तैयारी और

Chemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल की तैयारी और एक dendrimeric चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) विपरीत एजेंट Cyclen आधारित मैक्रोसाईक्लिक समचुंबक gadolinium आयनों समन्वय chelates किया जाता है कि के लक्षण वर्णन का वर्णन है। इन विट्रो में एमआरआई प्रयोगों की एक श्रृंखला में, इस एजेंट एक प्रवर्धित एमआरआई संकेत उत्पादित जब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध monomeric एनालॉग की तुलना में।

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Gündüz, S., Savić, T., Toljić, Đ., Angelovski, G. Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54776, doi:10.3791/54776 (2016).

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Abstract

gadolinium (तृतीय) अचक्रीय या मैक्रोसाईक्लिक chelates के साथ की समचुंबक परिसरों चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल विपरीत एजेंट (सीए) कर रहे हैं। उनका उद्देश्य, ऊतक में पानी प्रोटॉन की छूट दर को बढ़ाने के लिए इस प्रकार एमआर छवि के विपरीत और एमआरआई माप की विशिष्टता बढ़ रही है। वर्तमान चिकित्सकीय अनुमोदित विपरीत एजेंटों कम आणविक भार अणुओं है कि तेजी से शरीर से मंजूरी दे दी हो रहे हैं। समचुंबक chelators के वाहक के रूप में dendrimers का उपयोग अधिक कुशल एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों के भविष्य के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। विशेष रूप से, एक उच्च संकेत विपरीत में समचुंबक प्रजातियों के परिणामों की स्थानीय एकाग्रता में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, इस सीए एक लंबी ऊतक प्रतिधारण इसकी उच्च आणविक वजन और आकार के कारण समय प्रदान करता है। यहाँ, हम macromolecular एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों पाली (amidoamine) पर आधारित (PAMAM) monomacro साथ dendrimers की तैयारी के लिए एक सुविधाजनक प्रक्रिया का प्रदर्शनचक्रीय DOTA प्रकार chelators (DotA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate)। chelating इकाई Thiourea पुलों के लिए फार्म PAMAM डेनड्रीमर के अमाइन सतह समूहों की ओर आइसोथियोसाइनेट (NCS) समूह की जेट शोषण से संलग्न किया गया था। Dendrimeric उत्पादों शुद्ध और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और मौलिक विश्लेषण के माध्यम से विश्लेषण किया गया। अंत में, उच्च संकल्प एमआर छवियों दर्ज किए गए और संकेत तैयार dendrimeric और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध monomeric एजेंटों से प्राप्त विरोधाभासों की तुलना में थे।

Introduction

चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) अपने noninvasive प्रकृति और उत्कृष्ट आंतरिक नरम ऊतक विपरीत होने के कारण एक शक्तिशाली और गैर ionizing इमेजिंग व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान और नैदानिक ​​निदान में इस्तेमाल तकनीक है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया एमआरआई तरीकों संकेत पानी प्रोटॉन से प्राप्त का उपयोग, पानी संकेतों के घनत्व में अंतर के आधार पर ऊतकों के भीतर उच्च संकल्प छवियों और विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं। संकेत तीव्रता और एमआरआई प्रयोगों की विशिष्टता आगे विपरीत एजेंट (सीए) का उपयोग कर सुधार किया जा सकता है। ये समचुंबक या superparamagnetic प्रजाति है कि अनुदैर्ध्य (टी 1) और अनुप्रस्थ को प्रभावित (टी 2) छूट बार क्रमश: 1,2 हैं।

Polyamino polycarboxylic एसिड ligands के साथ lanthanide आयन gadolinium के परिसरों सबसे अधिक इस्तेमाल टी 1 सीए कर रहे हैं। Gadolinium (तृतीय) को छोटा टी 1 छूटपानी प्रोटॉनों के समय, इस प्रकार एमआरआई प्रयोगों 3 में संकेत विपरीत बढ़ रही है। हालांकि, आयनिक gadolinium विषैला होता है; इसका आकार (द्वितीय) कैल्शियम की है कि अनुमान लगाती है, और इसे गंभीरता से कैल्शियम की मदद से कोशिकाओं में संकेत प्रभावित करता है। इसलिए, अचक्रीय और मैक्रोसाईक्लिक chelates इस विषाक्तता को बेअसर करने के लिए कार्यरत हैं। विभिन्न multidentate ligands अब तक विकसित किया गया है, उच्च thermodynamic स्थिरता और गतिज जड़ता 1 के साथ gadolinium (तृतीय) परिसरों में जिसके परिणामस्वरूप। 12-अंग का azamacrocycle Cyclen उन पर आधारित, विशेष रूप से अपने tetracarboxylic व्युत्पन्न DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate) में इस CA वर्ग के सबसे जांच की और लागू परिसरों हैं।

फिर भी, GdDOTA प्रकार सीए इतनी कम विपरीत दक्षता और तेजी से गुर्दे उत्सर्जन के रूप में कम आणविक भार प्रणाली, कुछ नुकसान प्रदर्शित कर रहे हैं। Macromolecular और multivalent सीए इन 4 की समस्याओं के लिए एक अच्छा समाधान हो सकता है। सीए biodistribu के बादtion मुख्य रूप से उनके आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है, macromolecular सीए ऊतकों के भीतर बहुत लंबे समय तक प्रतिधारण बार प्रदर्शित करते हैं। समान रूप से महत्वपूर्ण, monomeric एमआर जांच (जैसे, GdDOTA जटिल), काफी हद तक हासिल कर ली एमआर संकेत और माप गुणवत्ता में सुधार लाने का एक बढ़ा स्थानीय एकाग्रता में इन एजेंटों परिणामों के multivalency।

डेनड्रीमर एमआरआई 4,5 के लिए multivalent सीए की तैयारी के लिए सबसे पसंदीदा scaffolds के बीच में हैं। अच्छी तरह से परिभाषित आकार के साथ ये अत्यधिक branched अणुओं उनकी सतह पर विभिन्न युग्मन प्रतिक्रियाओं से ग्रस्त हैं। इस काम में, हम तैयारी, शुद्धि, और एमआरआई के लिए एक dendrimeric सीए एक पीढ़ी 4 (जी -4) पाली (amidoamine) (PAMAM) डेनड्रीमर GdDOTA-तरह chelates (डीसीए) के लिए मिलकर से मिलकर के लक्षण वर्णन की रिपोर्ट। हम प्रतिक्रियाशील DOTA व्युत्पन्न के संश्लेषण और PAMAM डेनड्रीमर के लिए अपनी युग्मन का वर्णन है। जी.डी. (तृतीय), मानक भौतिक लक्षण वर्णन के साथ complexation पर proceduडीसीए की फिर से प्रदर्शन किया गया था। अंत में, एमआरआई प्रयोगों डीसीए की क्षमता एमआर छवियों कम आणविक भार सीए से प्राप्त उन लोगों की तुलना में मजबूत विपरीत के साथ उत्पादन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया गया।

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Protocol

1. डीसीए की तैयारी

  1. Monomeric इकाई 4 से 6 के संश्लेषण।
    1. 4- (4-nitrophenyl) के संश्लेषण -2 (4,7,10-tris- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-YL) butyric एसिड tert -butyl एस्टर (2)।
      1. (4,7-bis- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-YL) -acetic एसिड tert -butyl एस्टर 1 (1.00 जी, 1.94 mmol) एन में, एन -dimethylformamide भंग ( DMF, 5 मिलीलीटर), पोटेशियम कार्बोनेट जोड़ने (0.67 जी, 4.86 mmol, 2.5 equiv।) और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण हलचल।
        नोट: macrocycle 1 Cyclen से तैयार किया गया था और tert पहले प्रकाशित प्रक्रिया 7 के अनुसार bromoacetate -butyl।
      2. Tert जोड़े -butyl-2-ब्रोमो-4- (4-nitrophenyl) butanoate (0.87 जी, 2.53 mmol, 1.3 equiv।) Portionwise 1 घंटा से अधिक। टी के तहत मिश्रण सरगर्मी जारीनिम्नलिखित 18 घंटे के लिए वह एक ही प्रतिक्रिया की स्थिति।
        नोट: Tert -butyl-2-ब्रोमो-4- (4-nitrophenyl) butanoate 4- (4-nitrophenyl) -butyric एसिड, thionyl क्लोराइड, और ब्रोमीन से पहले प्रकाशित प्रक्रिया 8 के अनुसार तैयार किया गया था।
      3. 40-60 डिग्री सेल्सियस 9 में बल्ब करने वाली बल्ब निर्वात आसवन के माध्यम से DMF निकालें।
      4. कॉलम क्रोमैटोग्राफी (सिलिका जेल, 7% मेथनॉल / क्लोराइड) द्वारा अवशेषों एक भूरे रंग के अनाकार ठोस (1.09 जी, 72%) 10 के रूप में उत्पाद 2 को प्राप्त करने के लिए शुद्ध।
    2. 4- (4-aminophenyl) के संश्लेषण -2 (4,7,10-tris- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-YL) butyric एसिड tert -butyl एस्टर (3)।
      1. Nitrobenzene व्युत्पन्न 2 (1.00 जी, 1.28 mmol) इथेनॉल में (10 एमएल) और मेथनॉल (150 μl) में 7 एन अमोनिया समाधान भंग। soluti के लिए एक उत्प्रेरक (पीडी / सी, 150 एमजी, 15 भार%) के रूप में सक्रिय कार्बन पर पैलेडियम जोड़ेपर।
      2. एक प्रकार की मछली Hydrogenator तंत्र में एक हाइड्रोजन वातावरण (2.5 बार) के तहत 16 घंटे के लिए विषम मिश्रण हिला।
      3. इथेनॉल में यह निलंबित और एक sintered कांच कीप के माध्यम से निलंबन को छान कर diatomaceous पृथ्वी का एक केक तैयार है। निस्पंदन द्वारा पीडी / सी उत्प्रेरक को दूर करने के लिए तैयार केक पर 1.1.2.2 से निलंबन डालो।
      4. एक भूरे रंग के अनाकार ठोस (0.91 जी, 95%) के रूप में यौगिक 3 प्राप्त करने के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण (नहाने के पानी के तापमान ~ 40 डिग्री सेल्सियस) पर कोमल आसवन द्वारा विलायक निकालें।
    3. 4- (4-isothiocyanatophenyl) के संश्लेषण -2 (4,7,10-tris- tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-YL) butyric एसिड tert -butyl एस्टर (4)।
      1. thiophosgene (0.124 मिलीग्राम, 1.58 mmol, 1.3 equiv।) 3 का एक मिश्रण (0.91 जी, 1.22 mmol) और triethylamine को क्लोराइड में (0.685 मिलीग्राम, 4.87 mmol, 4 equiv।) (15 एमएल) जोड़ें।
      2. सख्ती प्रतिक्रिया एम आई हलचल16 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक चुंबकीय उत्तेजक साथ xture।
      3. एक रोटरी बाष्पीकरण (नहाने के पानी के तापमान ~ 40 डिग्री सेल्सियस) पर कोमल आसवन द्वारा विलायक निकालें, और फिर कॉलम क्रोमैटोग्राफी (सिलिका जेल, 5% मेथनॉल / क्लोराइड) द्वारा कच्चे तेल उत्पाद शुद्ध एक हल्के भूरे रंग अनाकार ठोस रूप में उत्पाद प्राप्त करने के लिए 4 (0.51 जी, 53%)।
  2. डेनड्रीमर डीसीए के संश्लेषण।
    1. डेनड्रीमर 5 के संश्लेषण।
      1. जी -4-PAMAM डेनड्रीमर (667 एमजी, मेथनॉल में 10% डेनड्रीमर समाधान, 4.67 μmol) ले लो, एक रोटरी बाष्पीकरण पर कोमल आसवन द्वारा मेथनॉल लुप्त हो जाना (नहाने के पानी के तापमान ~ 40 डिग्री सेल्सियस), और DMF में छाछ भंग (4 एमएल) ।
      2. Triethylamine जोड़ें (0.105 मिलीग्राम, 0.75 mmol, 160 equiv।), 60 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए हलचल, और जोड़ने आइसोथियोसाइनेट 4 (354 एमजी, 0.45 mmol, 1.5 equiv। डेनड्रीमर के अमीनो सतह समूहों के सापेक्ष) portionwise oveआर 1 घंटा।
      3. 48 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ।
      4. 40-60 डिग्री सेल्सियस पर बल्ब करने वाली बल्ब निर्वात आसवन के माध्यम से विलायक निकालें।
      5. एक lipophilic जेल निस्पंदन मध्यम और eluent के रूप में मेथनॉल का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों शुद्ध। स्तंभ पैक करने के लिए, दबाव लागू करने के बिना कमरे के तापमान (> पाउडर का 1 ग्राम प्रति मेथनॉल के 4 मिलीलीटर) में कम से कम 3 घंटे के लिए मेथनॉल में छानने का काम मीडिया प्रफुल्लित। 1 मिलीलीटर अंशों को इकट्ठा करके गुरुत्वाकर्षण जुदाई प्रदर्शन करना।
      6. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) के साथ एकत्र भिन्न विश्लेषण। 15% मेथनॉल / क्लोराइड में टीएलसी प्लेट (केवल सबसे ध्रुवीय बेस लाइन पर स्थित घटनास्थल dendrimeric उत्पाद से प्राप्त होता है) का विकास करना। उत्पाद 5 (270 एमजी, 91%) प्राप्त करने के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण (नहाने के पानी के तापमान ~ 40 डिग्री सेल्सियस) पर कोमल आसवन द्वारा एकत्र भिन्न लुप्त हो जाना।
    2. डेनड्रीमर के संश्लेषण
    3. फार्मिक एसिड (5 एमएल) में संरक्षित dendrimeric chelator 5 (270 एमजी, 4.23 μmol) को भंग करने और 24 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हलचल।
    4. एक रोटरी बाष्पीकरण (~ 15 मिलीबार दबाव, नहाने के पानी के तापमान ~ 40 डिग्री सेल्सियस) पर आसवन द्वारा फार्मिक एसिड लुप्त हो जाना और फ्रीज सूखे उत्पाद देने के लिए 6 (दबाव ~ 0.2 मिलीबार) 9।
  3. Dendrimeric विपरीत एजेंट के संश्लेषण (डीसीए)
    1. पानी में dendrimeric chelator 6 (4.35 μmol) को भंग करने और 0.1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें।
    2. पानी (1 मिलीलीटर) में GdCl 3 · 6H 2 ओ (113 मिलीग्राम, 304 μmol) को भंग करने और जोड़ने के लिए यह 4 घंटा की अवधि में chelator 6 के समाधान के लिए dropwise; जलीय सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (0.05 एम) एक पीएच मीटर के साथ पीएच को मापने के द्वारा के साथ 7.0 पर पीएच बनाए रखें।
    3. कमरे टी में एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ मिश्रण हिलाओ24 घंटे के लिए emperature।
    4. 4 घंटा से अधिक समाधान portionwise को ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, 158 मिलीग्राम, 426 μmol) जोड़ें जी.डी. से अधिक दूर करने के लिए (तृतीय) जबकि जलीय सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (0.05 एम) के साथ 7.0 पीएच को बनाए रखने। 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण हिलाओ।
    5. GdEDTA का बहुमत है और EDTA से अधिक दूर करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन करना। स्तंभ पैक करने के लिए एक हाइड्रोफिलिक जेल निस्पंदन मध्यम पानी में सूजन का प्रयोग करें। एक उपयुक्त मात्रा के मिश्रण को कम करने और कॉलम लोड। दबाव लागू किए बिना विआयनीकृत पानी के साथ स्तंभ Elute।
    6. केन्द्रापसारक बल 1,800 XG पर 30 मिनट के लिए एक 3 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग कर GdEDTA और EDTA के अवशेषों को हटाने के लिए नमूना अपकेंद्रित्र। इस कदम (करीब पांच बार) दोहराएँ जब तक छानना EDTA और GdEDTA के अभाव से पता चलता है। एक फ्लास्क में नमूना हस्तांतरण, यह लुप्त हो जाना, और फिर फ्रीज सूखे विलायक अंतिम डीसीए के रूप में एक सफेद उत्पाद प्राप्त करने के लिए (186 एमजी, 71%)।
      ध्यान दें: ईएसआई एमएस के माध्यम से EDTA और GdEDTA के अभाव की जाँच करें।
    7. एक नि: शुल्क आयन xylenol नारंगी परीक्षण का उपयोग कर के रूप में जी.डी. (तृतीय) की अनुपस्थिति की पुष्टि करें। एक एसीटेट बफर समाधान (पीएच 5.8) में छानना (0.5 एमएल) भंग। एक xylenol नारंगी समाधान की कुछ बूँदें जोड़ें और रंग परिवर्तन ट्रैक 11 (पीले या बैंगनी रंग अभाव या मुफ्त जी.डी. (तृतीय) के घोल में आयनों, क्रमशः की उपस्थिति इंगित करता है)।

2. इन विट्रो Dendrimeric उत्पाद की विशेषता

  1. मैक्रोसाईक्लिक DOTA इकाइयों (DotA की तरह macrocycles साथ डेनड्रीमर की लोडिंग) PAMAM डेनड्रीमर करने के लिए मिलकर की संख्या का आकलन
    1. 1 एच एनएमआर (- परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी एनएमआर) के साथ आकलन।
      नोट: यह प्रक्रिया dendrimers 5 और 6 पर संभव है, लेकिन डीसीए पर नहीं।
      1. 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम 12 रिकॉर्ड।
      2. खुशबूदार क्षेत्र और दो अलग अलग स्निग्ध क्षेत्रों (1. स्निग्ध डेनड्रीमर और मैक्रोसाईक्लिक प्रोटॉनों के संकेतों, 2. टी -Bu समूहों के संकेतों) एकीकृत या dendrimers 5 और 6 के लिए सिर्फ एक स्निग्ध क्षेत्र, क्रमशः।
        नोट: कोई अलग संकेत स्निग्ध क्षेत्र टी -Bu समूहों से उत्पन्न में डेनड्रीमर 6 में जब से वे hydrolyzed दिया है नहीं है।
      3. Eq का प्रयोग करें। 1 या EQ। 2 मैक्रोसाईक्लिक इकाइयों की संख्या (एन), जहां आर integrals के अनुपात = अनुमान लगाने के लिए (स्निग्ध / Eq। 1 या स्निग्ध-डेनड्रीमर में खुशबूदार / aliphatic- Eq में टी बू। 2), एच dend = प्रोटॉनों की संख्या डेनड्रीमर में, एच आर = खुशबूदार प्रोटॉनों की संख्या, एच टी बू = टी -Bu समूहों में प्रोटॉनों की संख्या, और एच मैक एक macrocycle में प्रोटॉन की संख्या =।
        नोट: या तो Eq। 1 या EQ। 2 के लिए इस्तेमाल किया जा सकताआर डेनड्रीमर 5, जबकि केवल Eq। 1 डेनड्रीमर 6 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि विनिमेय प्रोटॉन (amines, amides, thioureas, या carboxylates पर) आम तौर पर ड्यूटेरियम के साथ प्रतिस्थापित किया जा रहा है, वे गणना में ग्रहण नहीं कर रहे थे। इधर, एच dend = 1,128 (5) या 1000 (6), एच आर = 4, और एच मैक = 27 इस्तेमाल किया गया।
        1 समीकरण (1)
        2 समीकरण (2)
    2. सल्फर के लिए नाइट्रोजन के अनुपात का उपयोग करके मौलिक विश्लेषण से आकलन।
      1. ठोस dendrimeric नमूना (इस काम में डीसीए) पर मौलिक विश्लेषण करते हैं।
      2. Eq का प्रयोग करें। 3 मैक्रोसाईक्लिक इकाइयों की संख्या (एन), जहां आर चुना गया% और एन% एस, एन dend या एस dend के अनुपात = = की संख्या का अनुमाननाइट्रोजन या डेनड्रीमर में सल्फर परमाणुओं, और एन मैक या मैक एक मैक्रोसाईक्लिक इकाई में नाइट्रोजन या सल्फर परमाणुओं की संख्या =।
        नोट: कारक 2.29 सल्फर और नाइट्रोजन के परमाणु जनता में अनुपात से प्राप्त की है। इस काम में, एन dend = 250, एस dend = 2, एन मैक = 5, और मैक = 1 इस्तेमाल किया गया।
        3 समीकरण (3)
    3. उड़ान के मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय (MALDI-TOF) के साथ आकलन।
      1. MALDI-TOF एमएस विश्लेषण 13 प्रदर्शन करना।
      2. मैक्रोसाईक्लिक इकाइयों की संख्या (एन) Eq के अनुसार गणना। 4, जहां एम जेड = मनाया द्रव्यमान (M / Z), जेड = प्रजातियों के प्रभारी, एम dend = dendrimeric भाग के लिए बड़े पैमाने पर, और एम मैक = एक मैक्रोसाईक्लिक इकाई की बड़े पैमाने पर।
        नहींते: M dend = 14,306 और एम मैक = 719 इस काम में इस्तेमाल किया गया।
        4 समीकरण (4)
  2. डीसीए एकाग्रता ([डीसीए]) का निर्धारण: थोक चुंबकीय संवेदनशीलता माप (बीएमएस)
    1. एक प्लास्टिक की शीशी ट्यूब ([डीसीए] ~ 5-10 मिमी) में पानी (360 μl) में डीसीए (5-10 मिलीग्राम) भंग।
      नोट: [डीसीए] δ = 4.7 पीपीएम पर नमूना सांद्रता> 15 मिमी पर टी BuOH अनुनादों संभव ओवरलैप से बचने के लिए, पानी की गूंज के साथ 5-10 मिमी की सीमा में होना चाहिए।
    2. डीसीए के जलीय समाधान के लिए: (1 वी / वी 2) और परिणामस्वरूप समाधान (420 μl) एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर मिश्रण: डी 2 ओ के 60 μl जोड़े टी BuOH मिश्रण।
    3. एक बाहरी एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरण नमूना के 400 μl और एक समाक्षीय एनएमआर डालने ट्यूब जगह एक टी BuOH साथ: एच 2 ओ मिश्रण (10:90 वी / वी) नमूना ट्यूब में।
    4. अभिलेख1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम और भीतरी और बाहरी एनएमआर ट्यूब (संदर्भ) 12 में BuOH टी से पाने गूंज संकेतों के बीच आवृत्ति परिवर्तन को मापने।
    5. Eq का प्रयोग करें। 5 निर्धारित करने के लिए [डीसीए], जहां टी = पूर्ण तापमान, Δχ दर्ज की पारी =, eff = प्रभावी चुंबकीय एक lanthanide आयन के लिए जी.डी. (तृतीय) 14, और एस = एक निरंतर निर्भर लिए पल eff = 7.94 μ नमूने का आकार और चुंबकीय क्षेत्र (0, 1/3, और एक क्षेत्र, करने के लिए सिलेंडर समानांतर, और चुंबकीय क्षेत्र को सीधा सिलेंडर के मामले में 1/6, क्रमशः) में अपनी स्थिति पर।
      नोट: BuOH समाधान (60 μl) टी: के लिए [डीसीए] प्राप्त मूल्य की गणना डी ओ 2 के अलावा के कारण मूल एकाग्रता के लिए सही किया जाना चाहिए।
      5 समीकरण (5)
  3. गतिशील प्रकाशबिखरने (DLS) माप।
    1. (0.2 माइक्रोन polytetrafluorethylene / PTFE फिल्टर, जी.डी. प्रति 0.75 मिमी (तृतीय)) एक फ़िल्टर डीसीए समाधान तैयार 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) बफर में (25 मिमी, 7.4 पीएच) और यह एक में स्थानांतरित DLS माप के लिए क्युवेट।
    2. क्युवेट डीएलएस तंत्र में रखें और निम्नलिखित मानकों सेट: रिकॉर्डिंग करने के लिए 15 स्कैन (1 स्कैन = 12 सेकंड, अपवर्तनांक = 1.345, अवशोषण = 1%) के 5 repetitions स्कैन के बीच और तापमान संतुलन के साथ में देरी के बिना 30 सेकंड से पहले ।
    3. अधिग्रहीत डेटा निर्यात और आकार (hydrodynamic व्यास) के एक समारोह के रूप में आबादी (%) की साजिश रचने के आकार के वितरण हिस्टोग्राम प्राप्त करते हैं।
  4. अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ relaxivities के मापन।
    ध्यान दें: एक इसी तरह की प्रक्रिया पहले से ही विश्राम का समय विश्लेषक 15 का उपयोग वर्णित किया गया था; इस प्रक्रिया Topspin के साथ एक 300 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर उपयोग किया गया थासॉफ्टवेयर।
    1. एच में डीसीए समाधान 2 ओ का एक सेट तैयार: डी 2 ओ (500 μl, 10% डी 2 ओ एच 2 ओ में, [डीसीए] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, और 5.0 मिमी, [HEPES ] डीसीए शेयर नमूना से = 25 मिमी) (खंड 2.2 देखें)।
    2. एक एनएमआर ट्यूब में समाधान के 450 μl स्थानांतरण और साधन में जगह।
    3. अधिग्रहण के मापदंडों का अनुकूलन (90 ° उत्तेजना पल्स अवधि (P1), और विकिरण आवृत्ति ऑफसेट (हे 1)) और फिर टी प्रदर्शन 1 और 2 टी उलटा वसूली (आईआर) और कार परसेल-Meiboom-गिल का उपयोग कर प्रयोगों (CPMG ) नाड़ी दृश्यों, क्रमशः।
    4. टी 1 और 2 टी छूट बार का निर्धारण।
      1. दर्ज की माप, प्रक्रिया F2 आयाम में 2 डी स्पेक्ट्रम का चयन करें, और इंटरैक्टिव चरण सुधार प्रदर्शन करते हैं।
      2. विश्लेषण / टी में उचित टुकड़ा (अधिकतम तीव्रता के साथ चोटी) का चयन करें 1/2 टी छूट खिड़की, एकीकृत, और विश्राम मॉड्यूल के क्षेत्र में निर्यात।
      3. टी 1 या 2 टी छूट बार प्राप्त करने के लिए उचित फिटिंग समारोह (invrec या आईआर और CPMG प्रयोगों के लिए uxnmrt2, क्रमशः) का चयन करें।
    5. दोहराएँ कदम 2.4.4.2-2.4.4.4 सभी शेष [डीसीए] के समाधान के लिए।
    6. प्राप्त टी 1 मूल्यों से छूट दरों (आर 1 और 2 आर) की गणना (आर 1,2 = 1 / टी 1,2)।
    7. प्लॉट आर 1 और 2 आर (सेकंड -1) मिमी में जी.डी. (तृतीय) एकाग्रता के एक समारोह के रूप में।
    8. अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ relaxivities, आर 1 और 2 आर (मिमी -1 सेकंड -1) निर्धारित, सज्जित लाइन की ढलान से के रूप में Eq द्वारा परिभाषित किया। 6, जहां r मैं, ओ बीएस = अनुदैर्ध्य (i = 1) या अनुप्रस्थ (i = 2) diamagnetic छूट की दरसमचुंबक प्रजातियों के अभाव और [gd] = जी.डी. (तृतीय) की एकाग्रता प्रयोग में इस्तेमाल में पानी।
      समीकरण 6 (6)

3. इन विट्रो एमआरआई में; डीसीए और GdDOTA के बीच तुलना

  1. ट्यूब phantoms की तैयारी
    1. जहां विपरीत एजेंटों की एकाग्रता गणना की जाती है प्रयोगों के दो सेट के लिए डीसीए (4 x 350 μl) और GdDOTA (4 x 350 μl) के रूप में अच्छी तरह से पानी के नमूने (4 x 350 μl) के जलीय समाधान तैयार: (3.1.1.1) प्रति जी.डी. (तृतीय) या (3.1.1.2) अणु प्रति।
      1. दो डीसीए के नमूने और दो GdDOTA तैयार जी.डी. प्रति 0.5 और 1.0 मिमी (तृतीय), क्रमशः की सांद्रता के साथ नमूने हैं। इसके अतिरिक्त, (नियंत्रण ट्यूब के रूप में) दो पानी के नमूने तैयार करते हैं।
      2. दो डीसीए के नमूने (2.5 और जी.डी. (तृतीय) या 0.05 प्रति 5.0 मिमी और dendrimeric अणु प्रति 0.1 मिमी), दो GdDOTA नमूने (0.25, 0.5 मिमी) और दो पानी के नमूने तैयार (विवादएल ट्यूब)।
        नोट: उचित डीसीए और GdDOTA सांद्रता बीएमएस विधि के माध्यम से निर्धारित सांद्रता के साथ संबंधित स्टॉक नमूने गिराए द्वारा तैयार किया जाना चाहिए HEPES बफर (7.4 पीएच) के साथ (खंड 2.2 देखें)। आदेश, गणना को आसान बनाने के लिए एन = 50 डेनड्रीमर अणु प्रति मैक्रोसाईक्लिक इकाइयों की औसत संख्या के लिए मान लिया गया था। इसलिए, डीसीए के अनुपात: GdDOTA था 1: 5, एक प्रति अणु के आधार पर गणना की।
    2. 300 μl प्लास्टिक की शीशी ट्यूबों में नमूने रखें, समाधान में हवा के बुलबुले की उपस्थिति से परहेज।
      नोट: प्लास्टिक की शीशी ट्यूबों के आकार प्रकार और रेडियोफ्रीक्वेंसी इस्तेमाल किया कुंडल के आकार पर निर्भर करता है (यहाँ, मात्रा का तार के साथ एक उदाहरण दिया जाता है)।
    3. , एक सिरिंज (60 मिलीलीटर की मात्रा) के अंदर नमूने डालें 1 मिमी GdDOTA के साथ इसे भरने समाधान है, और स्कैनर में जगह है।
      नोट: नमूने GdDOTA के जलीय घोल में रखा गया संवेदनशीलता प्रभाव (चुंबकीय क्षेत्र रों में बदलाव से बचने के लिएtrength होती है कि विभिन्न चुंबकीय संवेदनशीलता के पदार्थों के बीच के पास इंटरफेस)।
  2. पैरामीटर अनुकूलन और इमेजिंग।
    1. चुंबक के isocenter में नमूने के साथ सिरिंज की स्थिति के लिए संरचनात्मक स्कैन (Localizer / Tripilot) का प्रयोग करें।
    2. यातायात प्रकाश (समायोजन स्कैन) पूरी मात्रा, केंद्रीय आवृत्ति (हे 1), रिसीवर लाभ (आरजी), और संचारित लाभ (TX0 और TX1) के (चुंबकीय क्षेत्र एकरूपता का समायोजन) shimming के लिए समायोजन करने के लिए दबाएँ।
    3. टी 1 भारित (टी 1 माह) इमेजिंग के लिए, तेजी से कम कोण शॉट (फ्लैश) विधि का चयन करें।
    4. Localizer स्कैन का उपयोग स्कैनर में नमूने (क्षैतिज सिरिंज) के लिए खड़ी रखा राज्याभिषेक टुकड़ा चुनें।
    5. Eq का प्रयोग करें। इसके विपरीत करने के लिए शोर (सीएनआर) अधिग्रहण के अनुकूलन के लिए 7 से 16, जहां α = फ्लिप कोण, ते = गूंज समय मापदंडों, टी.आर. =पुनरावृत्ति समय है, और टी 1, ए, टी 1, बी टी = 1 (टी 1, ए) नमूना एक के समय और नमूना बी (टी 1, बी) जिसके लिए सीएनआर अधिकतम करना चाहिए (समान के लिए मान्य है टी 2 बार: टी 2, ए और टी 2, बी)।
      नोट: टी 1 और 2 टी छूट बार, अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ relaxivities (धारा 2.4) के माप से प्राप्त मूल्यों को स्थापित किया जाना चाहिए, जबकि ते, टी.आर., और α सीएनआर अनुकूलन गणना से प्राप्त किया जाना चाहिए।
      समीकरण 7 (7)
    6. पिछले चरण (3.2.5) में प्राप्त मापदंडों का उपयोग कर छवि मोल।
    7. संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) की गणना।
      1. छवि प्रदर्शन और प्रसंस्करण में अधिग्रहण कर लिया टी 1 माह छवि (स्कैन) लोडखिड़की, और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित करें पर क्लिक करें।
      2. एक परिपत्र रॉय चुनें और नमूना स्थिति और पृष्ठभूमि में यह आकर्षित। बाद में, औसत संकेत आयाम (एस संकेत) और पृष्ठभूमि (एस शोर) के मानक विचलन प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन पर क्लिक करें।
      3. डीसीए, GdDOTA, और पानी के नमूने लिए दोहराएँ चरण 3.2.7.2।
      4. SNR सूत्र का उपयोग कर की गणना: SNR = एस संकेत / एस शोर।
    8. एक थोड़ा संशोधित प्रक्रिया के बाद, विश्राम संवर्धन (दुर्लभ) विधि के साथ तेजी से अधिग्रहण का उपयोग कर प्रदर्शन टी 2 भारित (टी 2 माह) इमेजिंग। सीएनआर अधिग्रहण मानकों के अनुकूलन के लिए, समीकरण का उपयोग करें। 8।
      समीकरण 8 (8)

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Representative Results

डीसीए की तैयारी दो चरणों में शामिल हैं: 1) monomeric DOTA प्रकार chelator के संश्लेषण (चित्रा 1) और 2) जी -4 PAMAM डेनड्रीमर और dendrimeric जी.डी. (तृतीय) परिसर के बाद तैयारी के साथ chelator के युग्मन (चित्रा 2) । पहले चरण में, एक Cyclen आधारित DOTA-प्रकार और चार कार्बोक्जिलिक एसिड से युक्त chelator एक orthogonal आगे सिंथेटिक संशोधन के लिए उपयुक्त समूह तैयार किया गया था। तैयारी से 1 (DO3A- tert -butyl एस्टर) 7 शुरू किया है, जिसके साथ tert -butyl 2-ब्रोमो-4- (4-nitrophenyl) butanoate 8 alkylated था DOTA-व्युत्पन्न 2 प्रदान करने के लिए। पैलेडियम उत्प्रेरित हाइड्रोजनीकरण एनिलिन 3 उपज के लिए 2 में खुशबूदार नाइट्रो समूह कम हो। Thiophosgene के साथ 3 के रूपांतरण आइसोथियोसाइनेट 4 में हुई है, जोज पहले dendrimeric सीए 17 की तैयारी के लिए एक amine प्रतिक्रियाशील एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

निम्नलिखित चरण में, macrocycle 4 जी -4 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PAMAM डेनड्रीमर के लिए एक युग्मन प्रतिक्रिया में बुनियादी monomeric इकाई के रूप में इस्तेमाल किया गया था। डेनड्रीमर के अमाइन सतह समूहों के लिए एक आधार की उपस्थिति में मोनोमर 4 की आइसोथियोसाइनेट समूहों के साथ प्रतिक्रिया। 4 से अधिक eluent के रूप में मेथनॉल के साथ एक lipophilic जेल निस्पंदन माध्यम का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा हटा दिया गया था। प्राप्त डेनड्रीमर मैक्रोसाईक्लिक साधना 5 पर tert -butyl एस्टर 6, जो तब lyophilized और शुद्धि के बिना अगले चरण में इस्तेमाल किया गया था उपज के लिए फार्मिक एसिड के साथ hydrolyzed थे। जी.डी. (तृतीय) के DOTA प्रकार macrocycles के परिसरों गठन के एक जलीय समाधान करने के लिए ओ GdCl 3 · 6H 2 हे जोड़ने के द्वारा किया गया थाएफ 6, जबकि 7 के बारे में जी.डी. से अधिक (तृतीय) में पीएच को बनाए रखने के लिए एक आम chelator ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ complexed था। GdEDTA जटिल और अतिरिक्त EDTA eluent के रूप में पानी के साथ एक हाइड्रोफिलिक जेल निस्पंदन माध्यम का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रणाली से हटा दिया गया। शेष छोटे आकार दोष 3 केडीए केन्द्रापसारक निस्पंदन इकाइयों का उपयोग centrifugation द्वारा समाधान से हटा दिया गया।

डेनड्रीमर macrocycle conjugates के संश्लेषण के बाद एक संयुक्त विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण उत्पादों को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया गया है। 5 और 6 की सतह-एमाइन अधिभोग का निर्धारण करने के लिए, 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा विश्लेषण किया गया है। परिणामों की तुलना में और अंतिम उत्पाद (डीसीए), जहां macrocycles साथ डेनड्रीमर की लोडिंग मौलिक विश्लेषण और MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग अनुमान लगाया गया है (चित्रा के साथ की पुष्टि की थी3)। इन तीन तरीकों का एक संयोजन 49 मैक्रोसाईक्लिक इकाइयों के एक औसत में हुई जी -4 डेनड्रीमर है, जो करने के लिए ~ 75% अमाइन सतह समूह अधिभोग मेल खाती संयुग्मित जा रहा है।

Dendrimeric परिसर के आगे लक्षण वर्णन, relaxivity मूल्यों के निर्धारण शामिल अनुदैर्ध्य relaxivity और 30.5 ± के लिए 6.2 ± 0.1 मिमी, जिसके परिणामस्वरूप -1 सेकंड -1 जी.डी. (तृतीय) प्रति (या मोटे तौर पर लगभग 300 मिमी -1 सेकंड -1 डेनड्रीमर प्रति) 0.6 मिमी -1 सेकंड -1 प्रति जी.डी. (तृतीय) अनुप्रस्थ relaxivity के लिए (लगभग 1500 मिमी -1 सेकंड -1 प्रति डेनड्रीमर)। DLS माप डीसीए (चित्रा 4) के लिए 7.2 ± 0.2 एनएम के एक hydrodynamic व्यास संकेत दिया।

अंत में, dendrimeric एमआरआई विपरीत एजेंट के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, एमआर इमेजिंग phantoms के दो सेट पर डीसीए और क्लिनिक के साथ प्रदर्शन किया गया थातुलना के लिए सहयोगी उपलब्ध GdDOTA (चित्रा 5)। phantoms का पहला सेट, समान जी.डी. (तृतीय) सांद्रता में इन दो विपरीत एजेंटों की तुलना करने के उद्देश्य से तैयार किए गए थे, जबकि दूसरे सेट dendrimeric और monomeric विपरीत एजेंटों के तुलनीय अणु सांद्रता में प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए क्रमश: डिजाइन किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: मैक्रोसाईक्लिक DOTA प्रकार chelator 4. अभिकर्मकों, स्थिति, और पृथक पैदावार के संश्लेषण: (i) tert -butyl 2-ब्रोमो-4- (4-nitrophenyl) butanoate, कश्मीर 2 3 सीओ, DMF, 45 डिग्री सेल्सियस , 16 घंटा, 72%; (ii) एच 2, पीडी / सी, EtOH, आरटी, 16 घंटा, 95%; (iii) CSCL 2, 3 एट एन, आर टी, 2 घंटा, 53%। इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें gure।

चित्र 2
चित्रा 2: dendrimeric एमआरआई विपरीत एजेंट डीसीए अभिकर्मकों और शर्तों के संश्लेषण: (i) 4, एट 3 एन, DMF, 45 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटा, 91%;। (Ii) फार्मिक एसिड, 60 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटा, क्वांट; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 हे, पीएच 7.0, आरटी, 24 घंटा, 71%। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से dendrimeric उत्पाद की विशेषता एक ठेठ MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रम डीसीए के लिए प्राप्त की।rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:।। गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) डीसीए (HEPES, 7.4 पीएच) के डीएलएस माप के माध्यम से dendrimeric उत्पाद की विशेषता कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: 7 टी चुंबकीय क्षेत्र पर ट्यूब phantoms पर इन विट्रो प्रयोगों एमआरआई (क, ख) टी 1 भारित और (ग, घ) डीसीए और GdDOTA की टी 2 भारित एमआरआई।। प्रत्येक एमआरआई प्रयोग के साथ प्रदर्शन किया गया था इसके विपरीत एजेंट की दो अलग अलग सांद्रता: (क, ग) तुलनीय जी.डी. के साथ (तृतीय) सांद्रता (HEPES, 7.4 पीएच); (बी, डी) एक डीसीए के साथ: 1 के अनुपात GdDOTA एकाग्रता: 5 (HEPES, 7.4 पीएच)। सांद्रता अणु प्रति व्यक्त कर रहे हैं और SNR मूल्य कोष्ठक में प्रदर्शित कर रहे हैं। इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया मानकों थे: क्षेत्र के दृश्य (FOV) = 40 x 40 मिमी 2, टुकड़ा मोटाई = 0.5 मिमी, excitations (नेक्स) = 30 की संख्या; (क) मैट्रिक्स आकार (MTX) = 256 x 256, पुनरावृत्ति समय (टीआर) = 100 मिसे, गूंज समय (ते) = 2.95 मिसे, फ्लिप कोण (एफए) = 90 डिग्री, अधिग्रहण के समय (टीए) = 12 मिनट 48 सेकंड ; (ख) MTX = 256 x 256, टी.आर. / ते = 20 / 2.95 मिसे, एफए = 90 डिग्री, टीए = 2 मिनट 34 सेकंड; (ग) MTX = 512 x 512, टी.आर. / ते = 10,000 / 130 मिसे, दुर्लभ कारक (आरएफ) = 16, टीए = 26 मिनट 40 सेकंड; (घ) MTX = 512 x 512, टी.आर. / ते = 10,000 / 100 मिसे, आरएफ = 16, टीए = 26 मिनट 40 सेकंड।776fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Dendrimeric एमआरआई विपरीत एजेंट की तैयारी monomeric इकाई का उचित चयन की आवश्यकता है (यानी, जी.डी. के लिए chelator (तृतीय))। वे इस समचुंबक आयन की विषाक्तता अचक्रीय की एक विस्तृत विविधता को कम करने और, आज तक, और मैक्रोसाईक्लिक chelators इस उद्देश्य के 1-3 सेवा करते हैं। इन के अलावा, मैक्रोसाईक्लिक DOTA प्रकार chelators उच्चतम thermodynamic स्थिरता और गतिज जड़ता के अधिकारी और, इसलिए, अक्रिय एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों 1,18 की तैयारी के लिए सबसे पसंदीदा विकल्प हैं। इसके अलावा, वे विभिन्न सिंथेटिक परिवर्तनों, जो bifunctional chelators में परिणाम, विभिन्न कार्यात्मक अणुओं को जोड़ने के लिए सक्षम है (जैसे, लक्षित कर वैक्टर या नैनो-वाहक) होने का खतरा है, जबकि अभी भी (तृतीय) परिसरों 19 स्थिर जी.डी. के गठन। यह अंत करने के लिए, DOTA प्रकार monomeric इस प्रक्रिया में वर्णित इकाई DO3A- tert -butyl एस्टर, आम और आसानी से उपलब्ध अग्रदूत, और ब्रोमाइड व्युत्पन्न से तैयार किया गया था4- (4-nitrophenyl) butanoic एसिड। इस अणु DOTA से ली गई है और जी.डी. समन्वय करने के लिए एक समान संरचना के पास है (तृतीय)। सिंथेटिक संशोधन इस chelator विभिन्न कार्यात्मक अणुओं और वाहक करने के लिए प्रतिक्रियाओं युग्मन के लिए खतरा बना लिए करना है। अर्थात्, एक chelator में DOTA संशोधित अणु परिणामों की तैयारी चार कार्बोक्जिलिक जी.डी. करने के लिए समन्वय के लिए उपलब्ध समूहों के साथ अभी भी (तृतीय) एक निष्क्रिय जटिल और एक orthogonal nitrophenyl समूह है, जो रूपांतरण पर डेनड्रीमर सतह को यह chelator देता है के रूप में। यह प्रक्रिया भी orthogonal प्रतिक्रियाशील समूह के चुनाव में लचीलेपन के लिए अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, राष्ट्रीय राजमार्ग 2 या COOH), जो एक पसंदीदा तरीके से एक वांछित वाहक करने के लिए जी.डी. (तृतीय) chelator जोड़े को सेवा कर सकते हैं।

प्राप्त bifunctional chelator दो अलग अलग तरीकों (यानी, सिंथेटिक प्रक्रियाओं) में अन्य अणुओं को मिलकर किया जा सकता है। नाइट्रो समूह एक एमिनो समूह के लिए कम हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एनिलिन के तहत कर सकते हैंअन्य अणु 8 की कार्बोक्जिलिक एसिड समूह के साथ एक संक्षेपण प्रतिक्रिया जाना। इसके अलावा, एक खुशबूदार प्राथमिक अमाइन thiophosgene की उपस्थिति में कार्यात्मक समूह आसानी से एक आइसोथियोसाइनेट, एक समूह है जो आसानी से ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ ही पानी में amines के साथ प्रतिक्रिया करता dendrimers 17 monomeric इकाइयों के युग्मन के लिए अधिक प्रतिक्रिया संभावनाओं की पेशकश में परिवर्तित किया जा सकता , 20,21।

dendrimeric वाहक करने के लिए bifunctional chelator युग्मन के लिए, एक उपयुक्त dendrimeric पाड़ चयन किया जाना चाहिए। अंतिम डेनड्रीमर साधना संरचना और वांछित आवेदन से संबंधित कई कारकों इस कदम के लिए जिम्मेदार होना चाहिए। dendrimeric वाहकों के व्यापक वाणिज्यिक उपलब्धता के कारण, विभिन्न कोर संरचनाओं, सतह प्रतिक्रियाशील समूहों, या पीढ़ियों के साथ उत्पादों को चुना जा सकता है। नतीजतन, विकार प्रतिक्रिया, डेनड्रीमर और chelator के orthogonal समूह की सतह समूह पर निर्भर करेगा, जबकिअंतिम रूप साधना तटस्थ आरोप लगाया हो, या अलग अलग आकार (15-20 एनएम पर निर्भर है, डेनड्रीमर पीढ़ी पर निर्भर करता है) है 22 मई। इन सभी पहलुओं, dendrimeric सीए की तैयारी करने से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि वे घुलनशीलता, relaxivity (एमआरआई संकेत वृद्धि), प्रसार, और इसके विपरीत एजेंट, जो संभवतः एमआरआई में अपने आवेदन खतरे में पड़ सकता के अन्य फ़ार्माकोकायनेटिक गुणों को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, cationic dendrimers जैविक प्रणालियों में विषाक्तता प्रदर्शन कर सकते हैं। हालांकि, इस आशय डेनड्रीमर सतह पर नकारात्मक आरोप लगाया समूहों के विकार से कम किया जा सकता है, जिससे उनके समग्र सकारात्मक चार्ज 23 को कम करने।

इस प्रोटोकॉल में, हम dendrimeric विपरीत एजेंट डीसीए प्रक्रिया है जिसमें monomeric macrocycle 4 की आइसोथियोसाइनेट समूह एक वाणिज्यिक cystamine कोर जी -4-PAMAM 64 प्राथमिक अमाइन सतह समूहों के साथ सुसज्जित करने के लिए मिलकर किया गया था का उपयोग कर तैयार किया है। hydroph की प्रारंभिक शुद्धिobic dendrimeric उत्पाद 5 unreacted monomeric इकाइयों के सबसे हटाने के लिए आदेश में एक lipophilic जेल निस्पंदन मध्यम और eluent के रूप में मेथनॉल के साथ एक कॉलम का उपयोग कर जेल क्रोमैटोग्राफी द्वारा किया गया था। फार्मिक एसिड के साथ टी -butyl एस्टर की hydrolysis एक पानी में घुलनशील dendrimeric उत्पाद है कि एक हाइड्रोफिलिक जेल निस्पंदन माध्यम का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ शुद्ध किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सीधा है। जी.डी. (तृतीय) के साथ multimeric और dendrimeric chelators की complexation आदेश जटिल गठन की सुविधा के लिए एक तटस्थ पीएच पर समाधान को बनाए रखने whilst प्रदर्शन किया गया था। अन्यथा, जी.डी. की complexation (iii) (क्लोराइड नमक के रूप में जोड़ा), पीएच कम कर देता है नीचे प्रतिक्रिया धीमा। अंत में, यह ध्यान देने योग्य बात है कि डेनड्रीमर कोर में अमाइन समूहों को भी जी.डी. (तृतीय) के साथ समन्वय स्थापित करने के लिए जाते हैं, लेकिन केवल अतिरिक्त है कि DOTA इकाइयों के साथ chelated नहीं किया जा सकता है के साथ लायक है। DOTA chelator बाहर जी.डी. (तृतीय) की उपस्थिति से बचना जरूरी है, ले के बाद सेजी.डी. (तृतीय) सीए से की akage अवांछित प्रभाव पड़ सकता है; अर्थात्, यह विवो 18 में विषाक्तता पैदा कर सकते हैं। अतिरिक्त जी.डी. (तृतीय) को प्रभावी ढंग से GdEDTA की ultrafiltration और मुक्त EDTA 3 केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) फिल्टर का उपयोग करके किया EDTA के साथ complexation द्वारा हटाया जा सकता है। लोअर MWCO फिल्टर इस्तेमाल किया जा सकता है dendrimeric conjugates कम आणविक वजन किया है।

वहाँ दो प्रमुख समस्या निवारण डीसीए की तैयारी से संबंधित मुद्दे हैं। एनएमआर संकेतों पर जी.डी. (तृतीय) की बड़ी व्यापक प्रभाव के कारण, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से डीसीए के विश्लेषण जानकारीपूर्ण नहीं है। इसके बजाय, इस विश्लेषण में पहले कदम (यौगिकों 5 और 6) में किया जाना चाहिए। अगले, डेनड्रीमर सतह के लिए monomacrocyclic इकाइयों के विकार 100% रूपांतरण के साथ पूरा कभी नहीं है, लेकिन यह (देखें नीचे) 50-90% के बीच होने की संभावना है। आमतौर पर, प्रतिक्रिया पैदावार monomeri के एक दूसरे हिस्से को जोड़ने के द्वारा बढ़ाया जा सकता हैसी प्रतिक्रियाशील इकाई डेनड्रीमर और monomeric इकाई की पहली विकार के बाद 24 पूरा हो गया है। हालांकि, डेनड्रीमर सतह पर संयुग्मित chelators की कुछ हद तक अलग औसत संख्या में हर तैयारी बैच परिणाम है, तब भी जब समान डेनड्रीमर और DOTA इकाइयों युग्मन के लिए सामग्री के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि जी.डी. (तृतीय) की अंतिम राशि डीसीए में मौजूद बीएमएस विधि के माध्यम से स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जा सकता, dendrimeric conjugates के बेहतर लक्षण वर्णन के लिए (धारा 2.2 देखें), यह हर बार का एक नया बैच बाध्य monomeric इकाइयों के आकलन करने के लिए आवश्यक है डीसीए तैयार किया जाता है (2.1 और नीचे चर्चा देखें)।

पृथक dendrimeric उत्पादों के विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, मौलिक विश्लेषण, और MALDI-TOF एमएस (केवल उत्पादों 5 और 6 पर) के माध्यम से किया जा सकता है। अमीनो सतह समूहों के रूपांतरण के लिए विशिष्ट पैदावार, 50-90% के बीच झूठ डेनड्रीमर Generati पर निर्भर करता हैपर, chelator के प्रकार, और प्रतिक्रिया की स्थिति में इस्तेमाल किया (विलायक और तापमान) 6,20,24,25। इस विशेष मामले में, गणना की संयुक्त विश्लेषण से प्राप्त की जनता 49 monomeric chelates के एक औसत के अनुरूप डेनड्रीमर करने के लिए मिलकर किया जा रहा है (यानी, ~ डेनड्रीमर सतह amines के 75% अधिभोग)। प्रतिक्रिया व्यक्त एमिनो समूहों के अंतिम संख्या में मामूली बेमेल इन तरीकों 25 के बीच उम्मीद की जा सकती है, उनके प्रत्यक्ष तुलना जुड़ी chelating इकाइयों की एक विशेष औसत संख्या के साथ वांछित डीसीए के गठन के लिए उचित सबूत उपलब्ध कराता है।

इन विट्रो लक्षण वर्णन डीसीए की क्षमता का आकलन करने के लिए एमआरआई प्रयोगों में विपरीत बढ़ाने के लिए लक्ष्य डीएलएस, relaxometric, और एमआरआई प्रयोगों शामिल थे। डीसीए की hydrodynamic व्यास 7.2 ± 0.2 डीएलएस मापन द्वारा एनएम, जो इस तरह की पहले से सूचना दी conjugates के साथ समझौते में है होना करने के लिए निर्धारित किया गया थाजी -4 पीढ़ी के साथ 4 PAMAM 26 dendrimers। डीसीए के अनुदैर्ध्य relaxivity का निर्धारण पहले से वर्णित प्रक्रिया का पालन किया और 15 6.2 ± 0.1 मिमी -1 सेकंड -1 जी.डी. (तृतीय) प्रति के मूल्य का पता चला। एक समान प्रकार (जैसे, GdDOTA) के छोटे आकार के अणुओं को डीसीए सापेक्ष में आर 1 समचुंबक जी.डी. (तृतीय) में वृद्धि के बारे में 50% dendrimeric विपरीत एजेंट के मध्यवर्ती आकार के साथ समझाया जा सकता है। अर्थात्, डेनड्रीमर सतह से जुड़ी जी.डी.-chelates की कम गति घूर्णी सहसंबंध के समय बढ़ जाती है और, इसलिए, आर 1; इस आशय अभी भी छोटे नैनो आकार के एजेंटों के लिए उच्च चुंबकीय क्षेत्र में देखा जा सकता है। अन्यथा, बारी-बारी से सहसंबंध के समय में वृद्धि मुख्यतः कम चुंबकीय क्षेत्र 27 में आर 1 वृद्धि करने के लिए योगदान देता है। दूसरी ओर, dendrimeric विपरीत एजेंट के आकार अनुप्रस्थ असली पर एक स्पष्ट प्रभाव पड़ाxivity 28, 30.5 ± 0.6 मिमी -1 सेकंड -1 के मूल्य में जिसके परिणामस्वरूप जी.डी. प्रति (तृतीय)। सारांश में, डीसीए की इन विट्रो मूल्यांकन के लिए तरीकों सीधा कर रहे हैं और केवल सावधान नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है, तो कोई कठिनाइयों की उम्मीद कर रहे हैं जब डेटा प्राप्त करने और परिणामों का विश्लेषण।

dendrimeric विपरीत एजेंट और छवि के विपरीत प्रभावित करने के लिए अपनी शक्ति के प्रदर्शन का प्रदर्शन करने के लिए, हम नव तैयार विपरीत एजेंट डीसीए के साथ ट्यूब phantoms पर एमआरआई प्रयोगों का प्रदर्शन किया। हम भी एक नियंत्रण के रूप में एक तुलना और पानी के साथ ट्यूब के रूप में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और चिकित्सकीय अनुमोदित एमआरआई विपरीत एजेंट, GdDOTA का एक समाधान का इस्तेमाल किया। पहले टी 1 एमआरआई प्रयोग भारित, जब बराबर जी.डी. (तृतीय) सांद्रता इस्तेमाल किया गया (0.5 या 1 जी.डी. एम.एम. (तृतीय) डीसीए या GdDOTA में), डीसीए के साथ ट्यूबों में SNR पहले से ही 12% से अधिक की वजह से उठ गया था (डीसीए GdDOTA की तुलना के अनुदैर्ध्य relaxivity में लगभग 50% की वृद्धि हुई एफigure 5 ए)। दूसरे टी 1 भारित एमआरआई प्रयोग डीसीए के प्रभाव सांद्रता अणु प्रति गणना की गई है जब प्रदर्शित करने के लिए डिजाइन किया गया था। हालांकि 5 गुना कम डीसीए GdDOTA की तुलना में लागू किया गया था (50 बनाम 250 माइक्रोन या 100 बनाम 500 माइक्रोन डीसीए बनाम GdDOTA, क्रमशः), जी.डी. साथ डीसीए के एक उच्च लोड हो रहा है (तृतीय) छवि के विपरीत में एक महत्वपूर्ण वेतन वृद्धि के परिणामस्वरूप, जो बारी में कम से कम तीन बार प्रेत डीसीए के साथ भरा ट्यूबों में अधिक होने मनाया SNR मूल्यों में हुई। उम्मीद के मुताबिक, दोनों टी 2 भारित एमआरआई प्रयोगों प्रेत डीसीए और GdDOTA के साथ भरा ट्यूबों के बीच SNR में बड़े (3-20 बार) मतभेद का प्रदर्शन किया।

अंत में, इस प्रोटोकॉल आम सिंथेटिक प्रक्रियाओं का उपयोग छोटे आकार सीए की तुलना में सुधार गुणों के साथ डीसीए प्रदान करने के लिए एमआरआई के लिए एक dendrimeric सीए के लिए एक सुविधाजनक तैयारी का वर्णन है। डीसीए दर्शाती thermodynamic स्थिरता और गतिज जड़ता को प्राथमिकता दी जब तुलनाइसकी monomeric सीए analogues के लिए। फिर भी, डीसीए और, multivalency इसलिए, लक्ष्य क्षेत्र में समचुंबक प्रजातियों के उच्च एकाग्रता स्थानीय एमआर छवियों में उच्च विपरीत लाती है। अक्सर बेहतर फ़ार्माकोकायनेटिक गुण (जैसे, अब ऊतक अवधारण समय) उनके monomeric सीए analogues की तुलना में, या आगे कार्यक्षमताओं ले जाने की क्षमता (जैसे, लक्षित वैक्टर) को देखते हुए, इन dendrimeric-macrocycle conjugates के लिए विपरीत एजेंटों का एक होनहार और मूल्यवान वर्ग का प्रतिनिधित्व विभिन्न भविष्य एमआरआई और आणविक इमेजिंग अनुप्रयोगों।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyclen CheMatech C002
tert-Butyl bromoacetate  Alfa Aesar A14917
N,N-Dimethylformamide Fluka 40248
Potassium carbonate Sigma-Aldrich 209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid Aldrich 335339
Thionyl chloride  Acros Organics 382662500 Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine Acros Organics 402841000 Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled 
Diethyl ether any source
Sodium sulphate Acros Organics 196640010
Chloroform  VWR Chemicals 22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate Aldrich 364789 Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate Acros Organics 174560250 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate Acros Organics 424270010
Ethyl-acetate any source For column chromatography
n-Hexane any source For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus Büchi Model type: Glass oven B-585
Silicagel Carl Roth GmbH P090.2
Methanol any source For column chromatography
Dichloromethane  any source For column chromatography
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
Ammonia Acros Organics 428381000 7 N Solution in Methanol
Palladium Aldrich 643181 15% wet
Hydrogenation apparatus PARR PARR Instrument Company
Celite 503 Aldrich 22151
Sintered glass funnel any source
Thiophosgen Aldrich 115150 Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine Alfa Aesar A12646
Dichloromethane  Acros Organics 348460010 Extra dry 
Magnetic stirrer any source
PAMAM G4 Dendrimer Andrews ChemService AuCS - 297 10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20 Sigma LH20100
Thin-layer chromatography plates Merck Millipore 1.05554.0001
Formic acid VWR Chemicals 20318.297
Lophylizer  any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate Aldrich G7532
Sodium hydroxide Acros Organics 134070010
pH meter any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Aldrich E5134
Mass spectrometer (ESI) Agilent Ion trap SL 1100 
Acetate buffer any source pH 5.8
Xylenol orange Aldrich 52097 20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15 GE Healthcare 17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Merck Millipore UFC900324 Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge any source
NMR spectrometer  Bruker Avance III 300 MHz
Topspin Bruker Version 2.1
Combustion analysis instrument EuroVector SpA EuroEA 3000 Elemental Analyser 
MALDI-ToF MS instrument Applied Biosystems Voyager-STR
Deuteriumoxid Carl Roth GmbH 6672.3
tert-Butyl alcohol Carl Roth GmbH AE16.1
Vortex mixer any source
Norell NMR tubes Deutero GmbH 507-HP-7
NMR coaxial tube Deutero GmbH coaxialb-5-7
DLS instrument Malvern Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter  Carl Roth GmbH KC94.1
HEPES Fisher BioReagents BP310
Plastic tube vials any source
Dotarem Guerbet NDC 67684-2000-1
MRI scanner Bruker BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil Bruker Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software) Bruker Version 5.1

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References

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