 10 דקות בארבע מעלות כדי להפריד פלזמה ותאי דם.
לאסוף את הפלזמה לתוך צינור EP חדש וכאן להפעיל מופעל ב 56 מעלות במשך שעה אחת. לשטוף את בית הפיצוץ דרך הזמנים שלך עם חיץ PBS סטרילי. לשטוף בית פיצוץ מושעה עם פלזמה מופעלת חימום.
להרכיב קרום מערכת האכלה. משוך את מחלת הסרט למקסימום. לתקן עם טבעת פלסטיק פרפילם במקום העבודה, כדי למנוע את הדליפה לאט להוסיף את הפתרון החיידקי מוכן ליחידת המאכיל, לארנק המרבי.
כדי למנוע את הבועה נפלה מכיוון אחד ולאטום את יחידת ההזנה. חבר את ספק הכוח. המתן עד שהטמפרטורה תגיע ל-37 מעלות התקנת יחידת ההזנה עם תסכולת חיידקים על המאכיל.
לפני האכלת יתושים חיידקים יש לעצור במשך 24 שעות כדי לעכל אנטיביוטיקה. עבור יחידת ההזנה על הנייר עם יתושים, ולאחר מכן לאפשר האכלה במשך 90 דקות. יתושים מעודדים לחלוטין ניתן לבחור למחקרים נוספים.
תוצאות מייצגות. איור 2 מראה לנו את השבחים הממוצעים לכל יתוש. לאחר עלילה האכלה של אנטיביוטיקה טיפלו יתושים אנו רואים מנינגומפטיקום.
איור 3 מציג את הביטוי של גנים הקשורים להתפתחות וריאנט 24 שעות לאחר ארוחת הדם המכילה את קרום המוח C. התוצאות מראות כי אין שינוי משמעותי בייצור הביצים של קבוצת הביקורת והקבוצה הדהויה. תודה על העניין שלך בחיידקים או חיבור האכלה עם יתושים מטופלים באנטיביוטיקה.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
