Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S. i., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Environmental DNA (eDNA) in het aquatisch milieu verwijst naar genetisch materiaal gevonden in de waterkolom. Recente studies toonden het nut van eDNA voor het detecteren van vissen uit verschillende aquatische milieus, zoals vijvers 1-3, 4-8 rivieren, beken 9 en zeewater 10-14. De meeste van deze studies gericht op de detectie van een enkele of een paar invasieve 1,4-6,8,14 en zeldzame of bedreigde diersoorten 3,9, terwijl sommige recente studies geprobeerd simultane detectie van meerdere soorten in lokale vis gemeenschappen 7,9, 12,13,15 en mesokosmossen 11,12.

De laatste benadering wordt genoemd "metabarcoding" en eDNA metabarcoding maakt gebruik van één of meerdere sets van PCR-primers aan een gen regio coamplify over taxonomisch diverse monsters. Daarna volgt bibliotheek preparaat met indexering en toevoeging adapter en de geïndexeerde bibliotheken geanalyseerd door high-throughput parallel sequencingplatform. Onlangs Miya et al. 12 ontwikkelde universele PCR primers voor metabarcoding eDNA van vissen (genaamd "MiFish"). De MiFish primers richten op een hypervariabel gebied van het mitochondriale 12S rRNA-gen (163-185 bp), die voldoende informatie bevat om vissen te identificeren taxonomische familie, geslacht en soort met uitzondering van enkele nauw verwante soortgenoten. Met het gebruik van deze primers in eDNA metabarcoding, Miya et al. 12 ontdekt meer dan 230 subtropische mariene soorten van aquarium tanks met bekende soortensamenstelling en koraalriffen in de buurt van het aquarium.

Terwijl het optimaliseren van de metabarcoding protocol natuurlijk zeewater tegemoet met verschillende niveaus van eDNA concentratie van vissen, hebben we gemerkt dat de MiFish primers af en toe niet in geslaagd om het doelgebied voor de latere uitwerking bibliotheek te versterken. Een van de meest voorkomende reden hiervoor mislukte PCR amplificatie gebrek aan voldoende hoeveelheden van de template DNA in kleine hoeveelheden water gefilterd (dwz 1-2 L). Hoewel eDNA concentratie van een bepaalde taxonomische groep onkenbaar is voor de versterking, filtratie van grote volumes water (> 1-2 L) zou een eenvoudige en effectieve manier om meer eDNA te halen op het aquatisch milieu met schaarse vis overvloed en biomassa, zoals open oceaan en de diepzee-ecosystemen.

Ten opzichte schijf vezelfilters gewoonlijk in een aantal vissen eDNA onderzoek 16, filterpatronen het voordeel opvang grotere waterhoeveelheden voor verstopping 17. Eigenlijk, een recente studie toonde groot volume (> 20 L) filtratie van de kust zeewater monsters met behulp van filter cartridges 18. Bovendien worden zij afzonderlijk verpakt en steriel en verschillende stappen van de experimentele workflow kan worden uitgevoerd in het filterhuis, waardoor de kans op besmetting door het laboratorium 19 verminderen. Het laatsteeigenschap is essentieel voor eDNA metabarcoding, waarbij het risico van verontreiniging blijft een van de grootste uitdagingen experimentele 20,21. Ondanks deze technische voordelen van de filter cartridges, is deze nog niet gebruikt in eDNA studies van vissen met twee uitzonderingen 8,15.

Hier bieden we een protocol voor filtratie van watermonsters met het filterpatroon en extractie van eDNA uit de filter zonder opengesneden de behuizing. We bieden ook twee alternatieve waterfiltratie systemen afhankelijk van de waterstand volumes (≤4 L of> 4 L). Om de prestaties van de nieuw ontwikkelde protocol en een eerder gebruikte protocol met behulp van een glasvezel filter in onze onderzoeksgroep 12,14,22,23 vergelijken, we voeren eDNA metabarcoding analyse van zeewater uit een enorme aquarium tank (7.500 m 3 ) met bekende soortensamenstelling en tonen het aantal gedetecteerde species afgeleid van de twee protocollen als representatieve resultaten. Dit protocol hzoals ontwikkeld voor metabarcoding eDNA van vissen, maar ook voor eDNA uit andere organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Dit protocol heeft geen betrekking op water bemonstering en metabarcoding methoden. Water kan worden bemonsterd op verschillende manieren, afhankelijk van studiedoeleinden 16 en zie Miya et al. 12 voor meer informatie over de metabarcoding methoden waarbij MiFish primers. Merk op dat het monster erg koud water moet worden behandeld en gefiltreerd binnen enkele uren tot afbraak van eDNA voorkomen. Merk ook op dat dit protocol omvat het gebruik van een roterende schudder en een incubator, en deze moet groot genoeg zijn om de vroegere tegemoet te komen. Bovendien, een centrifuge die is geschikt zowel 15 ml en 50 ml conische buizen onontbeerlijk om de resterende vloeistof uit het filter na filtratie te verwijderen en aan geëxtraheerde DNA in de patroon verzamelen, respectievelijk.

1. Het verwerken van een schroefdop en een 1 L Plastic Bag

OPMERKING: Sla deze stap als de filtratie volume> 4 L.

  1. Boor een gat door het midden van een schroef cap (bevestigd aan een wegwerp 1 L plastic zak) met dezelfde diameter (4,8 mm) als de buis uitsteekt vanaf een mannelijke luer-lock connector. Diagonale tang inkorten buis van de mannelijke luer-lock connector op de juiste lengte (ca. 3 mm) om verstopping van een kleine hoeveelheid water in de dop na filtratie voorkomen.
  2. Breng een lijm gespecialiseerd voor polyethyleen (PE) en polypropyleen (PP), dat zowel de bodem en het oppervlak van het mannelijke Luer-vergrendelende verbindingsorgaan en schroefdop, respectievelijk. Wacht een paar minuten voor een goede verlijming (zie de instructies van de fabrikant).
  3. Steek de mannelijke luer-lock connector in het gat van de schroefdop. Wacht tot volledige verlijming van de twee delen (gewoonlijk> 24 uur). Steriliseren de schroefdop met de mannelijke luer-lock connector met 10% commercieel bleekmiddel (ca. 0,6% natriumhypochloriet) voor gebruik.
  4. Punch twee gaten aan de beide onderste hoeken van de 1 L plastic zak om het hangen van een mesh paneel (stap 3). Zorgen dat de diameter van de gaten groter is dan die van de pinnen van de mazen.

2. Montage van de Filtration System

  1. Attach hoog vacuüm slang aan de ingang van een aanzuigpomp en maak het andere uiteinde van de slang tot een verdeelstuk. Zorg ervoor dat de drie rode t-kleppen van het spruitstuk in de "uit-stand" (dwz, horizontaal).
  2. Het dragen van een schone set handschoenen, plaatst een vrouwelijke luer fitting en een vacuum connector aan de boven- en ondereinden van het vacuüm rubber slang voor filtratie, respectievelijk.
  3. Bevestig zorgvuldig de vrouwelijke luer fitting met een uitlaatpoort van de filterpatroon en bevestig de vacuum connector aan een silicone stopper.

3. Filtratie van watermonsters (≤4 L) met behulp van de Filter Cartridge

OPMERKING: Sla deze stap als de filtratie volume> 4 L. Deze filtratie-systeem vraagt ​​om een ​​op zichzelf staande panel fof opknoping de plastic zak gevuld met 1 liter water. Een mesh paneel, meerdere tanden en een standaard voor het panel, alle verkrijgbaar bij online winkels, zou nuttig zijn voor het samenstellen van dit toestel. Autoclaaf de inlaat en uitlaat Luer caps voor het filter voor gebruik.

  1. Giet de 1 L bemonsterde water in de plastic zak en sluit de schroefdop met de mannelijke luer-lock connector.
  2. Sluit zorgvuldig een inlaatpoort van de samengestelde filterpatroon met de mannelijke luer-lock connector van de plastic tas. Niet te strak de luer-lock connector; anders wordt het toestel zal lekken zodra het pompen begint. Zorg ervoor dat alle aansluitingen goed vastzitten voordat opknoping de plastic zak uit een mesh panel.
  3. hang voorzichtig de plastic zak met de filter cartridge uit twee tanden op de mazen en plaats een silicone stopper in een inlaatpoort van het spruitstuk.
  4. Schakel de afzuiger. Open de rode t-kleppen voor filtratie. Voer het verdeelstuk tot de filterpatroon droog, tduivin draai de rode t-klep naar de stand uit.
  5. Herhaal 3,1-3,4 stappen totdat de gewenste hoeveelheid water wordt gefilterd.
    OPMERKING: voor 1 liter water uit de subtropische koraalriffen, het duurt ongeveer drie minuten voor de filtratie.
  6. Verwijder voorzichtig het filter uit de plastic zak en het vacuüm connector.
  7. Cap beide uiteinden van de cassette met de inlaat en uitlaat luer caps.
  8. Label de cartridge en de inlaat Luer-dop op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen voor snel drogende en niet smerend labeling.
  9. Bewaar de filterpatroon bij -20 ° C voor DNA-extractie.

4. Filtratie van het Water (> 4 L) Monsters met behulp van de Filter Cartridge

Opmerking: Sla deze stap over als het water filtratie volume ≤4 L. filtratie-systeem vereist een 10 L boek fles voorzien van een klep en een wegwerp 10-ml pipet tip. Een binnendiameter van 10 ml pipetpunt (15,0 mm) en een tapsheid van de tipend moeten passen aan een buitendiameter van de klep (15,0 mm) en de inlaatpoort van de filterpatroon, respectievelijk. Beide aansluitingen goed vastgehouden tijdens het filtreren in een wrijvingspassing. Steriliseer de pipet tip met 10% commercieel bleekmiddel (ca. 0,6% natriumhypochloriet) voor gebruik.

  1. Breng de gewenste hoeveelheid bemonsterde water in de fles boek. Nauw plaats de 10 ml pipet tip in de klep van 10 L boek fles.
  2. Nauw plaats de uitlaatpoort van de filterpatroon in de pipetpunt uiteinde en steek de silicone stopper in de inlaatpoort van het verdeelstuk. Schakel de afzuiger. Open de rode t-kleppen voor filtratie. Voer het spruitstuk tot de filter cartridge droog is, zet de rode t-klep naar de stand uit.
    NB: Voor 10 liter zeewater uit de subtropische buitenste koraalriffen, het duurt ongeveer 30-40 min voor de filtratie.
  3. Verwijder voorzichtig het filter uit de plastic zak en het vacuüm connector. Cap beideuiteinden van de cartridge met de inlaat en uitlaat luer caps. Label de cartridge en de inlaat Luer-dop op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen voor snel drogende en niet smerend labeling. Bewaar de filterpatroon bij -20 ° C voor DNA-extractie.

5. Winning van eDNA van de Filter

NB: In de stappen 4 en 5, maken we gebruik van een commerciële kit, grotendeels naar aanleiding van een protocol voor "met kern bloed" die door de kit. Voor de eenvoud beschrijven we de procedure voor de behandeling van een individu cartridge. In de praktijk wordt aanbevolen verwerking 8 (of het maximum aantal centrifuge) of minder filters tegelijk.

  1. Verwarm een ​​incubator op 56 ° C.
  2. Bereid een 2,0 ml buis door het snijden van de scharnierende dop van de buis. Gooi de dop.
    OPMERKING: Deze buis wordt gebruikt als een verzamelbuis voor de resterende vloeistof in het filter.
  3. Verwijder de inlaat (NOT uitlaat) Luer-dop van de filter cartridge en plaats de inlaatpoort into de collectie buis. Goed af, een verbinding tussen de patroon en verzamelbuis met een zelfsluitende film.
  4. Plaats de samengevoegde eenheid in een centrifuge adapter voor een 15-ml conische buis. Centrifugeer de cartridge bij 5000 xg gedurende 1 min om de resterende vloeistof in het filter te verwijderen.
  5. Verwijder de collectie buis van de filter cartridge en gooi de buis. Re-cap de inlaatpoort van de patroon.
  6. Maak een mengsel van 20 pl proteïnase-K-oplossing, 220 ul PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, niet door de kit) en 200 gl buffer AL.
    LET OP: De filter cartridge biedt plaats aan maximaal vier keer de omvang van het mengsel (. Ca 1,8 ml).
  7. Verwijder de inlaat dop en voeg het mengsel (440 pi) in de filter cartridge met een pipet tip. Plaats de pipet volledig in de inlaatpoort zodat de pipetpunt is zichtbaar in de cassette juist boven het membraan.
  8. Re-cap de inlaatpoort en plaats het filter autocartridge op een roterende shaker.
  9. Plaats de roterende schudder in de voorverwarmde incubator bij 56 ° C en zet de schudder bij een snelheid van 20 rpm gedurende 20 min.
  10. Tijdens de incubatie, bereiden een nieuwe 2,0 ml buis, het etiket van de buis op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen en plaats deze in een 50 ml conische buis.
    OPMERKING: De eerste (2,0 ml) en tweede buizen (50 ml) worden gebruikt voor het verzamelen van het geëxtraheerde DNA en voor het vasthouden van de buis 2,0 ml, respectievelijk.
  11. Na de incubatie, verwijder de inlaat dop en plaats de inlaat (niet uitlaat) poort van de patroon in de buis 2,0 ml in de 50 ml conische buis. Sluit de 50 ml conische buis met een schroefdop.
  12. Centrifugeer de 50 ml conische buis bij 5000 xg gedurende 1 min naar het geëxtraheerde DNA uit de patroon verzamelen. Verwijder de filter cartridge en de 2,0 ml buis met behulp van gesteriliseerde pincet en de dop op de buis. Gooi de filter cartridge.

6. Zuivering van geëxtraheerd DNA

LET OP: We elueren eDNA met 100 ui buffer AE in plaats van 200 ul in de handleiding van de commerciële kit.

  1. Voeg 200 gl ethanol (96-100%) voor het geëxtraheerde DNA in 2,0 ml-buis van de bovenstaande stap (ongeveer 440 ui) en meng door vortexen.
  2. Pipet het mengsel in een spinkolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 1 min. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis.
  3. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis, voeg 500 ul buffer AW1 en centrifugeer gedurende 1 min bij 5000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis.
  4. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis, voeg 500 pl buffer AW2 en centrifugeer gedurende 3 min bij 20.000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis.
  5. Bereid een nieuwe 1,5 ml buis (niet door de kit) en label de buis met een geschikte waterdichte pen voor sneldrogende en niet smerend labeling. Transfer de spin kolom to de 1,5 ml buis.
  6. Elueer het DNA door het toevoegen van 100 pi buffer AE naar het midden van de spinkolom membraan. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min.
  7. Gooi de spin-kolom en de dop op de buis. Bewaar de gezuiverde DNA bij -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het is technisch moeilijk te isoleren en te kwantificeren alleen vis eDNA van de geëxtraheerde massa eDNA, omdat de MiFish primers coamplify het doelgebied van een aantal niet-vis gewervelde dieren, zoals vogels en zoogdieren, met PCR-producten van dezelfde grootte (ca. 170 bp ) 12. In plaats van het kwantificeren van vis eDNA, voeren we MiFish metabarcoding analyse van eDNA uit een aquarium tank met bekende soortensamenstelling met de twee verschillende methoden van filtratie en DNA-extractie, en het aantal gedetecteerde soorten per bibliotheek vergelijken van de twee protocollen. Deze eenvoudige experiment was bedoeld om de haalbaarheid van het huidige protocol te zien zijn als de "representatieve resultaten" en niet te rigoureus aan te tonen zijn superioriteit ten opzichte van anderen.

We proefden een totaal van 30 liter zeewater uit een Kuroshio tank in het Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japan (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). De Kuroshio tank is ontworpen voor het tentoonstellen van mariene megafauna, met afmetingen (L x B x D) van 35 mx 27 mx 10 m en een totale watervolume van 7.500 m 3. Het herbergt ongeveer 60 grote sized zeevissoorten kenmerkend voor gebieden rond de Kuroshio, een van de westelijke grens stromen northeastward over de gehele lengte van Japan. In een eerdere studie MiFish metabarcoding, Miya et al. 12 gedetecteerd 61 van de 63 soorten (97%) bevatte in de tank vijf 2 L zeewatermonsters.

Voor filtratie van het zeewater, gebruikten we filterpatronen (poriëngrootte = 0,45 pm) en glasvezel disk filters (poriëngrootte = 0,70 pm). We gelijktijdig gefilterd het zeewater op dezelfde verdeelstuk met de twee protocollen voor vier watervolumes (1, 2, 3 en 4 L, totaal acht filters). Na de filtratie van zeewater, we ook gefilterd 1 L uit PCR-grade water met de twee filters (fIlter cartridge en glasvezel filter) als de negatieve controles (twee filter spaties). In dergelijke filters, we hebben opgehaald eDNA met de nieuwe en voorheen gebruikte protocollen 12, die beide gebruik van dezelfde commerciële kit. Een totaal van 10 monsters eDNA (inclusief de twee negatieve controles) werden onderworpen aan analyse metabarcoding MiFish zoals beschreven in Miya et al. 12

In het kort, we uitgevoerd 1-round PCR om het doelgebied (mitochondriale 12S rRNA gen.; Ca 170 bp) te versterken en adapters voor gepaarde-end sequencing voegen. Voor acht eDNA monsters (met uitzondering van de twee negatieve controles), voerden we 10 PCR repliceert om variaties te zien in het aantal gedetecteerde soorten binnen elk monster (totaal 80 PCR). We hebben ook het filter en PCR blanks voor elke acht eDNA monsters (totaal 16 PCR). In totaal verkregen we 96 PCR producten van de 1e ronde PCR en ze werden gebruikt als matrijzen voor de 2de ronde PCR voor dubbele indexering en het toevoegen van extra adapters voor bibliotheek voorbereiding volgende Miya et al. 12

De gepaarde-end sequencing (2 x 150 bp) van de 96 bibliotheken leverde 4.127.546 leest, met een gemiddelde van 42.995 luidt per bibliotheek (40.539 leest het filterpatroon en 43.121 leest de glasvezelfiltertechnologie). Na demultiplexing en de daaropvolgende pre-processing van de ruwe data, leest 1.068.266 werden behouden voor de BLAST zoekopdrachten voor taxonomische opdracht. Hiervan leest, leest 830.788 geïdentificeerd als soorten die in de Kuroshio tank (Tabel 1). Detecteerden we 60 tank species van 830.788 leest en het gemiddelde aantal gedetecteerde molecuul van de 10 PCR repliceert de acht eDNA monsters varieerden van 29 tot 1 L (glasvezelfiltertechnologie) tot 55 voor 4 L (filterpatroon) (Tabel 1) . Lees aantallen van beide plano's uit de acht eDNA monsters waren klein, variërend van 0tot 12 voor de tank species.

We vonden dat het aantal gedetecteerde molecuul van het filterpatroon was significant hoger dan die van de glasvezelfilters (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001; Figuur 1) over 1-4 L zeewater volumes. Aantal gedetecteerde molecuul van het filterpatroon waren ongeveer 1,5 maal hoger dan die met de glasvezelfilters en in beide werkwijzen, het aantal gedetecteerde molecuul vermeerderd met de hoeveelheid water gefiltreerd (ANCOVA, F = 164,2, p <0,001).

Hogere aantallen gedetecteerde molecuul van het filterpatroon kan uit één of meer van de volgende stappen in de experimentele werkstromen: filtratie van de bemonsterde water door (1) verschillende materialen (hydrofiel PVDF [polyvinylidine difluoride] vs. glasmicrovezel) en / of (2) verschillende nominale poriegroottes (0,4581; m versus 0,70 um) in het filter cartridges en glasvezelfilters kon meer eDNA houden van vissen op het eerstgenoemde filter; (3) gebruik van een roterende schudder in de voorverwarmde incubator produceert meer DNA opbrengst van de filterpatronen dan uit de gevouwen glasvezelfilters in een spinkolom geplaatst op een onbeweeglijk verwarmingsblok; (4) het verzamelen van het geëxtraheerde DNA door centrifugatie van het filterpatroon is efficiënter dan die van de glasvezelfiltertechnologie vanwege verschillende filtermaterialen en / of verschillende centrifugatiewerkwijzen. Blijkbaar is een rigoureus opgezette studie nodig om de factoren die verantwoordelijk zijn voor de steeds hoger aantal gedetecteerde soorten door de filter cartridge in de huidige studie wijzen.

Figuur 1
Figuur 1: het aantal gedetecteerde Species uitgezet tegen gefilterd water volumes in MiFish Metabarcoding Ana lysis van eDNA van Kuroshio Tank, Okinawa Churaumi Aquarium. Het aantal gedetecteerde molecuul is beperkt tot de species in de tank. van 30 liter zeewater, we gefiltreerd 1, 2, 3 en 4 L monsters met de filterpatronen en glasvezelfilters en geëxtraheerd eDNA van die filters met de huidige en eerder beschreven protocollen 12, respectievelijk. We voerden MiFish metabarcoding analyse (simultane detectie van meerdere soorten) gedurende 10 PCR repliceert van de vier volumes water met behulp van twee protocollen. De horizontale balk in het vak staat voor de mediaan; de bovenste en onderste randen van de doos overeen met inter-kwartielen, de verticale balken komen overeen met 1,5 x kwartielen, en de puntjes vertegenwoordigen uitschieters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
Tabel 1:.. Taxonomische samenstelling en lezen Nummers van de 60 soorten ontdekt in MiSeq Analyses van eDNA Monsters van de Kuroshio Tank Alleen die soorten in de tank met verwijzing sequenties in de aangepaste database worden getoond Klik hier om een grotere versie te bekijken deze tafel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In veel metabarcoding studies met behulp van milieu monsters zoals water en bodem, post-filtratie behandeling van de filter cartridge is over het algemeen als volgt 24,25: 1) opensnijden of kraken van de behuizing met handgereedschap (slang mes of een tang); 2) verwijdering van het filter uit de patroon; en 3) het snijden van de filter in kleine stukjes met een scheermesje voor DNA-extractie. Om dergelijke omslachtige en tijdrovende procedures die gevoelig zijn voor besmetting in het laboratorium zijn, hebben we geprobeerd verschillende DNA-extractie methoden die in de behuizing van de filter cartridge te voorkomen met behulp van een veel gebruikte, goedkope commerciële kit, en met succes het huidige protocol ontwikkeld met gunstige resultaten van eDNA metabarcoding analyse (Figuur 1).

Een van de meest kritische stappen in dit protocol is het gebruik van een roterende schudinrichting in een voorverwarmde incubator, dat kan bieden goede DNA opbrengst voor verdere bibliotheek preparatie in de eDNA metabarcoding analyse. Constant roeren van de proteïnase-K-oplossing binnen het huis bij optimale temperatuur vergemakkelijkt waarschijnlijk DNA-extractie van deeltjes gevangen op het filter. Merk echter op dat dit protocol omvat het gebruik van zowel een roterende schudder en een incubator, en deze moeten kunnen de eerstgenoemde plaats. Bovendien, een centrifuge die is geschikt zowel 15 ml en 50 ml conische buizen onontbeerlijk voor het verwijderen van de overgebleven vloeistof na filtratie filter en het verzamelen geëxtraheerde DNA in de patroon respectievelijk.

Er is een andere optie om dergelijke DNA-extractie te bereiken zonder te hoeven opengesneden de cartridge (zie tabel of Materials / reagentia). De kit bevat geen enzymen voor DNA-extractie gebruikt; in plaats daarvan gebruikt het een speciale lysis buffer in combinatie met extra mechanische lysis met kralen slaan. In voorlopige experimenten op basis van natuurlijke zeewater uit de gematigde kust Stille Oceaan, we attempted DNA extracties met behulp van deze kit samen met een prototype van het huidige protocol met behulp van de commerciële kit. Met het gebruik van deze prototype protocol, we consequent erkend verschillende amplificatieproducten bij gelelektroforese voor de 1e ronde PCR. Daarentegen we geen enkel PCR-producten verkregen met behulp van een ander pakket (zie Materialen / Reagentia tabel) ondanks twee volgende alternatieve protocollen van de fabrikant. Aangezien PCR stappen Remmerverwijderingsbuffer zijn opgenomen in de twee protocollen van de tweede set (zie Materialen / Reagentia tabel), deze waarneming suggereert het ontbreken van voldoende hoeveelheden DNA in de matrijs. Dergelijke relatief lage DNA opbrengsten van milieubelastingen monsters met behulp van de tweede set worden gerapporteerd in recente studies 26,27.

In het huidige protocol, hebben we gekozen voor het filter met grote nominale poriegrootte (0,45 pm), terwijl de microbiële studies conventionally gebruik kleinere (0,22 urn) na voorfiltratie tot grotere poriegrootte filters (1-3 pm) 28. De redenen van onze keuze zijn eenvoudig en ongecompliceerd en zijn niet gebaseerd op theoretische argumenten: 1) de poriegrootte veel dichter bij die van de glasvezelfilters (0,70 pm) we gewoonlijk in eerdere studies eDNA 12,14, 22,23; 2) wordt verwacht om grotere hoeveelheden water te filteren dan de kleinere. De laatste functie is vooral belangrijk voor onze lopende onderzoeksprojecten ondergaan in de open oceaan en de diepzee-ecosystemen met schaarse vis overvloed en biomassa. In feite bevestigden we succesvol filtratie van een onafhankelijk bemonsterde 10-liter zeewater uit de Kuroshio tank zonder merkbare verstopping (resultaten niet getoond). Onlangs echter, Turner et al. 29 toonde aan dat 0,2 urn filtratie gemaximaliseerd karper eDNA capture (85% ± 6%), terwijl het minimaliseren van de totale (dwz non-target) eDNAcapture (48% ± 3%), maar verstopping beperkt deze poriegrootte een monstervolume van minder dan 250 ml. Bijkomende studies zijn nodig om de optimale filter poriegrootte en waterfiltratie volume van de filter cartridge voor eDNA metabarcoding in diverse soorten van aquatische omgevingen met verschillende niveaus van vis overvloed en biomassa te bepalen.

Een van de beperkingen van het protocol is dat het water filtratie worden uitgevoerd in het laboratorium waar een voeding beschikbaar is. Vanwege de beperkte chemische stabiliteit van DNA, eDNA begint zodra achteruit wanneer vergoten uit een organisme en detecteerbaar slechts voor een korte tijd in aquatische milieus (uren tot dagen) 30. Daarom is het ideaal om het watermonster meteen filteren na het verzamelen om aanzienlijke achteruitgang van eDNA voorkomen. In dit verband zou de ontwikkeling van de aanwezige filtratie methoden waarbij de filterpatroon een veelbelovende volgende stap. De draagbaarheid en sterility van de filterpatroon in staat de ontwikkeling van de on-site filtratie-methoden, die meer intact eDNA dat de soortensamenstelling van de visgemeenschap nauwkeuriger Edna metabarcoding kunnen reflecteren zal bieden. De verzamelde eDNA op de filterpatronen worden gestabiliseerd door de injectie van een commercieel reagens 31 (zie Materialen / Reagentia Table) of Longmire buffer 32 in de cartridge alvorens terug naar het laboratorium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10 ml pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10 L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
  19. Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. Springer. 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. Springer. 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics