उच्च वसा वाले दूध पिलाने लार्वा zebrafish के लिए प्रतिमान: दूध पिलाने की, लाइव इमेजिंग, और भोजन का सेवन की मात्रा

Biology

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Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

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Abstract

Introduction

तंत्र है जिसके द्वारा आंत को नियंत्रित आहार लिपिड प्रसंस्करण, जिगर को नियंत्रित जटिल लिपिड संश्लेषण और लिपोप्रोटीन चयापचय, और कैसे इन अंगों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ काम भोजन का सेवन को नियंत्रित करने के अधूरे समझ रहे हैं। यह मोटापा, हृदय रोग, मधुमेह, और गैर शराबी फैटी लीवर रोग की वर्तमान महामारी के प्रकाश में इस जीव विज्ञान स्पष्ट करने के लिए जैव चिकित्सा ब्याज की है। सेल संस्कृति में अध्ययन और चूहों आहार लिपिड और रोग, और zebrafish (Danio rerio) के बीच यंत्रवत संबंधों के बारे में हमारी समझ के बहुमत प्रदान किया है इस काम के पूरक के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में उभर रहे हैं।

Zebrafish, समान जठरांत्र (सैनिक) अंगों, लिपिड चयापचय, और लिपोप्रोटीन परिवहन उच्च रीढ़ 1,2 करने की जरूरत तेजी से विकसित करने, और आनुवंशिक रूप से विनयशील हैं। लार्वा zebrafish के ऑप्टिकल स्पष्टता विवो पढ़ाई में सुविधा है, एक particulaइसकी बाह्य वातावरण के रूप में सैनिक प्रणाली के अध्ययन के लिए आर लाभ (यानी, पित्त, माइक्रोबायोटा, अंत: स्रावी संकेतन) लगभग असंभव पूर्व vivo। अनुसार, साथ zebrafish लार्वा की इमेजिंग रहने के लिए आनुवंशिक शिक्षणीयता और conduciveness के संयोजन अनुसंधान के एक शरीर मॉडल के लिए है आहार जोड़तोड़ (उच्च वसा 3,4, -cholesterol 5, और -carbohydrate आहार 6.7), और हृदय रोग 8 के मॉडल की एक किस्म, मधुमेह 9,10, यकृत स्टीटोसिस 11-13, 14-16 और मोटापा, चयापचय अंतर्दृष्टि के एक मेजबान प्रदान करने के लिए उभर रहे हैं।

चयापचय अनुसंधान में लार्वा zebrafish संक्रमण का एक अनिवार्य पहलू zebrafish और उपन्यास assays कि zebrafish की अद्वितीय ताकत का फायदा उठाने के विकास के लिए अन्य मॉडल पशुओं में विकसित तकनीकों के अनुकूलन है। इस प्रोटोकॉल की तकनीक विकसित की है और अनुकूलित एक लिपि लार्वा zebrafish को खिलाने के लिए प्रस्तुत करता हैडी युक्त भोजन, subcellular संकल्प करने के लिए पूरे शरीर से आहार लिपिड प्रसंस्करण कल्पना है, और भोजन का सेवन को मापने। चिकन अंडे की जर्दी लिपिड युक्त भोजन रचना करने के लिए चुना गया था के रूप में यह वसा और कोलेस्ट्रॉल (लिपिड रचना ~ चिकन अंडे की जर्दी, ~ 5% है, जिनमें से कोलेस्ट्रॉल, ट्राइग्लिसराइड्स 60% कर रहे हैं, और 35% से 58% फॉस्फोलिपिड हैं के उच्च स्तर शामिल )। के रूप में zebrafish आहार और खिला रेजिमेंटों प्रयोगशालाओं 17 के पार मानकीकृत नहीं किया गया है चिकन अंडे की जर्दी, ठेठ व्यावसायिक zebrafish micropellet खाद्य पदार्थ (~ 15% लिपिड) और लाभ यह विशिष्ट फैटी एसिड प्रजातियों में से ज्ञात प्रतिशत के साथ एक मानकीकृत फ़ीड है कि अधिक से अधिक वसा प्रदान करता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट लिपिड अंडे की जर्दी में प्रदान की analogs परिवहन और आहार लिपिड 18 के संचय, दोनों के रूप में महत्वपूर्ण रंगों 3 और जटिल लिपिड में सहसंयोजक समावेश के माध्यम से अभिनय से लिपिड बूंदों सहित छवि सेलुलर घटकों कल्पना, पतली परत क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से चयापचय की जांच (टीएलसी) 19 20 के लिए एक मात्रात्मक परख प्रदान करते हैं।

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Protocol

इन प्रोटोकॉल विज्ञान संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के लिए कार्नेगी इंस्टीट्यूशन (प्रोटोकॉल नहीं। 139) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. पशु तैयारी

  1. एक 14 घंटा पर 28 डिग्री सेल्सियस पर वयस्कों और लार्वा बनाए रखें: 10 घंटा प्रकाश: अंधेरे चक्र। वयस्कों फीड शैल नि: शुल्क Artemia (decapsulated, गैर-हैचिंग, 14 DPF पर शुरू) और वाणिज्यिक micropellets के साथ दिन में दो बार।
  2. इन प्रोटोकॉल एबी पृष्ठभूमि के प्राकृतिक स्पॉन द्वारा एकत्र 6-7 DPF लार्वा के उपयोग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल अन्य उम्र और पृष्ठभूमि के लार्वा के लिए संशोधित किया जा सकता है। बहिर्जात भोजन उपलब्ध कराने से पहले 6 DPF मत करो।
  3. भ्रूण मीडिया में Tricaine (ईएम) के साथ लार्वा कमरे के तापमान पर (आरटी) (4 मिलीग्राम प्रति 100 मिलीलीटर ईएम / एमएल Tricaine के 4.2 एमएल) anesthetize।

2. लिपिड युक्त अंडे की जर्दी फ़ीड की तैयारी

  1. तैयार है और चिकन अंडे की दुकान। जर्दी और 12 चिकन अंडे का सफेद अलग करें। जर्दी पूल, विभाज्य 1 मिलीलीटर 1.5 मेंमिलीलीटर ट्यूब, और -80 डिग्री सेल्सियस तक 1 साल के लिए कम से दुकान (12 ~ 80 जर्दी aliquots कर देगा)। सफेद, दुकान पूल, और एक लिपिड गरीब, प्रोटीन युक्त चारे के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
  2. फ्लोरोसेंट लिपिड अनुरूप (एस) तैयार अंडे की जर्दी फ़ीड करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए अगर वांछित।
    1. 0.1 माइक्रोग्राम / μl में खरीदा, पाउडर फ्लोरोसेंट लिपिड 100% इथेनॉल या 100% क्लोरोफॉर्म में एनालॉग निलंबित अपारदर्शी ग्लास ट्यूब में, विभाज्य (निम्न टिप्पणी सॉल्वैंट्स पर चर्चा देखें), parafilm के साथ सील, और दुकान निर्माता के निर्देशों के अनुसार। कार्बनिक सॉल्वैंट्स का तेजी से वाष्पीकरण के कारण लंबी अवधि के भंडारण के लिए ~ 400 μl से कम विभाज्य मात्रा में प्रयोग नहीं करते।
      नोट: लिपिड अनुरूप इथेनॉल में निलंबित कर दिया है, तो लिपिड अनुरूप की बड़ी मात्रा में है, क्योंकि यह क्लोरोफॉर्म से एन 2 के तहत तेजी से सूख जाता है इस्तेमाल किया जाएगा। लिपिड अनुरूप इथेनॉल में निलंबित कर दिया जाता है तो यह सूखे और resuspended जा करने के लिए कदम 2.2.4 में liposome फ़ीड में जोड़ने से पहले नहीं है, लेकिन कुल इथेनॉल एकाग्रता 0 से अधिक नहीं होनी चाहिए।liposome फ़ीड में 1% इथेनॉल के संभावित confounding मनोवैज्ञानिक प्रभाव से बचने के लिए।
    2. फ्लोरोसेंट फैटी एसिड analogs के लिए: ईएम में 20 मिलीलीटर 5% अंडे की जर्दी पायस की कुल मात्रा को तैयार है। उस से जीना confocal इमेजिंग और भोजन का सेवन assays या 1 माइक्रोग्राम / एमएल के लिए 6.4 माइक्रोन के 4,4-difluoro-4-बोरा -3 ए, 4 ए-diaza-S-indacene के अंतिम एकाग्रता (BODIPY सी 16) के साथ 5 मिलीलीटर aliquots तैयार stereomicroscope इमेजिंग के लिए BODIPY सी 12। एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में फ्लोरोसेंट लिपिड एनालॉग के वांछित राशि स्थानांतरण। 2 एन के एक धारा के तहत लिपिड सूखी, देखभाल करने के ट्यूब से बाहर लिपिड उड़ाने के लिए नहीं।
    3. इसके तत्काल बाद, ट्यूब के पक्ष नीचे एक धारा pipetting द्वारा 5 μl 100% इथेनॉल में resuspend, 95 μl ईएम जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह मिलाएँ।
      नोट: मिश्रण समरूप प्रकट करना चाहिए; यदि रंग का लिपिड ट्यूब के किनारों पर बनी हुई है या तरल clumpy प्रकट होता है, लिपिड पूरी तरह से solubilized और अधिक इथेनॉल की आवश्यकता नहीं किया है। ट्यूब इधर-उधर की रक्षाएम प्रकाश और बर्फ पर दुकान।
    4. फ्लोरोसेंट कोलेस्ट्रॉल एनालॉग के लिए: लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए 5 मिलीलीटर 0.5-5% अंडे की जर्दी पायस में 2.4 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के अंतिम एकाग्रता तैयार करते हैं। एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में कोलेस्ट्रॉल के वांछित राशि स्थानांतरण। 2 एन के एक धारा के तहत लिपिड सूखी, देखभाल करने के ट्यूब से बाहर लिपिड उड़ाने के लिए नहीं।
    5. इसके तत्काल बाद, ट्यूब के पक्ष नीचे एक धारा pipetting और शुद्ध एच 2 ओ में RT 1% फैटी एसिड मुक्त बीएसए के 85 μl के साथ मिश्रण द्वारा RT 100% इथेनॉल के 15 μl में resuspend प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखें और बर्फ पर दुकान।
  3. तैयार अंडे की जर्दी Liposome फ़ीड।
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में करने के लिए उन्हें अंडे की जर्दी का एक thawed विभाज्य जोड़ें। 1-2 मिनट के लिए पतला अंडे की जर्दी मिश्रण भंवर; मिश्रण एक समरूप पायस होना प्रकट करना चाहिए।
    2. प्रोटीन कंपनियों के संगठन को हटाने और एक नया, ताजा 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए एक ठीक जाल छलनी के माध्यम से मिश्रण डालो।
    3. पल्स सोनिकाliposomes बनाने के लिए आरटी पर: अंडे का मिश्रण एक एक चौथाई इंच पतला microtip साथ ते (6 डब्ल्यू उत्पादन तीव्रता 5 बार (5 एक्स 1 सेकंड, 1 सेकंड बंद) प्रत्येक सेट के बीच में 5-10 सेकंड रोक)। Sonicator शक्ति सेटिंग्स साधन निर्भर कर रहे हैं और इसलिए प्रत्येक साधन और microtip के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है।
      नोट: लगातार आरटी पर liposome मिश्रण रॉक उपयोग करें जब तक एकरूपता बनाए रखने के लिए।
  4. अंडे की जर्दी liposomes फ्लोरोसेंट लिपिड अनुरूप जोड़ें, अगर वांछित। इसके तत्काल बाद sonication, liposomes में शामिल करने के लिए 30 सेकंड के लिए उच्च गति पर liposome मिश्रण और भंवर में तैयार लिपिड pipet। पन्नी में ट्यूब लपेटकर द्वारा प्रकाश से मिश्रण को सुरक्षित रखें और आरटी पर कमाल जारी है।

3. दूध पिलाने प्रतिमान

  1. दूध पिलाने के लिए लार्वा तैयार करें।
    1. चारा, स्पष्ट रूपात्मक दोष है कि खिला में बाधा हो सकती लिए स्क्रीन लार्वा शुरू करने से पहले। 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश या 6 या 12 अच्छी तरह से पीएलए के लिए स्थानांतरण लार्वाटीईएस, उन्हें एक न्यूनतम करने के लिए कम करने, और तैयार liposome समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें।
    2. यदि आवश्यक हो, 5 मिलीलीटर ईएम और / या ईएम में 5 मिलीलीटर 5% अंडे का सफेद करने के लिए भूखा नियंत्रण लार्वा हस्तांतरण और समानांतर में इलाज करते हैं।
  2. धीरे चारा भर में एक incubated घुमाव में लार्वा (30 rpm पर 29-31 डिग्री सेल्सियस) रॉक प्रकाश से ढाल करने के लिए अगर फ्लोरोसेंट लिपिड analogs मौजूद हैं जारी करते हुए भोजन का सेवन प्रोत्साहित करने के लिए। लार्वा की जरूरत प्रकाश को उजागर किया है, एक रंगा हुआ ग्लास इनक्यूबेटर कवर के साथ जोखिम को कम।
  3. खिला अवधि के अंत में, 3 बार ईएम में स्वतंत्र रूप से तैराकी लार्वा कुल्ला।
    नोट: लार्वा फ़ीड के दौरान किसी भी बिंदु पर लेने वाली liposomes शुरू कर सकते हैं। यदि यह महत्वपूर्ण है कि लार्वा एक ही समय में खिला शुरू है, भोजन का सेवन के लिए स्क्रीन खिलाने के 1 घंटे के बाद (3.4 देखें) और केवल लार्वा कि अंडे की जर्दी पायस को खिला फ़ीड पूरा करने के लिए शुरू किया है वापसी।
  4. एक छोटी संख्या के रूप में भोजन का सेवन के लिए इस बिंदु पर लार्वा स्क्रीन ईए नहीं हो सकताटी (आम तौर पर ~ 0-5%)। लार्वा की आंतों कि anesthetized किया गया है या थोड़ा ठंडा बर्फ पर एक धातु खंड पर निर्धारित करने के लिए यदि वे तंग आ चुके हैं जांच: लार्वा कि liposomes का सेवन किया है एक अंधेरे आंत (चित्रा 1) होगा।
  5. भोजन का सेवन तुरंत के लिए छवि या प्रक्रिया लार्वा। वैकल्पिक रूप से, ताजा ईएम में जगह लार्वा और 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते चयापचय प्रसंस्करण घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए।

4. रहते इमेजिंग के लिए लार्वा बढ़ते

  1. बढ़ते मीडिया तैयार करें।
    1. 3% मिथाइल सेलुलोज के लिए: -20 डिग्री सेल्सियस पर साल के लिए पास उबलते ईएम, भंवर, 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी 2-3 दिनों पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक पर रॉक, और दुकान के 25 मिलीलीटर में जोड़ने के लिए 0.75 ग्राम मिथाइल सेलुलोज। 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंड और विगलन के दोहराया चक्र हवाई बुलबुले को दूर करेगा। बर्फ पर दुकान 3% मिथाइल सेलुलोज जबकि लार्वा बढ़ते।
    2. 1.2% कम माउंट agarose के लिए: के 0.3 ग्राम जोड़ने के लिए 25 एमएल के लिए उन्हें agarose कम पिघल और 2 मिलीलीटर टी में एक फोड़ा, विभाज्य को लाकर भंगubes, और एक गर्मी ब्लॉक पर 26-28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। अप्रयुक्त aliquots आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है या -20 डिग्री सेल्सियस और उपयोग के समय में फिर उबला हुआ। सुनिश्चित करें कि agarose काफी शांत लार्वा को उजागर या वे हो सकता है पर गर्म होने से पहले संभाल रहा है हो।
  2. कम बढ़ाई, मध्यम throughput लाइव इमेजिंग के लिए, बर्फ पर एक धातु खंड पर एक ऊतक पर एक गिलास स्लाइड जगह है और स्लाइड को शांत करने के लिए प्रतीक्षा करें। (0.41 मिमी व्यास मछली पकड़ने लाइन 3% मिथाइल सेलुलोज के एक उदार राशि स्लाइड पर (जो बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है) को लागू करें, 3% मिथाइल सेलुलोज पर एक लार्वा हस्तांतरण, एक मछली पकड़ने ऑनलाइन पोकर का उपयोग कर से चिपके एक गिलास केशिका ट्यूब के अंत) के निकास के लिए अतिरिक्त ईएम (ताकि मिथाइल सेलुलोज पतला नहीं किया जाएगा) और वांछित के रूप में लार्वा स्थिति एक troth पैदा करते हैं।
  3. अल्पकालिक (<20 मिनट) के लिए, एक ईमानदार तेल प्रकट होना उद्देश्य के साथ उच्च बढ़ाई रहते इमेजिंग, coverslip विधि दुबला करने के साथ लार्वा माउंट।
    1. करने के लिए cyanoacrylate आधारित गोंद (Superglue) का प्रयोग करेंएक गिलास स्लाइड के एक छोर से हूँ 22 मिमी x 30 मिमी coverslip देते हैं। एक पोकर का प्रयोग करें स्लाइड coverslip से सटे पर 3% मिथाइल सेलुलोज की एक पतली रेखा डाल दिया है और एक विस्तृत बोर पाश्चर pipet के साथ स्लाइड करने के लार्वा हस्तांतरण करने के लिए। अतिरिक्त ईएम हटाये तो यह मिथाइल सेलुलोज कमजोर नहीं होगा।
    2. एक पोकर का प्रयोग, धीरे अपने पक्ष पर मिथाइल सेलुलोज में लार्वा स्थिति (अप जिगर के अधिक छवि के लिए बाईं ओर, सही पित्ताशय की थैली छवि के लिए ऊपर की ओर) coverslip के बगल में उनके सिर के साथ।
    3. एक दूसरे coverslip के कोनों और धीरे में स्पॉट superglue घुड़सवार coverslip पर coverslip और स्लाइड पर अन्य के एक किनारे जगह है, लार्वा को पाटने। देखभाल के इस कदम के दौरान या उद्देश्य जबकि इमेजिंग इतना है कि लार्वा रिहाई रहने के साथ अतिरिक्त दबाव लागू करने के लिए नहीं ले लो।
  4. लंबी अवधि के लिए, एक ईमानदार विसर्जन उद्देश्य के साथ उच्च बढ़ाई इमेजिंग, agarose में लार्वा माउंट। 1.2% कम पिघल के एक छोटे से विभाज्य करने के लिए एक लार्वा जोड़े agarose तो हस्तांतरणएक पेट्री डिश के लिए agarose की एक छोटी मात्रा में लार्वा।
    1. जल्दी agarose solidifies से पहले एक पोकर के साथ लार्वा स्थिति। agarose 2-3 मिनट के लिए सूखी और ताजा ईएम के साथ पूरी तरह agarose कवर यह सूखने से रोकने के लिए करने की अनुमति दें।
  5. लंबी अवधि के लिए, एक औंधा उद्देश्य के साथ उच्च बढ़ाई इमेजिंग, agarose में एक गिलास नीचे पकवान पर लार्वा माउंट।
    1. बर्फ पर एक धातु खंड शांत। धातु एक ऊतक के द्वारा अलग अत्यधिक ठंडा और लार्वा ठंड को रोकने के लिए ब्लॉक पर पकवान रखें। डिश के लिए एक लार्वा स्थानांतरण और एक ऊतक के साथ बाती से ईएम को हटा दें।
    2. 28 डिग्री सेल्सियस कम पिघल agarose (1.2%) लार्वा के शीर्ष पर की एक बूंद रखें और तुरंत एक पोकर (सबसे अच्छी छवि के लिए नीचे बाईं ओर जिगर, पित्ताशय की थैली छवि के नीचे दाईं ओर) के साथ स्थिति। ठंड ब्लॉक से पकवान निकालें, 2-3 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं, और agarose कवर करने के लिए नए सिरे से ईएम की पर्याप्त मात्रा जोड़ने (~ 2-5 मिलीलीटर)।

5. खाद्य सेवनपरख

  1. एक अंडे की जर्दी liposome युक्त 6.4 माइक्रोन के BODIPY सी 16 फ़ीड के अंत में, एक प्लास्टिक 1.5 या 2 मिलीलीटर ट्यूब में 10 धोया लार्वा की एक न्यूनतम पूल ईएम हटाने, और फ्रीज तस्वीर। नमूने -80 डिग्री सेल्सियस कई महीनों के लिए प्रकाश से संरक्षित पर संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: यदि संभव हो तो, कई प्रतिकृति इकट्ठा। यह (इस्तेमाल कर रहे हैं एक ही क्लच से आदर्श लार्वा) पृष्ठभूमि लिपिड प्रतिदीप्ति के लिए सामान्य करने के लिए इस कदम पर भूखा लार्वा इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. एक संशोधित Bligh-डायर लिपिड निकासी 3,21 प्रदर्शन करना।
    1. 100 μl homogenization बफर (20 मिमी Tris-सीएल, 1 मिमी EDTA) बर्फ पर नमूना (वैकल्पिक रूप से शुद्ध एच 2 ओ इस्तेमाल किया जा सकता है) करने के लिए जोड़ें। (: 1 सेकंड बंद पर 1 सेकंड 5 सेकंड कुल) एक microtip sonicator के साथ बर्फ पर homogenize। कि लार्वा पूरी तरह से homogenized हैं की जाँच करें; यदि नहीं, तो दोहराएँ। एक 13 मिलीलीटर डिस्पोजेबल गिलास संस्कृति ट्यूब पर स्थानांतरण (अन्य ग्लास ट्यूब का इस्तेमाल किया जा सकता है)।
      नोट: क्लोरोफॉर्म खतरनाक है; बाद के सभी लिपिड पूर्व प्रदर्शनएक रासायनिक हुड में आरटी पर कर्षण कदम।
    2. (: मेथनॉल क्लोरोफॉर्म) 2: इस्तेमाल किया homogenization बफर के प्रत्येक 100 μl के लिए, 1 की 375 μl जोड़ें। भंवर 30-60 सेकंड, 10 मिनट सेते हैं, प्रति 100 μl homogenization इस्तेमाल किया बफर क्लोरोफॉर्म, और भंवर 30 सेकंड के 125 μl जोड़ें।
    3. 200 मिमी Tris पीएच के 125 μl जोड़ें 7.5 प्रति 100 μl homogenization इस्तेमाल किया बफर, भंवर 30 सेकंड, और सेंट्रीफ्यूज (2,000 x जी, 5 मिनट, आरटी, प्रकाश से सुरक्षित)। ध्यान से सेंट्रीफ्यूज से नमूने को हटा दें। वे दो चरणों में विभाजित किया जाएगा: एक ऊपरी चरण जलीय है, लार्वा मलबे के एक इंटरफेस है, और एक कम जैविक चरण (लिपिड शामिल हैं)।
    4. एक साफ ग्लास विंदुक के साथ नीचे, जैविक चरण को इकट्ठा करने और यह एक साफ 13 एमएल ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित।
      नोट: इंटरफेस में जलीय चरण और लार्वा मलबे से बचने के लिए ध्यान रखना; अगर प्रदूषण होता है, centrifugation कदम और याद दोहराएँ। ऊपरी, जलीय चरण त्यागें; इसे हटाने और इस त्यागने के लिए सहायक हो सकता हैजैविक चरण इकट्ठा करने से पहले चरण। नमूना 1 महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    5. वैक्यूम के अंतर्गत जैविक चरण (0.12 एटीएम) सूखी जबकि प्रकाश से बचाती है। बाद तरल के रूप में यह लिपिड घुलनशीलता कम हो जाएगा हवा हो गया है नमूने सुखाने के लिए जारी नहीं है। 2 में लिपिड Resuspend: 1 (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल) और बर्फ पर दुकान। क्लोरोफॉर्म का इष्टतम मात्रा: मेथनॉल समाधान इस्तेमाल का पता लगाने विधि पर निर्भर करता है; कम शुरू करते हैं और जरूरत के रूप में कमजोर करने के लिए जारी है। एक सामान्य दिशानिर्देश 10 जमा लार्वा के लिए 10 μl का उपयोग करने के लिए है।
  3. एक मोड़ा टीएलसी थाली पर समान रूप से स्थान के अंतराल में पूरे नमूना संस्करणों को हाजिर और एक लेजर स्कैनर नियमित तौर पर biomolecular इमेजिंग (जैसे, एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर) के लिए इस्तेमाल के साथ प्लेट स्कैन। फ्लोरोसेंट लिपिड analogs सामग्री सूची 510-665 एनएम से 500-650 एनएम और उत्सर्जन Maxima से एक उत्तेजना Maxima है कि में शामिल के लिए, 520 एनएम पर एक 488 एनएम लेजर और उत्सर्जन संग्रह के साथ उपयोग।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक स्थान की कुल प्रतिदीप्ति यों।
      नोट: स्वाभाविक रूप से बनती है, भूखा लार्वा नमूनों की प्रतिदीप्ति को घटाकर पृष्ठभूमि लिपिड प्रतिदीप्ति होने वाली के लिए सही है।

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Representative Results

जब 29-31 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर खिलाया, स्वस्थ लार्वा (≥95%) के बहुमत 1 घंटा के भीतर खा जाएगा। लेने वाली अंडे की जर्दी पायस पर, लार्वा आंत रंग में darkens। बहुत अंधेरा आंतों 2 घंटा (चित्रा 1) में देखा जा सकता है। लार्वा भूखा रहे हैं या खिलाने के लिए असफल हो, आंत साफ रहता है। लार्वा अंडे का सफेद तंग आ प्रदर्शनी एक distended आंतों लुमेन कि रंग में काला नहीं है।

आकृति 1
चित्रा 1:। खाद्य सेवन के लिए लार्वा स्क्रीनिंग जंगली प्रकार 6 DPF लार्वा 2 घंटे के लिए ईएम में 5% अंडे की जर्दी तंग आ गया या ईएम में समानांतर में इलाज भूखा नियंत्रण प्राप्त करने के लिए किए गए थे। भूखा लार्वा स्पष्ट आंतों है, जबकि फेड लार्वा कि अंडे की जर्दी का सेवन किया है अंधेरा आंतों जब एक त्रिविमदर्शी पर 10X पर imaged है। स्केल सलाखों 0.1 मिमी प्रतिनिधित्व करते हैं।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फ्लोरोसेंट लिपिड analogs के साथ दूध पिलाने प्रणालीगत परिवहन और आहार लिपिड की subcellular संचय के दृश्य परमिट। के लिए 8 घंटे coverslip दुबला-करने के लिए विधि और एक ईमानदार उद्देश्य के साथ imaged (चित्रा के साथ मुहिम शुरू फ्लोरोसेंट संकेत के साथ 6.4 माइक्रोन के फ्लोरोसेंट सी 16 अनुरूप लार्वा फेड 5% अंडे की जर्दी के पाचन अंगों (आंत, लीवर, और अग्न्याशय) भर में मौजूद है 2) 3।

चित्र 2
चित्रा 2:। एक 6 DPF लार्वा की फ्लोरोसेंट लिपिड Analogs कल्पना आहार लिपिड परिवहन प्रतिनिधि समग्र छवि (सिर अधिकार का सामना करना पड़) सी 16 6.4 माइक्रोन के BODIPY फ्लोरिडा के साथ ईएम में 5% अंडे की जर्दी से तंग आ गया 8 घंटे के लिए। लार्वा coverslip से 3% मिथाइल सेलुलोज में रखा गया था दुबला-करने के लिए विधि और एक ईमानदार 63X के साथ imaged एक आर्गन लेजर के साथ एक फोटान confocal खुर्दबीन पर तेल विसर्जन उद्देश्य। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। लिवर, एल; आंत, मैं; अग्न्याशय, पी, पित्ताशय की थैली, जीबी; देव बायो 3 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विभिन्न लिपिड analogs सेलुलर संरचनाओं की अद्वितीय सेट के दृश्य की अनुमति के बाद से वे विभिन्न जटिल लिपिड (यानी, ट्राइग्लिसराइड्स, कोलेस्ट्रॉल एस्टर, फॉस्फोलिपिड) में metabolized हैं। बाद 4 - 8 मानव संसाधन खिलाती है, फ्लोरोसेंट सी 16 और सी 12 analogs लिपिड बूंदों, फ्लोरोसेंट फ्लोरिडा सी 5 लेबल लिपिड बूंदों, यकृत और अग्नाशय नलिकाएं, सेलुलर झिल्ली, और धमनी नेटवर्क, और फ्लोरोसेंट सी 2 अनुरूप यकृत और अग्नाशय नलिकाएं और सेलुलर लेबल लेबल झिल्ली (चित्रा 3) 3।

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चित्रा 3:। विभिन्न फ्लोरोसेंट लिपिड Analogs लेबल अद्वितीय सेलुलर अंगों लार्वा के प्रतिनिधि समग्र चित्र 5% अंडे की जर्दी ईएम में सी 16, सी 12, सी 5, या सी 2 के साथ 6.4 माइक्रोन के BODIPY फ्लोरिडा 4-8 घंटा (6 DPF) के लिए तंग आ गया । सी 16 अनुरूप एन्तेरोच्य्तेस के लिपिड बूंदों (एलडी) में मनाया जाता है, enterocyte एलडी और आंतों लुमेन, और आंतों लुमेन में सी 2 अनुरूप में सी 12 और सी 5 analogs। लार्वा 3% मिथाइल सेलुलोज में coverslip से बढ़ रहे थे दुबला-करने के लिए विधि और एक आर्गन लेजर के साथ एक फोटान confocal खुर्दबीन पर एक ईमानदार 63X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ imaged। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। ड्रग discov आज जिले मॉडल 22 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।_blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लार्वा भोजन का सेवन परख कैसे आनुवंशिक परिवर्तन, ट्रांसजेनिक जीन overexpression जांच करने के लिए विकसित किया गया था, और / या exogenous उपचार लार्वा भोजन का सेवन प्रभावित करते हैं। लार्वा एक लिपिड युक्त भोजन एक फ्लोरोसेंट लिपिड अनुरूप के साथ नुकीला भस्म भोजन की राशि इंगित करने के लिए तंग आ चुके हैं। भूखा लार्वा समानांतर में एकत्र कर रहे हैं लार्वा में मौजूद पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की राशि के लिए सामान्य करने के लिए, संवेदनशीलता, जिस पर फ्लोरोसेंट लिपिड अनुरूप पता लगाया जा सकता बढ़ रही है। इस परख apolipoprotein ए-IVb.1 (apoA-IVb.1) भोजन का सेवन कम हो जाती है कि overexpression को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इससे पहले भूखा टीजी (hsp70: apoA-IVb.1: mCherry) लार्वा 7 DPF पर 4 घंटे के लिए 6.4 माइक्रोन के साथ फ्लोरोसेंट सी 16 अनुरूप 10% अंडे की जर्दी से तंग आ गया (चित्रा 4) 20 भस्म जंगली प्रकार लार्वा की तुलना में लगभग 30% कम लिपिड।


चित्रा 4:। प्रतिनिधि खाद्य सेवन परख जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और टीजी (hsp70: mCherry: apoA-IVb.1) 4 घंटा (फेड) या 6.4 माइक्रोन के BODIPY फ्लोरिडा C16 के साथ (टीजी) लार्वा खिलाया गया 10% चिकन अंडे की जर्दी ईएम (भूखा) में समानांतर में इलाज किया। (ए) लार्वा जमा थे (एन = 10), लिपिड निकाले गए थे, और अर्क एक टीएलसी थाली पर देखा गया था। (बी) के कुल प्रतिदीप्ति मात्रा निर्धारित किया गया था, मनमाने ढंग से फ्लोरोसेंट इकाइयों (AFU), घटाव से भूखा भाई बहनों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत में व्यक्त की, और गुम्मट के सापेक्ष व्यक्त किया। टीजी लार्वा overexpressing ApoA-IVb.1 निगलना कम fluorescently लेबल लिपिड analogs के रूप में गुम्मट की तुलना द्वारा दिखाए (बनती छात्र की टी परीक्षण, पी <0.001, एन = 9, प्रयोग प्रति 20 लार्वा)। बॉक्स 25-75 वें शतमक का प्रतिनिधित्व करता है, और मंझला संकेत दिया है। मूंछ 10-90 वें शतमक दिखा। पुनर्प्रकाशितजिले मॉडल मैक् 20 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तकनीक यहाँ वर्णित शोधकर्ताओं ने एक लिपिड युक्त फ़ीड के साथ लार्वा zebrafish इलाज लाइव लार्वा में आहार लिपिड प्रसंस्करण कल्पना, और लार्वा भोजन का सेवन यों की अनुमति देते हैं। सफलता सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान के कई महत्वपूर्ण कदम को दी जानी चाहिए। वाणिज्यिक चिकन अंडे भिन्न हो; संभावित परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए हम पिंजरे से मुक्त मुर्गियों कि ओमेगा -3 फैटी एसिड के लिए समृद्ध नहीं किया गया है से कार्बनिक अंडे पर सभी assays प्रदर्शन करते हैं। निचले खिला दरों विकासात्मक परिवर्तन है कि भोजन का सेवन (यानी, जबड़े या आंत कुरूपता, असमर्थता ठीक से तैरने के लिए) में बाधा के साथ अंतर्जात जर्दी ऊर्जा आपूर्ति, अस्वस्थ मछली, या मछली शेष के साथ DPF छोटी से 6 मछली में मनाया जा सकता है। क्योंकि लार्वा बहिर्जात भोजन की आवश्यकता नहीं है जब तक उनके अंतर्जात जर्दी दुकानों समाप्त हो रहे हैं और जर्दी कमी पाचन तंत्र के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है फार्बर प्रयोगशाला आम तौर पर 6-7 दिनों के बाद निषेचन (DPF) पर खिलाने के अध्ययन करता है। दूध पिलानेआरटी पर भी काफी है कि खाने के लार्वा की संख्या कम कर देता है। भोजन का सेवन और बाद के प्रयोगों के परिणाम उलझाना सकता भूखा में लार्वा की अनजाने में शामिल किए जाने के लिए स्क्रीन लार्वा करने में विफलता। इसके अतिरिक्त, यह प्रकाश से फ्लोरोसेंट लिपिड analogs, और सभी लार्वा नमूने analogs के साथ खिलाया, की रक्षा के लिए संभव है जब अधिकतम प्रतिदीप्ति, और इस तरह परख संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, भोजन का सेवन मापा जाएगा, तो चारा और चेस (पोस्ट-चारा चयापचय की अवधि) 4 घंटा की कुल से अधिक है, क्योंकि भोजन उत्सर्जित हो शुरू हो जाएगा अनुमति नहीं है। वर्तमान में, जिस दर पर भोजन और संबद्ध फ्लोरोसेंट लिपिड analogs उत्सर्जित कर रहे हैं अज्ञात है, लेकिन रोशनी कम से कम 2 दिनों के बाद फ़ीड (जेपीओ और सैफ अप्रकाशित डेटा) के लिए लार्वा पूरे शरीर में बच सकते हैं।

वहाँ संशोधित करने और प्रोटोकॉल का निवारण करने के लिए ब्याज की प्रयोगात्मक सवालों के जवाब देने के लिए कई तरीके हैं। लिपिड युक्त चारा टी के विभिन्न अवधियों के लिए किया जा सकता हैनाम: 1 घंटा एक छोटे से भोजन प्रदान करेगा, जबकि 4 घंटा लिपिड की एक बड़ी राशि के साथ आंत भरना होगा। हालांकि, लार्वा 6 घंटा से अधिक समय खिलाने की जर्दी के रूप में की सिफारिश नहीं है और ईएम बाँझ शर्तों और अंडे की जर्दी / सफेद पायस में बैक्टीरियल अतिवृद्धि में तैयार नहीं कर रहे हैं परिणाम उलझाना सकता है (यानी, वृद्धि की सूजन, आंतों बदल माइक्रोबायोटा प्रोफ़ाइल)। लार्वा फ़ीड लार्वा संक्षिप्त ठंडा या संज्ञाहरण द्वारा immobilized की तीव्र प्रभाव की जांच करने खिलाने के बाद तुरंत जांच की जा सकती है तेजी से rewarming के बाद फिर से तंग आ करने के लिए शुरू हो, लेकिन ठंडा लार्वा संज्ञाहरण पर वमन प्रदर्शन कर सकते हैं के रूप में स्थिरीकरण का बेहतर तरीका (एसएएफ अप्रकाशित अवलोकन) है। वैकल्पिक रूप से, चेस अवधि के परिवहन और अध्ययन करने से पहले आहार लिपिड चयापचय के लिए अनुमति देने के लिए फ़ीड के बाद बाहर किया जा सकता है। हालांकि फ़ीड आमतौर पर 5 मिलीलीटर liposome समाधान में किया जाता है, खिलाती सफलतापूर्वक 1 से 20 मिलीलीटर से लेकर मात्रा में आयोजित किया गया है। विभिन्न एकाग्रताअंडे की जर्दी के एस लार्वा फ़ीड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; फार्बर प्रयोगशाला नियमित तौर पर 5% अंडे की जर्दी (1 मिलीलीटर अंडे की जर्दी 19 मिलीलीटर ईएम को जोड़ा गया), 0.5% अंडे की जर्दी, और 10% अंडे की जर्दी के साथ प्रयोग करता है।

वहाँ फ्लोरोसेंट लिपिड analogs कि विचार किया जाना चाहिए की संभावित सीमाएं हैं। जब एक फ्लोरोसेंट लिपिड अनुरूप चुनने के लिए यह विचार करने के लिए कैसे लिपिड physiologically कार्रवाई की है और जहां फ्लोरोसेंट आधा भाग जब परिणाम की व्याख्या लिपिड की रासायनिक संरचना पर है महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, ट्राइग्लिसराइड्स नीचे मुक्त फैटी एसिड और ग्लिसरॉल, और कोलेस्ट्रॉल एस्टर में मुक्त कोलेस्ट्रॉल और फैटी एसिड में पूर्व के अवशोषण के लिए टूट रहे हैं, आंतों लुमेन में। इसलिए, एक फ्लोरोसेंट ट्राइग्लिसराइड या कोलेस्ट्रॉल एस्टर अनुरूप आहार में प्रदान की जाती है, तो प्रतिदीप्ति शरीर में मनाया फैटी एसिड, मुक्त कोलेस्ट्रॉल, या ग्लिसरॉल कि फ्लोरोसेंट आधा भाग के लिए है, न कि मूल ट्राइग्लिसराइड या कोलेस्ट्रॉल एस्टर जुड़ा हुआ है ट्रैक करेगा। विभिन्न fluorescenटी लिपिड analogs अद्वितीय सेलुलर संरचनाओं लेबल, और इस तथ्य चयन 3 के दौरान विचार किया जाना चाहिए। नोट के अलावा, देशी फैटी एसिड के चयापचय की तुलना में, एक BODIPY आधा भाग के अलावा मोटे तौर पर फैटी एसिड श्रृंखला लंबाई (एसएएफ अप्रकाशित डेटा) के लिए 2-3 कार्बन जोड़ने ~ के बराबर है।

तकनीक यहाँ वर्णित पिछले assays के क्षेत्र में वर्णित पर महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस चिकन अंडे की जर्दी फ़ीड के विकास से पहले, दो पांडुलिपियों विस्तृत अध्ययन है जिसमें लार्वा संचालित खिलाया गया पूरे उबले अंडे की जर्दी 4,23। तकनीक यहाँ वर्णित लाभ यह है कि अंडे की जर्दी अपनी तेजी से ऑक्सीकरण की वजह से कठोर उबले और उपयोग करने से पहले पाउडर और पाउडर कि अंडे की जर्दी एक बहुत ही कम आधा जीवन है होने की जरूरत नहीं है प्रस्तुत करता है। तरल अंडे की जर्दी भी liposomes है कि आसानी से कुशल आहार वितरण के लिए फ्लोरोसेंट लिपिड analogs स्वीकार रूप में तैयार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, radiolabeled लिपिड जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताआहार लिपिड चयापचय tigate और भोजन का सेवन को मापने, लेकिन फ्लोरोसेंट लिपिड analogs रेडियोधर्मिता के साथ जुड़े सुरक्षा खतरों मौजूद नहीं है। शोधकर्ताओं radiolabeled लिपिड का उपयोग करना चाहते हैं लेकिन अगर, फार्बर प्रयोगशाला, सत्यापित करने के लिए कि radiolabeled लिपिड में शामिल किया जा सकता है अध्ययन प्रदर्शन किया गया है, और सफलतापूर्वक के साथ खिलाया 19 liposomes। फ्लोरोसेंट लिपिड यहाँ वर्णित analogs चुना गया था क्योंकि वे अंतर्जात और radiolabeled लिपिड को अत्यधिक समान चयापचय दिखाने के लिए, और निम्न और उच्च शक्ति इमेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से उज्ज्वल थे।

इस तकनीक का लार्वा को फ्लोरोसेंट लिपिड analogs को खिलाने के लिए के विकास के पूर्ववर्ती, कोई अन्य तरीकों आहार लिपिड परिवहन और vivo में संचय कल्पना करने के लिए उपलब्ध थे। फ्लोरोसेंट लिपिड analogs के प्रत्यक्ष दृश्य इस तरह के सीरम लिपिड के रूप में शरीर विज्ञान के अप्रत्यक्ष उपायों का उपयोग कर एक से अधिक लाभ प्रदान कर सकते हैं। लार्वा zebrafish भोजन का सेवन का सही माप भी एक लंबे समय से स्टेशन थाक्षेत्र में चुनौती nding। केवल वैकल्पिक संस्कृति paramecia के लिए किया गया है, उनमें फ्लोरोसेंट lipophilic दरियाफ्त 4- (4- (didecylamino) styryl) के साथ लेबल - एन -methylpyridinium आयोडाइड (4-डि-10-एएसपी), लार्वा को खिलाने के लिए अनुमति देते हैं, और प्रतिदीप्ति उपाय एक प्लेट पाठक 24 के साथ अंतर पेट क्षेत्र। अंत में, इन तकनीकों दोनों मध्यम throughput स्क्रीन (यानी, आहार लिपिड प्रसंस्करण के आगे आनुवंशिक स्क्रीन) के साथ ही उच्च बढ़ाई ध्यान केंद्रित इमेजिंग अध्ययन के लिए लागू होने का फायदा है (यानी, आनुवंशिक, परिकल्पना संचालित अध्ययनों रिवर्स)। भविष्य में, इन तकनीकों phenotype के लिए लागू किया जा सकता है और zebrafish में चयापचय और सैनिक रोग की विभिन्न मॉडलों स्क्रीन।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

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References

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