바이오 필름 제거 질소 제거하지 않고 이산화탄소 에어로졸을 사용하여

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
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Environment

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Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

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Abstract

Protocol

바이오 필름 형성을위한 표면의 1. 준비

  1. 기계적 커터 칩으로 304 1 mm 두께의 스테인레스 판 (10 × 10 mm 2)를 잘라.
  2. 10 분 각각 아세톤, 메탄올, 탈 (DI) 물 순차적 칩의 초음파 세척을 수행합니다. 유기 오염 물질을 제거하고, 유리와 같은 물질로 이루어진 제성 컨테이너를 사용한다.
  3. 3-5 초 동안 DI 물 흐르는 칩을 헹군다.
  4. 3-5 초 동안 N 2 가스 흐름을 이용하여 칩을 건조.

세균성 문화의 2. 준비

  1. P.를 타고 -80 ° C 깊은 냉동고에 저장 재고 (친절 교수 성 동국 리, UNIST, 한국에서 제공) 푸티 다 KT2440.
  2. 1 분 후 상온에서 해동 한 동결 스톡 용액의 상층에 슬러시집니다. 원액의 용융 층으로 루프를 담근다.
  3. 루리아에 행진에 세균이 루프를 사용하여1.5 % 한천을 포함 -Bertani (LB) 플레이트.
  4. 박테리아 식민지 성장을 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
  5. 새로운 루프를 사용하여 플레이트에서 하나의 식민지를 선택합니다.
  6. 단일 박테리아 콜로니를 함유하는 루프와 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 LB 배지 10 ㎖를 접종한다.
  7. 30 ° C에서 16 시간 160 RPM의 진탕 배양기에서 국물을 품어.

표면에 3 biofilm 형성

  1. 각 칩의 표면을 살균, 1-2 초마다 5 회 핀셋 제조 된 칩의 각각을 픽업 70 % 에탄올에 담갔다. 칩이 침지시 핀셋으로 개최되어 있는지 확인합니다.
  2. 남아있는 에탄올을 제거 멸균 된 DI 물과 LB 배지 순차적으로 각 칩, 1 ~ 2 초마다 5 번 찍어.
  3. 이 칩과 잘 당 5 ml의 LB 배지로 6 웰 배양 판에이 칩을 놓습니다.
  4. LB 배지에 도달의 농도까지 박테리아 문화를 희석8 × 108 세포 / ㎖ (파장 600nm에서의 광학 밀도 : 0.8 ~).
  5. 희석 세균 배양의 50 μl를 잘 각각 접종.
  6. 바이오 필름의 형성을위한 24 시간 동안 흔들림없이 30 ° C에서 접시를 품어.

4. CO 2 에어로졸 청소

  1. 10 mM의 초산 암모늄 버퍼에 바이오 필름 형성 칩을 찍어 (휘발성) 5 회 느슨하게 부착 플랑크톤 박테리아를 제거합니다.
  2. 공기가 온화하게 흐르는 바이오 안전성 캐비닛에이 칩을 건조시킵니다.
  3. 건조 직후, 제트의 축선을 따라 CO 2 노즐로부터 20mm 인로드 위치에 칩을 배치했다. 40 ° 각도로 분사 축을 기울입니다.
  4. 가스 압력 조절기를 사용하여, 각각 5.3 MPa의 0.7 MPa의에 CO 2와 N 2 가스의 정체 압력을 설정합니다.
  5. 칩의 중앙 부분에 에어로졸 젯을 적용합니다. (2)해야 고체 CO 포함 화이트 에어로졸볼 수 있습니다. 5 초 동안 CO 2의 솔레노이드 밸브 "의"를 켠 다음 3 초 동안 "OFF"전원을 켜 : 주기적으로 수동으로 제어 스위치를 사용하여 (사이클 8 초). 질소 퍼지를 이용해야하는 경우, N (2)의 연속 공급을위한 솔레노이드 밸브를 켜.
  6. 16, 40 CO 2 에어로졸을 칩을 치료하고와 질소 퍼지없이 88 초. 음성 대조군으로 처리없이 칩을 유지합니다.

제거 효율 5. 분석

  1. 제어 및 에어로졸 처리 칩 세균 세포를 염색하기 위해 DI 물 : 1 μM 녹색 형광 핵산 얼룩 (500분의 480 nm의 여기 / 방출 파장)을 준비한다.
  2. 염색 용액에 칩을 놓습니다.
  3. 30 분 동안 37 ° C에서 빛이없는 배양기에서 배양 한 칩.
  4. 배양 후, 부드럽게 과도한 형광 색소를 제거하는 DI 워터를 흐르는 칩을 헹군다.
  5. 칩 위스콘신을 건조제 N 2 가스 흐름.
  6. 표면 형광 현미경하는 40X 대물 렌즈와 CCD 카메라를 사용하여 각각의 칩에 대한보기의 5 랜덤 필드 (321 × 240 μm의 2)의 현미경 이미지를 형광 가져 가라.
  7. 이러한 ImageJ에 같은 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에 대한 형광 강도를 얻었다. ImageJ에에서 "프로세스"메뉴에서 "빼기 배경"기능을 사용하고 "분석"메뉴의 "설정 측정"창에서 "통합 밀도"를 선택합니다. 형광 강도를 얻기 위해 "분석"메뉴에서 "측정"을 수행.
  8. 다음 식에 따라 생물막 제거 효율을 계산한다 : 100 % × (제어 칩 I를 - 처리 칩 Ⅰ) / I 계산 된 형광 강도이다 (제어 칩 I).
  9. 제거 효율과 표준 편차 평균을 구합니다. 에 사용각각의 경우에 대해 최소 4 칩입니다.

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Representative Results

CO 2 에어로졸은 P.을 제거하는 데 사용 된 푸티은 SUS304 표면 (그림 1)에서 생물막. 표면의 대부분은 성장의 24 시간 후, 바이오 필름으로 덮여 있었다. 생물막의 대부분은 CO 2 에어로졸 (도 2)를 이용하여 제거 하였다. 예상대로,도 3은 증가 CO 2 에어로졸 처리 시간 등의 생물막 제거 효율의 증가를 나타낸다. 88 초의 처리 시간의 경우, 제거 효율은 97.74 %와 함께 각각 질소 퍼지없이 98.29 %로 높은 것으로 측정되었다. 공기 온도가 23 ~ 24 °의 C이고 세정 실험을 수행했을 때의 상대 습도는 26~50%이었다.

그림 1
CO 2 에어로졸을 이용하여 바이오 필름의 제거를 나타내는도 1 회로도. 에어로졸이 생성된다 고압 CO2 가스는 단열 벤츄리 노즐 (0.4 mm)를 통해 팽창 가스의 온도가 급격히 떨어질 때. 이러한 고속 CO 2 에어로졸은 생물막 피복 표면에 적용된다. 질소 퍼지를 사용하는 경우, N 2 가스가 중앙 CO 2 노즐을 둘러싼 8 개의 노즐을 통해 공급된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
24 시간 성장 P. 그림 2. 형광 현미경 이미지 304 스테인레스 스틸 칩 푸티 생물막이. 칩 질소 퍼지없이 CO 2 가지 처리 회 에어로졸 (0, 16, 40, 88 초)으로 처리 하였다. 단색 화상을 녹색으로하고, 하얀 스케일 바는 50㎛의를 나타낸다.추신 : //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
P. 그림 3. 제거 효율 와 질소 퍼지없이 다른 CO 2 에어로졸 치료 시간을 가진 304 스테인레스 강 표면의 바이오 필름은 푸티. 제거 효율은 생물막의 형광 강도에 기초하여 산출 하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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