Ein Rapid-Laser Probing Verfahren erleichtert die Nicht-invasive und berührungslose Bestimmung der Blatt Thermische Eigenschaften

Biochemistry

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Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Wehner, M. A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties. J. Vis. Exp. (119), e54835, doi:10.3791/54835 (2017).

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Abstract

Pflanzen können wertvolle Substanzen wie sekundäre Stoffwechselprodukte und rekombinante Proteine ​​produzieren. Die Reinigung des letzteren aus pflanzlicher Biomasse kann durch Wärmebehandlung (Blanchieren) rationalisiert werden. A Blanchierens Vorrichtung kann genauer gestaltet werden , wenn die thermischen Eigenschaften der Blätter im Detail, dh der spezifischen Wärmekapazität und der Wärmeleitfähigkeit bekannt sind. Die Messung dieser Eigenschaften ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv und erfordert in der Regel invasive Methoden, die die Probe direkt in Verbindung. Dies kann die Produktausbeute verringern und kann mit Contain Anforderungen, zum Beispiel im Rahmen der guten Herstellungspraxis unvereinbar. Um diese Probleme anzugehen, eine nicht-invasive, berührungslose Verfahren entwickelt, dass die spezifische Wärmekapazität und der Wärmeleitfähigkeit eines intakten Pflanzenblatt in etwa einer Minute bestimmt. Das Verfahren beinhaltet die Anwendung eines kurzen Laserimpuls von definierter Länge und Intensität auf einen kleinen Bereich derBlattprobe, um einen Temperaturanstieg verursacht, der einen nahen Infrarotsensor gemessen wird. Die Temperaturerhöhung wird mit bekannten Blatteigenschaften (Dicke und Dichte) kombiniert, um die spezifische Wärmekapazität zu bestimmen. Die Wärmeleitfähigkeit wird dann basierend auf dem Profil des anschließenden Temperaturabfalls berechnet, Wärmestrahlung und konvektive Wärmeübertragung berücksichtigt wird. Die dazugehörigen Berechnungen und kritische Aspekte der Handhabung der Proben werden diskutiert.

Introduction

Die groß angelegte Verarbeitung von biologischen Materialien erfordert häufig Wärmebehandlungsschritte wie Pasteurisierung. Die Ausrüstung für solche Verfahren kann genauer gestaltet werden , wenn die thermischen Eigenschaften der biologischen Materialien gut charakterisiert sind, einschließlich der spezifischen Wärmekapazität (C p, s) und der Wärmeleitfähigkeit (λ). Diese Parameter können leicht für Flüssigkeiten, Suspensionen und Homogenate von 1 Kalorimetrie bestimmt werden. Allerdings Messung solcher Parameter in festen Proben können arbeitsintensiv sein und erfordert oft einen direkten Kontakt mit der Probe oder sogar die Zerstörung 2. Beispielsweise erfordern Lichtwärmeumsetzmaterial Techniken direkten Kontakt zwischen der Probe und dem Detektor 3. Solche Einschränkungen sind während der Lebensmittelverarbeitung akzeptabel, aber mit stark regulierten Prozesse wie die Produktion von biopharmazeutischen Proteinen in Pflanzen im Rahmen der guten Herstellungs unvereinbar sind Praxis 4. ichn einem solchen Kontext wiederholt (beispielsweise wöchentlich) Überwachung der thermischen Eigenschaften kann während einer siebenwöchigen Wachstumsperiode für einzelne Pflanzen als Qualitätskontrollwerkzeug erforderlich. Wenn eine solche Überwachung erfordern würde und verbrauchen ein Blatt für jede Messung, gäbe es keine Biomasse übrig bleiben zum Zeitpunkt der Ernte verarbeitet werden.

Zusätzlich nur mit Blattteilen anstatt auf die Pflanze Verwundung und das Risiko einer Nekrose oder Pathogeninfektion erhöhen würde dazu führen, was wiederum die Prozessausbeute verringert. Die Wahrscheinlichkeit der Pathogen-Infektion kann auch erhöhen, wenn ein Verfahren mit direktem Kontakt zu der Probe verwendet werden würde, zu induzieren, das Risiko, dass eine gesamte Charge von Pflanzen kann mit einem kontaminierten Sensoreinrichtung durch Kontakt infiziert werden. Ähnliche Aspekte müssen berücksichtigt werden für die Überwachung der Anlage , wie Dürre betont, zum Beispiel in einem ökophysiologische Kontext. Beispielsweise wird der Wasserverlust oft durch eine Änderung in der frischen Biomasse überwacht, die ein invasives tre erfordertatment der Pflanzen untersuchten 5, beispielsweise ein Blatt sezieren. Stattdessen wird die spezifische Wärmekapazität zu bestimmen, die auf der Wassergehalt einer Probe, wie hier beschreiben, in einem nicht-invasive Art und Weise abhängt, kann als Surrogatparameter für den Hydratationsstatus von Anlagen verwendet werden. In beiden Szenarien (pharmazeutische Produktion und Ökophysiologie), induzierte künstliche Spannungen, die durch destruktive oder invasive Messtechniken wäre schädlich, da sie die experimentellen Daten verzerren können. Daher zuvor berichtet Blitzverfahren 6 oder die Platzierung von Proben zwischen Silberplatten 7 sind ungeeignet für solche Verfahren und Experimente , weil sie entweder einen direkten Kontakt zu der Probe erfordern oder zerstörend sind. Die Parameter c p, s und λ müssen, um die Ausrüstung für eine blanchiert Schritt zu entwerfen bestimmt werden , die Produktreinigung vereinfachen und somit die Herstellungskosten 8-10 reduzieren. Sowohl cp, s und λ kann nun schnell durch berührungslose zerstörungs nahen Infrarot (NIR) Laser in konsistenter und reproduzierbarer Weise Sondieren 11 bestimmt werden und dieses neue Verfahren wird im Detail nachstehend erläutert. Die Ergebnisse mit diesem Verfahren erhalten wurden , wurden erfolgreich eingesetzt , die Wärmeübertragung zu simulieren , in Tabak 12 verlässt, so dass die Gestaltung geeigneter Verarbeitungsgeräte und die Auswahl der Parameter, wie die Blanchierung Temperatur entspricht.

Das Verfahren ist einfach einzurichten (Abbildung 1) und hat zwei Phasen, Messung und Analyse, von denen jede zwei wichtige Schritte umfasst. In der Messphase wird zunächst eine Blattprobe lokal durch einen kurzen Laserpuls aufgeheizt und die maximale Probentemperatur aufgezeichnet. Das Temperaturprofil der Probe wird dann für eine Dauer von 50 s aufgezeichnet. In der Analysephase Blatteigenschaften wie Dichte (leicht und genau durch pyknometrische Measurem bestimmtent) mit dem maximalen Probentemperatur kombiniert c p, s berechnen. Im zweiten Schritt wird die Blatttemperaturprofil als Eingang für eine Energiebilanzgleichung unter Wärmeleitung, Konvektion und Strahlung in Betracht, verwendet λ zu berechnen.

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen sind im Protokollabschnitt, der an dem Inhalt des zugehörigen Video erweitert. Typische Messungen werden dann im Ergebnisteil gezeigt. Schließlich werden die Vorteile und Grenzen des Verfahrens sind, zusammen mit potenziellen Verbesserungen und weitere Anwendungen in der Diskussion Abschnitt hervorgehoben.

Abbildung 1
Abbildung 1: Verwendetes Gerät Blatt thermischen Eigenschaften zu bestimmen. A. Fotografie der Messvorrichtung verwendet, um die spezifische Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit von le zu bestimmenAves. Die Peripheriegeräte (Computer, Oszilloskop) sind nicht gezeigt. B. Schematische Darstellung der Messvorrichtung. Der Laser und die angeschlossenen Geräte in Rot markiert sind, wird der NIR-Detektor für die Temperaturmessung in lila dargestellt, ist die Blattprobe grün und die Photodiode Leistungssensor ist blau. C. Zeichnung der Elemente des Messaufbaus mit dem gleichen Farbcode wie in B. Die Größe Balken zeigt 0,1 m. D. Screenshot illustriert die typischen Elemente der Lasersteuerungssoftware. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protocol

1. Pflanzenbau und Probenvorbereitung

  1. Schreibt jede Mineralwolle-Block mit 1-2 l entsalztem Wasser und anschließend mit 1 l von 0,1% [m / v] Düngemittellösung. Legen Sie ein Tabak (Nicotiana tabacum oder N. benthamiana) Samen in jedem Block und sanft bündig mit 0,25 l Düngerlösung ohne den Samen Waschen entfernt.
  2. Pflegen Sie die Pflanzen für 7 Wochen in einem Gewächshaus oder Phytotron mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit, eine 16-h - Photoperiode (180 & mgr; mol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) und einem 25/22 ° C Hell / Dunkel - Temperatur Regime.
  3. Verschieben Sie die Pflanzen an der Messvorrichtung. Wenn die Pflanzen sind unbeweglich, Ernte Einzelblätter für die Messung der thermischen Eigenschaften.

2. Bestimmen Sie Blatt Dicke und Dichte

  1. Bestimmen Sie die Blattdicke
    1. Vorbereiten eines 2% [m / v] Agarose-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) undAutoklaven es. Lassen Sie die Lösung abkühlen auf 40 ° C und betten eine Blattprobe in einer Petrischale gelegt. Verfestigen der Agarose von der Petrischale platziert für 30 min in einem Kühlschrank bei 4 ° C.
    2. Schneiden Sie die Agarose-Block in 200 & mgr; m Scheiben ein Vibratom mit einer Rasierklinge Schnittwinkel von 15 ° verwendet wird. Verwenden einer Schneidgeschwindigkeit von 1,0 mm s -1 und einer Amplitude von 0,5 mm.
    3. Mount fünf transversal Blattstücke auf einem Glasobjektträger unter Verwendung von Cyanacrylat als Fixateur. Bestimmen Sie die Blattdicke unter einem Mikroskop mit einem 20 × Objektiv und einem Okular mit 10-facher Vergrößerung, mit Hilfe der Messwerkzeuge in die Mikroskop-Software gebaut nach den Anweisungen des Herstellers.
    4. Bestimmen Sie die Blattdicken in Probenbereiche ohne Adern.
    5. Alternativ bestimmen die Blattdicke mit einem Zifferblatt-Gauge in eine Vene freien Bereich der Blattspreite. Sicherstellen, dass das Zifferblatt-gauge senkrecht zur Ebene der Blattspreite gehalten.
      CAUTION: Cyanacrylat ist hautreizend und kann auch die Finger zusammenkleben, wenn nicht mit Sorgfalt behandelt.
  2. Bestimmen Sie die Blattdichte
    1. Bestimmen Sie die Leermasse (m 0) eines trockenen Pyknometers, dann mit Wasser füllen und zu bestimmen , um die Masse wieder (m 1). Trocknen Sie die Pyknometer vollständig, legen Sie ein Blatt innerhalb und bestimmen die Masse (m 2) noch einmal. Mit dem Blatt nach innen, füllen Das Pyknometer wird mit Wasser und Bestimmung der Masse (m 3).
    2. Berechnen Sie die Blattdichte (Ps) unter Verwendung der Gleichung 1.
      Gleichung 1: Gleichung

3. Bestimmen Sie die spektrale Transmission und Reflexion der Blätter

  1. Legen Sie ein Blatt in der Probenkammer eines UV / VIS-Spektrophotometer, indem sie zwischen Probe-Halteklammern fixieren. Für die Übertragung Messungen die Blatt vor dem det ector. Für Reflexionsmessungen legen Sie das Blatt an der Rückseite der Detektionskammer.
  2. Starten Sie das Spektralphotometer Steuerungssoftware. Wählen Sie ein Spektrum von 900 nm bis 1600 nm. Starten Sie einen neuen Scan und notieren Sie die Werte für die Übertragung T) und Reflexion R) angezeigt durch UV / VIS - Spektrophotometer - Software, basierend auf der spektralen Kurve.
  3. Führen Sie alle Messungen mit mindestens drei biologischen Replikaten. Erhöhen der Anzahl der biologischen Replikaten auf fünf oder mehr , wenn ein heterogenes Probenqualität erwartet werden kann, dh Variation in Blattoberflächenmorphologie und Dicke.
  4. Berechnen der Leistung für die Übertragung (P T) und Reflexion (P R) von den gemessenen μ T oder R μ Werte multipliziert mit der gemessenen Laserleistung P Laser gemäß den Gleichungen 2 und 3.
    Gleichung 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
    Gleichung 3: Gleichung
    HINWEIS: Die Übertragung kann auch mit einem Photodiodensensor während der Messung (siehe 6.3) bestimmt werden.

4. Die Messvorrichtung einrichten

  1. Montieren eines fasergekoppelten Einzel bar NIR-Diodenlaser (Wellenlänge = 1,550 nm) in einem 25,4-mm-Durchmesser Kegel auf einem Edelstahlhalter. Schließen Sie einen Regler die Ausgangsleistung (P Laser) des NIR - Laser 4-6 W. einstellen
  2. Legen Sie eine bi-konvexe Linse mit einer Brennweite von 25,4 mm am Ende des Kegels, die Strahlbreite auf 13 mm einzustellen.
  3. Setzen Sie eine Fotodiode Leistungssensor 354 mm unterhalb der Unterseite der Linse. Dann dämpfen die Photodiode durch einen Neutraldichtefilter mit einer optischen Dichte von 1,0 platzieren und einen 22 mm-Keramikschicht über dem Sensor.
  4. Schließen Sie die Photodiode Leistungssensor mit einem Oszilloskop ein Koaxialkabel.
  5. Verbindenein 10 x 10 cm Rahmen, der eine 6 × 6 cm Probenbelichtungsbereich mit dem Gerüst des Messaufbaus in einer Höhe von 308 mm unterhalb der Linse (1) hat. Befestigen Sie das Blatt Position im Raum, indem sie in den 10 x 10 cm Rahmenmontage.
  6. Schließen Sie einen NIR-Detektor mit einem Personalcomputer einen Universal Serial Bus (USB) Kabel und die Software-Schnittstelle für den Detektor installieren.
  7. Platzieren Sie den Detektor in einem 45 ° Winkel zu dem Laserstrahl 135 mm über der Keramikschicht. Richten den Messbereich des Detektors zu dem Laserflecks auf der Probe durch Variation der Sensorposition und der Winkel, bis die maximale Temperatursignal beobachtet wird.
  8. Verwenden, um die Laser-Steuerschnittstellen-Software die Ausgangslaserleistung 5 W und die Dauer des Laserimpulses auf 0,5 s einzustellen. Wählen Sie die "Stromregelung" Befehl in der Steuerungsoptionen Fenster unterhalb der grafischen Darstellung der Laserleistung und stellen Sie die Laserleistung von "5" in den & # eingeben34; Leistung [W] ". Feld Stellen Sie die Laserpulsdauer durch Eingabe von" 0,5 "in die" Zeit [s] "ein.
  9. Um die absolute Laserleistung für jeden Satz von Experimenten bestimmen, ersetzen Sie die Fotodiode Leistungssensor mit einer thermischen Flächenabsorber Leistungssensor am Ende eines jeden Satzes von Experimenten und messen die Laserausgangsleistung für 20 s ohne Probe.

5. Bereiten Sie die Blattproben

  1. Verwenden Sie intakt und unbeschädigte Blätter für die Messungen.
  2. Falls für die Untersuchung, imitieren typische Arten Blattschäden durch das Blatt mit einem Skalpell Piercing, reibt das Blatt zwischen Latex-Handschuhe, Aussetzen des Blattes in eine offene Flamme oder ein Laserstrahl für 2-3 s oder andere Techniken verwenden, um andere zu simulieren Arten von Schäden.
  3. Vorsichtig aber schnell die Blattprobe zwischen Probe-Halteklammern befestigen.

6. Nehmen Sie die Temperaturmessung

  1. Vermeiden Sie den direkten Kontakt zwischen dem Blatt und der KeramikDämpfungsglied über der Photodiode Sensor platziert künstliche Wärmeübertragung zu verhindern , die mit der Berechnung von c p, s und λ (siehe Abschnitt 9) stört.
  2. Verwenden, um die Temperaturmessung Software das Temperaturprofil der Blattprobe für insgesamt 60 s über den NIR-Detektor zu sammeln. Zunächst wird die Temperatur Grundlage für 10 s aufzuzeichnen, dann aktivieren Sie den Laser für 0,5 s und die Datensammlung für 49,5 s weiter.
    1. Starten Sie eine Messung durch "Messen" und dann "New Measurement" klicken. Danach klicken Sie auf den grünen Pfeil über der grafischen Darstellung des thermischen Profils. Speichern Sie das Temperaturprofil, indem Sie auf das Symbol "Speichern" klicken (eine stilisierte Platte) über die grafische Darstellung des Profils.
  3. Bestätigen Sie die übertragenen Laserleistung mit Hilfe der Photodiode Leistungssensor durch die Differenz in der Signal für Messungen mit der Berechnung und ohne Blattprobe mit einem Oszilloskop verbundenan die Photodiode Leistungssensor über ein Koaxialkabel (Abbildung 2).
    1. Bestimmen die Höhe der beiden Flanken (f 1, f 2 S und, S) in dem Spannungsverlauf mit dem Oszilloskop erfasst.
    2. Wiederholen Sie die Messung ohne Blattprobe als Referenz (f 1,0 und f 2,0). Berechnen Übertragungs μ T als das Verhältnis dieser Messungen gemäß Gleichung 4 (siehe auch 2).
      Gleichung 4: Gleichung

Figur 2
Abbildung 2: Messblatt Übertragung einer Photodiode Stromsensor. A. Typische Spannungsprofil für einen Referenzversuch ohne eine Blattprobe visualisiert mit einem Oszilloskop. B. Spannungsprofilmit einer Blattprobe in der Vorrichtung montiert. In beiden Fällen ist die transmittierte Laserleistung auf jeder der beiden Flanken proportional. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7. Berechnen Sie die spezifische Wärmekapazität des Blattprobe

  1. Berechne die maximale Temperaturdifferenz & Delta; T [K] während des Laserpulses durch die Raumtemperatur T Subtrahieren 0 [K] aus dem maximalen Blatttemperatur T ma x [K] (Gleichung 5).
    Gleichung 5: Gleichung
  2. Berechne die durch eine Blatt absorbierte Energie (E S [J]) basierend auf der effektiven Laserleistung und Laserpulsdauer (Gleichung 6), wobei P R [W] ist das reflektierte Laserleistung und P T [W] ist das übertragene Laser Power.
    Equation 6: Gleichung
  3. Berechnen der Masse des erhitzten Blattfläche (m S [kg]) unter Verwendung von Gleichung 7, wobei d S [m] ist die Blattdicke nach 2.1), r Laser [m] der Radius des Laserflecks, V S [ m 3] die erhitzte Blattvolumen und ρ S [kg m -3] ist die Blattdichte gemäß 2.2).
    Gleichung 7: Gleichung
  4. Berechnen c p, s [J kg -1 K -1] nach Gleichung 8 durch die absorbierte Energie E S dividiert durch das Produkt aus der erhitzten Blattfläche Masse m S und die maximale Temperaturdifferenz & Delta; T.
    Gleichung 8: Gleichung

8. Bereiten Sie die Temperaturprofildaten für ThermBerechnungen al Leitfähigkeit

  1. Verwenden Sie den Befehl "Export" der NIR-Sensor Control Software, die Zeit und die Temperatur Rohdaten als * .dat-Datei und öffnen Sie die Datei in einem Tabellenkalkulationsprozessor zu exportieren.
  2. Anwenden 1: 100 Datenreduktion, beispielsweise unter Verwendung eines "IF (MOD (Value; 100) = 0;" x "," 0 ")" -Befehl, was zu einer Datendichte von einem Datenpunkt pro 0,1 s.
  3. Berechne den Mittelwert T B Basistemperatur [° C] für jeden Temperaturprofil über den ersten 10 s einer Messung, während der der Laser noch ausgeschaltet war. Dann berechnet man die Differenz zwischen T B und der tatsächlichen Umgebungstemperatur T 0 [° C].
  4. Verwenden Sie diese Differenz individuell jedes Profil normalisieren , indem sie in Richtung T 0 (y-Normalisierung) verschoben wird , zB wenn T B - T 0 = 2,0 K, subtrahieren dann 2,0 K von jedem Temperaturwert im Temperatur profile (3A).
  5. Normalisieren der Zeitkoordinate jedes Temperaturprofil (x-Normalisierung) von jedem Datenpunkt , bevor die maximale Probentemperatur (T max) zu löschen , und weisen neue Zeitwerte bei t = 0 für T max (3B).
  6. Bildschirm jedes Profil für plötzliche Temperaturverschiebungen, dh Temperaturunterschiede , die mehr als das Dreifache der Grundrauschpegel sind, die typischerweise 3 × 0,31 K ≈ 1,0 K. diese Regionen aus dem Datensatz entfernen , weil sie entsprechen Artefakte Messung (3C ).
  7. Setzen Sie einen exponentiellen Abfall - Funktion (Gleichung 9) auf die Daten einer Tabelle Prozessor, wobei T t [K] ist die Einbaublattprobentemperatur zum Zeitpunkt t [s], 0 T die Umgebungstemperatur, A [K] wird die Amplitude und t 1 [s] die Zerfallskonstante (Abbildung3D).
    Gleichung 9: Gleichung
  8. Verwenden Sie die Funktion ausgestattet, die Temperatur Rückgang der Blattprobe 0-80 s nach dem Laserpuls zu berechnen.
  9. Verwandeln Sie die Temperaturdaten gemessen in [° C] in die [K] Maßstab durch einen Wert von 273,15 jeder Temperaturdatenpunkt Hinzufügen (Abbildung 3E).

Figur 3
Abbildung 3: Datenverarbeitungsschema für die Berechnung von λ. A. Nach der Datenreduktion, sind die Temperaturprofile auf die Umgebungstemperatur normalisiert. B. Als nächstes entfernt werden alle Datenpunkte , bevor die maximale Probentemperatur (T max). C. Messartefakte (in der "inkonsistent" Datensatz gezeigt) auf Temperatur identifiziert basierend verschiebt größer als threie fache der Basislinienrauschen und aus dem Datensatz vor der Montage einer Exponentialfunktion entfernt. D. Die Celsius-Temperaturskala ist in der Kelvin-Skala umgewandelt. E. Für jedes Zeitintervall wird λ berechnet basierend auf dem Temperaturprofil. F. Ein Fenster von 20 s, bei der eine relevante Temperaturänderung definiert beobachtet werden kann. G. Basierend auf der ausgewählten Zeitfenster werden der Mittelwert und die Standardabweichung für λ berechnet. H. Repräsentative Ergebnisse für zwei verschiedene N. tabacum Blattproben. Orange Pfeilen und Linien zeigen die Wirkung des entsprechenden Verarbeitungsschritts auf den vorgestellten Daten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

9. Berechnung der Wärmeleitfähigkeit des Blattprobe

  1. Berechnen Sie die Temperatur difference zwischen der Blattprobe und der Umgebung für jeden 0,1-s - Intervall gemäß Gleichung 10, wobei & Delta; T x [K] ist die Temperaturdifferenz, T t [° C] ist die Einbaublattprobentemperatur und T 0 [° C] die Umgebungstemperatur (Figur 3E).
    Gleichung 10: Gleichung
  2. Es sei angenommen, dass der Rückgang der Temperatur auf die kombinierte Wirkung der konvektive Wärmeübertragung, Wärmestrahlung und Wärmeleitung zurückzuführen ist. Verwenden , um die entsprechende Energiebilanz (Gleichung 11) als Grundlage für die Berechnung von λ, wobei & Delta; E Temp [J] ist der Unterschied in der Wärmeenergie der Probe bei zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten & Delta; E rad [J] ist die Energiedifferenz durch Wärmestrahlung, ist & Delta; E conv [J] die Energiedifferenz durch konvektive Wärmeübertragung und Δ; E cond [J] ist die Energiedifferenz aufgrund der Wärmeleitung.
    Gleichung 11: Gleichung
  3. Ersetzen Sie die Allgemeinen Geschäfts in der Energiebilanz mit den tatsächlichen Eigenschaften physikalischen Gleichung ergibt 12, wobei & Delta; T t [K] ist der Unterschied in Einbaublattprobentemperatur, ε der einheitslose Emissivität, σ [kg s -3 K -4] die Stefan -Boltzmann konstante, A rad [m 2] der Bereich der Wärmestrahlung, h [J s -1 m -2 K -1] die Konvektionswärmeübergangskoeffizienten, A CONV [m 2] der Bereich der konvektiven Wärmeübertragung, A cond [m 2] der Bereich der Wärmeleitung und l [m] der charakteristischen Länge.
    Gleichung 12:
    Gleichung
  4. Berechnen Sie die characteristic Länge l basierend auf der Korrelation: L = V / A.
  5. Verwenden des erhitzten V S Probenvolumen und die Querschnittsfläche der Blattprobe A [m 2] zu berechnen. Die Querschnittsblattfläche entspricht A cond nach Gleichung 13, wobei A cond ist das Gebiet , wo Leitungs auftritt, r Laser ist der Radius des Laserflecks und d s die Blattdicke.
    Gleichung 13: Gleichung
  6. Berechnen Sie eine Rad - und A konv gemäß Gleichung 14, wobei ein Laser die Fläche des Laserspots ist.
    Gleichung 14: Gleichung
  7. Substitute Gleichungen 9, 12 und 13 in die Gleichung 11 und die letztere für λ zu lösen, wodurch man 15 Equation wo t t Laser ister Laserpulsdauer [s].
    Gleichung 15:
    Gleichung
  8. Angenommen , ein Wert von 0,94 für ε und berechnen λ für jede 0,1-s Zeitintervall in den ersten 20 s des Temperaturprofils. Der Mittelwert der 200 Werte für λ auf diese Weise erhalten und berechnen Sie die Standardabweichung (3F - H).

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Representative Results

Die Messung der Blatteigenschaften

Unter Verwendung der obigen mikroskopischen Methode, eine Blattdicke von 0,22 bis 0,29 × 10 - 3 m wurde für beide N. tabacum (0,25 ± 0,04 × 10 - 3 m, n = 33) bestimmt und N. benthamiana (0,26 ± 0,02 × 10 - 3 m, n = 24), die innerhalb der 0,20 bis 0,33 × 10 gut ist - 3 m Bereich zuvor für die Blätter der verschiedenen Pflanzenarten berichtet 3. Bestimmen der Dicke mit einem Zifferblatt-gauge ergaben Werte von ~ 0,28 × 10-3 m (n = 10), die innerhalb einer Standardabweichung der Ergebnisse der mikroskopischen Messung war. Somit kann die Wahlspurmessung über den mikroskopischen Verfahren zur Dickenbestimmung in Routineanwendungen bevorzugt werden, da es leichter war, zu übernehmen unddie Ergebnisse für c p, s und ʎ abgewichen weniger als 10% von der arbeitsintensiven Technik. Die Dichte von N. tabacum und N. benthamiana Blätter betrug 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), die die 631-918 kg m entspricht - 3 Bereich bisher 3 für Blätter in anderen Spezies berichtet.

Berechnung der spezifischen Wärmekapazität

Temperaturprofile gesammelt für Nicotiana - Spezies zeigte einen raschen Anstieg über die Zeit des Laserpulses , bis die maximale Temperatur (T max) innerhalb von weniger als 1 s erreicht. Nach dem Puls verringert die Temperatur exponentiell , bis es die Umgebungstemperatur erreicht (T 0) (3A - E). Die spezifische Wärmekapazität (C p, s -1 K -1 für N. tabacum und 2252 ± 285 J kg -1 K -1 für N. benthamiana. Zwei Anbau Einstellungen und Dauern wurden für jede verwendet Arten (siehe Abschnitt 1.2) , aber dies beeinflussen c p nicht, s (Abbildung 4). Jedoch verringerte die C p, s - Werte linear von der alten (unten) , um junge (oben) Blätter (R 2 = 0,85) im Falle von N. tabacum (4A), die dem Wassergehalt korreliert [gg -1 Biomasse] , die als Differenz von feuchter Biomasse zum Zeitpunkt der Ernte und die Masse nach 72 - stündiger Inkubation bei 60 ° C 11 bestimmt worden war. Dieser Zusammenhang zwischen Wassergehalt und die spezifische Wärmekapazität war in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen von anderen Autoren 13. Eine inverse Korrelation wurde für N. benthamia beobachtetna (R 2 = 0,79), wobei der Unterschied zwischen den spezifischen Wärmekapazitäten von Blättern unterschiedlicher Reifegrade (unten = alt; top = Young) nur 13% waren im Vergleich zu 21% bei N. tabacum. Dieser Unterschied kann in der Tatsache stammen , dass der Wassergehalt in den Blättern von N. benthamiana über die verschiedenen Grade der Blatt Reifung 11 nahezu konstant ist. Eine Sensitivitätsanalyse ergab , dass Unterschiede in der c p, s zu Schwankungen der Messparameter in Gleichung 8 Der Effekt der reflektierten und transmittierten Laserleistung war Teil proportional, proportional waren , da diese Parameter nicht einzelne Faktoren in Gleichung waren 7. Dementsprechend die Wirkung von Fehlern in diesen beiden Parametern kleiner war als diejenigen, die durch Schwankungen in der Laserleistung oder der Umgebungstemperatur verursacht werden. Im allgemeinen wurde die Messung robust zu sein betrachtet , da alle Parameter in der Berechnung von c p beteiligt, hatte einen Koeffizienten sAbweichung von weniger als 10% (4C und D).

Abbildung 4
Abbildung 4: Spezifische Wärmekapazität und thermische Leitfähigkeitswerte von N. tabacum und N. benthamiana bestimmt. A. Spezifische Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit von N. tabacum verlässt nach der Blattstellung an der Pflanze (unten = alte Blätter, Mitte = reifen Blätter, oben = junge Blätter). Sterne und Dreiecke zeigen Pflanzen, die 49 und 56 Tage alt, beziehungsweise waren. B. Spezifische Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit von N. benthamiana - Blätter nach der Blattposition auf der Pflanze. Sterne und Dreiecke zeigen Pflanzen, die in einem Phytotron oder Gewächshaus kultiviert wurden, respectively. C. Empfindlichkeit der spezifischen Wärmekapazitätswerte auf Änderungen in den Eingangsparametern. Triangles zeigen spezifische Werte Wärmekapazität von einem Anstieg von 10% aufweist (Rot, nach oben) oder zu verringern (blau, unten) in einzelnen Modellparameter. D. Empfindlichkeit der Wärmeleitfähigkeitswerte auf Änderungen in den Eingangsparametern. Triangles markieren Wärmeleitfähigkeitswerte Schuh von einem Anstieg von 10% (rot, nach oben) oder zu verringern (blau, unten) in einzelnen Modell resultierenden Parameter. Die Fehlerbalken in A und B zeigen die Standardabweichung (n ≥ 3), während in C und D sie das komplette Spektrum der erhaltenen Werte bei 10% Variation Sensitivitätsanalyse darstellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Berechnung der Wärmeleitfähigkeit

Die Wärmeleitfähigkeit (ʎ) wurde aus den Temperaturprofile durch exponentielle berechnetFitting (3) mit den Gleichungen kombiniert für konduktive und konvektive Wärmeübertragung als auch Wärmestrahlung. Gleichung 15 ergibt Durchschnittswerte von 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) für N. tabacum und 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) für N. benthamiana. Es gab keine Korrelation zwischen ʎ und Pflanzenalter oder Kultivierungs Einstellung obwohl eine Korrelation zwischen dem Alter und der Blatt ʎ für N. benthamiana (4B) beobachtet wurde, mit den zuvor berichteten altersabhängigen Unterschiede in anderen Pflanzenarten vereinbaren 14. Wie oben besprochen, war der Wassergehalt ein unwahrscheinlicher Grund für diesen Unterschied wie es in Blätter für N. benthamiana unterschiedlicher Reife zu sein homogen gefunden. Stattdessen spekulieren wir, dass Änderungen in der lEAF - Gewebe, beispielsweise die Zusammensetzung Zellwand, waren für diese Beobachtung verantwortlich , indem sie die Wärmeübertragungseigenschaften der Blätter zu verändern und so den Wert des ʎ beeinflussen. Die Bestimmung von ʎ war empfindlich gegenüber Änderungen in der Umgebungstemperatur. Eine Sensitivitätsanalyse ergab, dass Schwankungen von ± 2,3 K den Wert von ʎ von 64-125% verändert. Nach Gleichung 15 hat die Umgebungstemperatur einen Effekt durch die Kraft von vier auf die Wärmestrahlung und damit wirkt sich direkt auf den Wert von ʎ.

Auswertung der Messvorrichtung

Es war möglich, die Messanordnung innerhalb von 3 h einzurichten. Sobald dies abgeschlossen ist, die Anlaufzeit des Systems betrug etwa 15 min pro Messreihe. Einzelne Messungen dauerte weniger als 3 min, einschließlich Probenvorbereitung und den gesamten Messzyklus. Analyse des zeitlichen Laserbelichtung ergeben, dass einErhitzungszeit von 0,5 s in Folge einer Temperaturerhöhung von 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) war der beste Kompromiß zwischen der hohen & Delta; T (erreicht durch lange Laserpulse) , die für ein gutes Signal-Rausch - Verhältnis (SNR) und die niedrige AT (durch kurze Laserpulse erreicht) erforderlich Gewebeschäden zu vermeiden. Pulsdauern länger als 0,5 s in Folge der Massenverlust der Probe, die wahrscheinlich was die Verdampfung von Wasser und / oder eine Beschädigung des Blattgewebe als die Probentemperatur auf 70 ° C erreicht up, während nur 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) wurden für 0,5 s Laserimpulse beobachtet. Für eine Dauer von weniger als 0,5 s, die Temperatur Rauschen von ± 0,31 K (Standardabweichung, n = 25) einen Anteil von mehr als 5% des AT und war somit ein wesentlicher Teil des AT. Im Gegensatz dazu betrug der Anteil der Lärm bei 0,5 s nur für 2,5% des Signals und wurde somit als unbedeutend angesehen. Darüber hinaus erwärmen sich die Proben auf mehr als ~ 45 ° C nicht nach oben, das isteine Temperatur , die Tabakpflanzen können auch in der natürlichen tropischen bis subtropischen Lebensraum und die schädlich ist nur zu Pflanzenarten in der Tundra Lebensräume 15 gefunden ausgesetzt werden. Die Leistungsdichte des Lasers betrug 170 kW m -2, während natürliche Sonnenstrahlung typischerweise im Bereich von 1,0 bis 1,4 kW m -2 16,17. Aufgrund der sehr kurzen Zeit des Pulses, diese höhere Energiedosis war wahrscheinlich das Blattgewebe nicht beschädigt werden, wie durch einen kürzlich veröffentlichten mikroskopische Analyse 11 angegeben. Die Temperaturdaten verwendet ʎ berechnet wurden nach dem Laserpuls tat, weil nur das Rauschen während dieser Zeit auf den ersten 20 s beschränkt (± 0,31 K) weniger als 5% des Temperatursignals der Probe und wurde somit als unbedeutend angesehen. Wenn die Temperaturdaten von jenseits des Zeitrahmens s 20 verwendet wurden, sanken die Werte berechnet für ʎ (Abbildung 3F). Eine mögliche Erklärung war, dass einige der Annahmenfür die Berechnung der ʎ gemacht nicht für niedrige Werte von & Delta; T anzuwenden. Insbesondere der Begriff thermische Strahlung in Gleichung 15 beschreibt, könnte betroffen sind, wie sie von der vierten Potenz der Temperatur beeinflusst wird. Auch die Blattfläche der Probe vor Ort mit dem Laser ausgesetzt umgebenden könnte leicht erwärmt haben und somit nicht haben könnte die ideale Kühlkörper angenommen im Modell der Verringerung der effektiven AT x und schließlich die berechnete ʎ gewesen.

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Discussion

Die berührungslose, zerstörungsfreie Messung oben beschriebene Verfahren kann verwendet werden , c p, s und ʎ in einer simultanen und reproduzierbar zu bestimmen. Die Berechnung der ʎ insbesondere hängt von mehreren Parametern, die zu Fehlern empfindlich sind. Dennoch war die Wirkung dieser Fehler entweder linear oder Unter proportional, und der Variationskoeffizient für alle Parameter weniger als 10% festgestellt wurde. Obwohl das Verfahren somit als robust angesehen werden können, können einige technische Verbesserungen vorgenommen werden, um die Restfehlerquellen zu reduzieren.

Montage der Probe in die Versammlung war technisch anspruchsvoll, da eine flache Blattoberfläche für die Messung vorzuziehen ist, aber die Probe hat natürlich eine wellige Oberfläche. Dieses Problem könnte durch die Entwicklung eines speziellen Probenhalter mit Geometrien genau eingestellt auf die Blattprobe, beispielsweise Blattdicke und -breite, Einklemmen der Probe in der bevorzugen überwindenLage Orientierung. Dieser Ansatz würde die Messungen besser reproduzierbar zu machen, würde aber die berührungslose Art der Messung durch einen festen Kontakt zwischen der Probe und Halter beeinträchtigen würde die Blattoberfläche flach zu ziehen erforderlich. Die Vorteile dieser Art von Halter verwenden würde daher den Rahmen der Messung abhängig sind , dh ob die Genauigkeit oder berührungslose Art der Messung ist sehr wichtig. Im Gegensatz dazu ist bei allen für Blätter mit einer von Natur aus flachen Oberfläche, zum Beispiel Reis und verwandte Arten möglicherweise nicht notwendig , solche Überlegungen.

Konvektive Wärmeübertragung aufgrund der Luftbewegung in der Umgebung der Probe sollte auf ein Minimum während der Messung gehalten werden , da dies stark die Berechnung von C p, s und wirkt ʎ 18. Das Gerät sollte daher weg von Klimaanlagen, Heizungen oder andere Geräte, wie Computer erzeugt aus Luftströmen angeordnet werden mitintegrierte Kühlventilatoren. Dies ist auch wichtig , da Änderungen in der relativen Wassergehalt der Blätter 19 , die vor oder während der Messung aufgrund von Verdampfung auftreten kann, die 20 durch Luftbewegungen erhöht werden kann, um in dem Modell nicht berücksichtigt wurden. Somit Messungen, insbesondere mit getrennten Blättern sollte schnell im Protokollabschnitt wie beschrieben durchgeführt werden, um Fehler bei der Datenerfassung zu vermeiden. In Zukunft können die Effekte der Verdampfung auf der Messung reduziert oder vermieden werden, wenn die Messung in einem zumindest teilweise geschlossenen Meßkammer mit einer implementierten Feuchtigkeitsregelung durchgeführt wird.

Die Genauigkeit der c p, s und ʎ Werte können in den entsprechenden Gleichungen genauer durch Messung verwendeten Parameter erhöht werden. Im Falle von c p, s Diese Parameter sind die Laserleistung, die maximale und die Umgebungstemperatur und Probenvolumen, dh das Produkt aus laser Spotfläche und Dicke und Probendichte (Gleichung 8). Die beiden letztgenannten Parameter müssen in Versuchen ermittelt werden, um die tatsächliche Messung und ihre Zuverlässigkeit begleiten kann verbessert werden, wenn mehrere repräsentative biologische Replikaten getestet. Doch selbst wenn eine einfache Wahl-Gauge - Messung verwendet wurde, der Unterschied in der Blattdicke im Vergleich zu einer mikroskopischen Analyse betrug nur 11%, was die Werte betroffen berechnet für C p, s und ʎ durch denselben Grad. Im Gegensatz dazu, Temperaturen und Laserleistung kann auf der ganzen Messung überwacht werden. Die Genauigkeit der c p, s kann verbessert werden , wenn diese Online - Daten anstelle von festen Werten für die Laserleistung und der Umgebungstemperatur verwendet werden, und die Daten werden unter Verwendung gut kalibrierten Sensoren gesammelt. Diese Überlegungen gelten auch für ʎ, aber die Umgebungs- und Probentemperaturen sind die wichtigsten Parameter, da sowohl den berechneten Wert durch die Kraft der vier beeinflussen.

Die aktuelle Berechnung von ʎ auf verschiedenen Annahmen in Bezug auf die konvektive Wärmeübertragung und Wärmestrahlung beruht. Zum Beispiel ist die Emissivität (ε) und konvektiven Wärmeübertragungskoeffizienten (h) wurden explizit in der oben dargestellten Verfahrens nicht gemessen oder berechnet werden , sondern wurden aus früheren Publikationen 18,21 abgeleitet. Die Genauigkeit der ʎ könnte daher durch die Bestimmung dieser beiden Parameter unter den tatsächlichen Messbedingungen verbessert werden. Allerdings ergab die Literaturdaten für Berechnungen mit dennoch ʎ Werte , die für die im Bereich für andere Pflanzenarten experimentell bestimmt wurden ähnliche Eigenschaften zu Nicotiana - Arten und ihre Physiologie, dh krautigen Pflanzen 3 aufgrund ihrer Phylogenese zu erwarten. Auch wenn die Werte für ε und h wurden über den gesamten Bereich variiert zuvor für diese Werte in Pflanzen berichtet, beispielsweise von 0,93 bis 0,98 für ε 21, deren Wirkung auf den Endwert von ʎ war <10% und damit innerhalb der natürlichen Variation hier beobachtet.

Die oben dargestellten Verfahrens war nicht nur in der Lage, die thermischen Eigenschaften von intakten unversehrt Blätter und freistehende Blätter, um zu bestimmen, aber es ist auch richtig verschiedene Arten von schwereren Schäden eingeführt absichtlich vor der Messung identifiziert. Daher können verschiedene Arten von Blattproben leicht zu unterscheiden, Bereitstellen eines Werkzeugs zu entfernen, vor der Analyse, alle schlechten Proben, die Daten geringer Qualität ergeben würde. Diese Funktion könnte für die Qualitätskontrolle verwendet werden , wenn biologische Materialien überwachen, zB Proben in Ermangelung Spezifikationen in Form von c p, s zu treffen und ʎ konnte von der weiteren Verarbeitung ausgeschlossen werden. Dies wäre ein Vorteil im Rahmen eines stark regulierten Prozesse wie Molecular Farming 4 sein.

Die Vorteile dieses neuen Verfahrens im Vergleich zu anderen inIn der Literatur sind die schnelle Probenhandhabung, minimaler Vorbereitung, berührungslos und zerstörungsfrei die gleichzeitige Messung von c p, s und ʎ, und die Verwendung gemeinsamer Ausrüstung , die in vielen optischen Labors gefunden werden kann. Dies wird breitere Anwendungen des Verfahrens ermöglichen im Vergleich zu denen erfordert spezialisierte und teure Geräte wie Differential-Scanning-Kalorimeter. Weiterhin calorimetry 22 direkten Kontakt mit der Probe erfordert , so besteht die Gefahr einer Beschädigung, und das Verfahren wird in der Regel auf die Messung der spezifischen Wärmekapazität 22 begrenzt. Im Gegensatz dazu ist während Wärmebild 23 Nekrose oder physikalische Veränderungen in den Blättern oder ganzen Pflanzen in einem berührungsfrei erkennen kann, es erfordert auch komplexe Bildanalyse und gewidmet spezielle Geräte 24 , die in der Zukunft durch billigere und leistungsfähiger IR - Kameras überwunden werden könnten und begleitende Peripheriegeräte. Spektralanalyse ist ein weiterer berührungs free Verfahren zur Analyse des Wassergehalts und Chlorophyll Spiegel 25, aber es wurde die spezifische Wärmekapazität und / oder Wärmeleitfähigkeit noch nicht verwendet zu bestimmen.

Der Messansatz berichtet hier ist ein robustes Verfahren um die thermischen Eigenschaften zu bestimmen, von Pflanzenblättern mit geringen Investitionskosten und kurze Messzeiten. Es wurde erfolgreich zur Bestimmung c p, s und ʎ in N. tabacum und N. benthamiana, zwei Arten verwendet, die im Bereich der molekularen Landwirtschaft 4 relevant sind. Die Werte für beide Parameter berechnet basierend auf Blatttemperaturprofile waren in guter Übereinstimmung mit den zuvor 3 für andere Pflanzenarten berichtet. Das Verfahren ist zerstörungsfrei, berührungsfrei und benötigt keine komplexen Probenvorbereitung, Vorteile gegenüber allen gängigen alternative Methoden für die Analyse der thermischen Eigenschaften. Die einfache Konstruktion kann erleichtern auch die Entwicklung von Hand-held Vorrichtungen Flexibilität zu erhöhen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" tube Thorlabs SM1L10E Tube for fiber holder
Agarose Sigma Aldrich A0701 Agarose
Bi-Convex lense f=25.4 Thorlabs LB1761 Lense
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console Thorlabs PM100D Console for thermal surface absorber sensor
Digital Phosphor Oscilloscope  Tektronix DPO7104 Oscilloscope
DMR light microscope Leica n.a. Light microscope
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-2 Pycnometer
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Fiber holder Thorlabs Fiber holder
Forma -86 °C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Infrared Detector Optris CT Optris OPTCTLT15 Infrared detector
Infrared Detector Software Compact Connect Optris n.a. Control software for infrared detector
Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer PerkinElmer L1050 UV/VIS Spectrophotometer
Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module DILAS M1F-SS2.1 Laser
Laser cover Amtron LM200 Laser Cover
Laser Driver  Amtron CS 408 Laser Driver
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Photodiode sensor  Thorlabs PDA20H-EC Power sensor for transmission measurements
Precision weight Ohaus Analytical Plus Ohaus 80251552 Precision weight
Sample frame Fraunhofer ILT n.a. Fixation of the leaf sample
Software Pyro Control Amtron n.a. Laser Power Control Software
Stainless-steel-holder n.a. n.a. Holder for measurement set-up
Teflon plates 2 cm Fraunhofer ILT n.a. Teflon attenuation
Thermal surface absorber Power sensor Thorlabs S314C Sensor for laser power measurements
Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome
Zoc/Pro 6.51  EmTec Innovative Software n.a. Laser Control Software 

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References

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