En Rapid Laser Sondering Metode Forenkler Non-invasiv og berøringsfri Fastsettelse av Leaf termiske egenskaper

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Wehner, M. A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties. J. Vis. Exp. (119), e54835, doi:10.3791/54835 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Planter kan produsere verdifulle stoffer som for eksempel sekundære metabolitter og rekombinante proteiner. Rensingen av den sistnevnte fra plantebiomasse kan være strømlinjeformet ved varmebehandling (blanche). En blanche apparat kan konstrueres mer presist om de termiske egenskapene til bladene er kjent i detalj, dvs. den spesifikke varmekapasitet og varmeledningsevne. Målingen av disse egenskapene er tidkrevende og arbeidskrevende, og krever vanligvis invasive fremgangsmåter som kommer i kontakt prøven direkte. Dette kan redusere produktutbytte og kan være uforenlig med oppdemning krav, for eksempel, i sammenheng med god framstillingspraksis. For å løse disse problemene, ble en ikke-invasiv, berøringsfri metode utviklet som bestemmer den spesifikke varmekapasitet og varmeledningsevne av en intakt plante blad i omtrent ett minutt. Fremgangsmåten innebærer anvendelse av en kort laserpuls av definert lengde og intensitet til et lite område avblad prøven, noe som forårsaket en temperaturøkning som er målt ved hjelp av en nær infrarød sensor. Temperaturøkningen er kombinert med kjente blad egenskaper (tykkelse og densitet) for å bestemme den spesifikke varmekapasitet. Den termiske ledningsevnen blir deretter beregnet på grunnlag av profilen til den påfølgende temperaturnedgang, tar varmestråling og konvektiv varmeoverføring i betraktning. De tilknyttede beregninger og kritiske aspekter ved prøvehåndtering blir diskutert.

Introduction

Den store behandling av biologisk materiale krever ofte varmebehandlingstrinn som pasteurisering. Utstyr for slike prosesser kan utformes mer presist om de termiske egenskaper hos det biologiske materialet er godt karakterisert, inkludert den spesifikke varmekapasitet (c p, s) og varmeledningsevne (λ). Disse parametrene kan bestemmes lett for væsker, suspensjoner og homogenater av kalorimetri 1. Imidlertid kan måle slike parametre i faste prøver være arbeidskrevende, og krever ofte direkte kontakt med prøven eller til og med ødeleggelse sin 2. For eksempel, fototermiske teknikker krever direkte kontakt mellom prøven og detektoren 3. Slike begrensninger er akseptabelt under prosessering av mat, men er uforenlig med strengt regulerte prosesser som for eksempel produksjon av biofarmasøytiske proteiner i planter i sammenheng med god framstillingspraksis fire. Jegn slik sammenheng kan gjentas (f.eks ukentlig) overvåking av termiske egenskaper være nødvendig i løpet av en syv-ukers vekstperioden for enkeltplanter som et kvalitetskontrollverktøy. Hvis en slik overvåking ville kreve og forbruke et blad for hver måling, ville det ikke være noen biomasse til venstre for å behandle ved tidspunktet for høsting.

I tillegg, ved bruk av bare bladdeler i stedet ville føre til såret til anlegget og øker risikoen for nekrose eller patogen infeksjon, igjen minsker prosessutbyttet. Sannsynligheten for patogen infeksjon kan også øke dersom en metode med direkte kontakt med prøven ville bli brukt, indusering av risikoen for at en hel sats av planter kan være infisert gjennom kontakt med en forurenset sensoranordning. Lignende aspekter må vurderes for overvåking av anlegget streker som tørke, for eksempel i en økofysiologiske sammenheng. For eksempel er vanntapet ofte overvåkes av en endring i fersk biomasse, noe som krever en invasiv treling av plantene under etterforskning 5, f.eks, dissekere et blad. I stedet bestemmelse av spesifikk varmekapasitet, som er avhengig av vanninnholdet i en prøve, i en ikke-invasiv måte som beskrives her, kan benyttes som en surrogatparameter for hydratisering status av planter. I begge scenarier (farmasøytisk produksjon og økofysiologi), ville kunstige påkjenninger forårsaket av destruktive eller invasive måleteknikker være skadelig som de kan forvrenge eksperimentelle data. Derfor tidligere rapportert flash metoder 6 eller plassering av prøvene mellom sølv plater 7 er uegnet for slike prosesser og eksperimenter fordi de enten krever direkte kontakt med prøven eller er ødeleggende. Parametrene c p, s og λ må bestemmes for å utforme prosessutstyret for en forvelling skritt som kan forenkle produkt rensing og dermed redusere produksjonskostnadene 8-10. både cp, s og λ kan nå raskt bestemmes ved kontakt-fri ikke-destruktiv nær infrarød (NIR) laser sentret på en konsekvent og reproduserbar måte 11 og denne nye fremgangsmåten vil bli forklart i detalj nedenfor. Resultatene oppnådd med denne fremgangsmåte resultater ble med hell anvendt for å simulere varmeoverføring i tobakksblader 12, slik at utformingen av passende prosessutstyr og valg av tilsvarende parametre som blancheringstemperaturen.

Fremgangsmåten er enkel å sette opp (figur 1) og har to faser, måling og analyse, som hver omfatter to hovedtrinn. I målefasen blir et blad prøven først oppvarmes lokalt ved en kort laserpuls og den maksimale prøvetemperaturen blir registrert. Temperaturprofilen i prøven blir så registrert i en varighet på 50 sek. I analysefasen, blad egenskaper såsom tetthet (lett og nøyaktig bestemmes ved måling uten pycnometricent) kombineres med den maksimale prøvetemperaturen beregne c p, s. I det andre trinnet blir bladet temperaturprofilen brukes som inngang for en energibalanse ligning, idet det ledning, konveksjon og stråling i betraktning, for å beregne λ.

Detaljerte trinn-for-trinn-instruksjoner gis i protokollen delen, utvide på innholdet i den medfølgende videoen. Typiske målinger blir deretter vist i resultatdelen. Endelig er de fordeler og begrensninger ved metoden fremhevet i diskusjonen delen sammen med potensielle forbedringer og ytterligere anvendelser.

Figur 1
Figur 1: Apparat benyttet for å bestemme blad termiske egenskaper. A. Fotografi av måleapparatet brukes til å bestemme den spesifikke varmekapasitet og varmeledningsevne på leaves. De eksterne enheter (datamaskiner, oscilloskop) er ikke vist. B. Skjematisk fremstilling av måleanordningen. Laseren og tilkoblede utstyret er uthevet i rødt, er NIR detektor for temperaturmåling vist i lilla, er bladet prøve grønn og fotodioden Kraftsensoren er blå. C. Tegning av elementene i måleoppsettet med samme fargekode som i B. Størrelsen linjen viser 0,1 m. D. Skjermdump som viser de typiske elementer av den laser kontrollprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plant Dyrking og Prøvepreparering

  1. Spyle hver mineralull blokk med 1-2 L deionisert vann og deretter med 1 liter 0,1% [m / v] gjødsel-løsning. Plasser en tobakk (tobakksplante eller N. benthamiana) frø i hver blokk og forsiktig flush med 0,25 liter gjødsel løsning uten å vaske bort frø.
  2. Dyrke planter for 7 uker i et drivhus eller fytotron med 70% relativ fuktighet, en 16-timers fotoperiode (180 mikromol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) og en 25/22 ° C lys / mørk temperatur regime.
  3. Flytt plantene til måleapparaturen. Hvis plantene er immobile, høste enkle blader for måling av varmeegenskaper.

2. Bestem Leaf tykkelse og tetthet

  1. Bestem blad tykkelse
    1. Fremstille en 2% [m / v] agarose-løsning i fosfatbufret saltvann (PBS) ogautoklav det. La oppløsningen avkjøles til 40 ° C og legge inn et blad prøve plassert i en petriskål. Størkne agarose ved å plassere petriskål i et kjøleskap ved 4 ° C i 30 minutter.
    2. Kutt agarose blokken i 200-mikrometer skiver ved hjelp av en vibratome med et barberblad skjærevinkel på 15 °. Bruke en skjærehastighet på 1,0 mm s -1 og en amplitude på 0,5 mm.
    3. Mount fem tverrgående blad på en glassplate ved hjelp cyanoacrylate som ingrediens. Bestemme bladtykkelsen under et mikroskop med en 20 x objektiv og et okular med 10 x forstørrelse, ved hjelp av måleverktøy som er integrert inn i mikroskopet programvaren i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Bestem bladtykkelse i utvalgsområder uten årer.
    5. Alternativt, bestemme blad tykkelse med en ekstern måler på en blodåre fritt område av bladet bladet. Kontroller at dial-gauge holdes vinkelrett på planet av bladet bladet.
      CAUTION: Cyanocrylate er hudirriterende og kan også limes fingrene sammen hvis de ikke håndteres med forsiktighet.
  2. Bestem blad tetthet
    1. Bestem tom massen (m 0) av en tørr pyknometer, deretter fylle den med vann og bestemme massen igjen (m 1). Tørk pyknometer helt, plassere et blad inne og bestemme massen (m 2) en gang til. Med bladet inne, omhyggelig fylle opp pyknometer med vann og bestemme massen (m 3).
    2. Beregn blad tetthet (Ps) ved bruk av ligning 1.
      Ligning 1: ligning

3. Bestem Spectral transmisjon og refleksjon av Leaves

  1. Plasser et blad i prøvekammeret av en UV / VIS spektrofotometer ved å feste den mellom sample-holding klemmer. For overføring målinger, plassere bladet foran Fondet Ector. For refleksjonsmålinger plassere bladet på baksiden av deteksjonskammeret.
  2. Start spektrofotometer kontroll programvare. Velg et spekter fra 900 nm til 1600 nm. Start en ny skanning og registrere verdier for overføring T) og refleksjon R) vises av UV / VIS spektrofotometer programvare, basert på den spektrale kurve.
  3. Utføre alle målinger med minst tre biologiske replikater. Øke antallet av biologiske replikater til fem eller mer hvis en heterogen prøve kvalitet kan forventes, dvs. variasjon i bladoverflaten morfologi og tykkelse.
  4. Beregne kraften for overføring (P T) og refleksjonen (P R) ved å multiplisere den målte μ t eller u R-verdiene av den målte lasereffekten P Laser i henhold til ligningene 2 og 3.
    Ligning 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
    Ligning 3: ligning
    MERK: Sendingen kan også bestemmes med en fotodiode sensor under målingen (se 6.3).

4. Sett opp måling apparater

  1. Montere en fiber-koblet enkelt-tverr NIR diode laser (bølgelengde = 1.550 nm) i diameter kjegle 25,4 mm på et rustfritt stålholderen. Koble en kontroller for å sette utgangseffekt (P Laser) av NIR laser til 4-6 W.
  2. Plasser en bi-konveks linse med en brennvidde på 25,4 mm ved enden av kjeglen for å justere strålebredde til 13 mm.
  3. Plassere en fotodiode kraftsensor 354 mm under bunnen av linsen. Deretter dempe fotodioden ved å plassere et nøytralt tetthetsfilter med en optisk tetthet på 1,0 og en 22 mm keramisk lag over sensoren.
  4. Kople fotodiodestrømsensoren til et oscilloskop ved hjelp av en koaksial kabel.
  5. Kobleen 10 x 10 cm ramme som har en 6 x 6 cm prøve eksponering område med stillaset av måleoppsettet i en høyde av 308 mm under linsen (figur 1). Fest blad posisjon i rommet ved å montere den inn i cm ramme 10 × 10.
  6. Koble en NIR-detektor til en datamaskin ved hjelp av en kabelen (USB) Universal Serial Bus og installere grensesnittet programvare for detektoren.
  7. Plassere detektoren ved en 45 ° vinkel i forhold til laserstrålen 135 mm over det keramiske laget. Justere måleområdet av detektoren til laserpunktet på prøven ved å variere den sensor posisjon og vinkel inntil maksimal temperatursignal blir observert.
  8. Bruke laserstyre grensesnitt programvare for å justere utgangslasereffekt til 5 W og varigheten av laserpulsen til 0,5 s. Velg "Current kontroll" kommandoen i kontrollalternativer vinduet under den grafiske representasjonen av laser makt og justerer lasereffekten ved å skrive "5" i & #34; Motor [W] ". Feltet Juster laserpulsvarigheten ved å skrive" 0,5 "inn i" Tid [s] "-feltet.
  9. For å bestemme den absolutte lasereffekten for hvert sett av eksperimenter, erstatte fotodioden strømsensor med en termisk flate absorber kraftsensor ved slutten av hvert sett av forsøk og måle laserutgangseffekt for 20 s uten en prøve.

5. Klargjør Leaf Samples

  1. Bruk intakte og uskadde blader for målingene.
  2. Hvis relevant for etterforskningen, ligne typiske blad skadetyper ved piercing bladet med en skalpell, gni bladene mellom gummihansker, utsette bladet til en åpen flamme eller en laserstråle for 2-3 s, eller bruke andre teknikker for å simulere andre typer skader.
  3. Nøye men raskt montere bladet prøven mellom sample-holding klemmer.

6. Ta temperaturmålinger

  1. Unngå direkte kontakt mellom bladet og keramiskeattenuator plassert over fotodioden sensoren for å hindre kunstig varmeoverføring som forstyrrer beregning av c p, s og λ (se kapittel 9).
  2. Bruk temperaturmåling programvare for å samle temperaturprofilen av bladet prøven for en total av 60 s via NIR detektoren. Først registrerer temperaturen baseline i 10 s, deretter aktivere laser for 0,5 s og fortsette å samle data for 49.5 s.
    1. Start en måling ved å klikke på "Measurement" og deretter "Ny Measurement". Etterpå klikk på den grønne pilen over grafisk fremstilling av den termiske profilen. Lagre temperaturprofilen ved å klikke på "Lagre" -ikonet (en stilisert disk) over grafisk representasjon av profilen.
  3. Bekreft overført lasereffekten ved hjelp av fotodiode kraftsensor ved å beregne forskjellen i signal for målinger med og uten et blad prøve ved hjelp av et oscilloskop koblettil fotodioden kraftsensoren via en koaksial kabel (figur 2).
    1. Bestemme høyden av de to flankene (f 1, S og f 2, S) i spenningsprofil tatt med oscilloskopet.
    2. Gjenta målingen uten et blad prøve som en referanse (f 1,0 og f 2,0). Beregn overføring μ T som forholdet mellom disse målingene i henhold til ligning 4 (se også figur 2).
      Ligning 4: ligning

Figur 2
Figur 2: Måling blad overføring ved hjelp av en fotodiode makt sensor. A. Typisk spenning profil for en referanse eksperiment uten et blad prøve visualisert ved hjelp av et oscilloskop. B. spenning profilmed et blad prøve er montert i apparatet. I begge tilfeller er den utsendte lasereffekt proporsjonal med hver av de to flankene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

7. Beregn Spesifikk varmekapasitet av Leaf Sample

  1. Beregn den maksimale temperaturforskjell AT [K] i løpet av laserpulsen ved å subtrahere romtemperaturen T 0 [K] fra maksimum blad temperatur T ma x [K] (ligning 5).
    Ligning 5: ligning
  2. Beregn energi absorberes av et blad (E S [J]) basert på effektiv laser makt og laser puls varighet (ligning 6), hvor P R [W] er den reflekterte laser makt og P T [W] er overført laser makt.
    Equasjon 6: ligning
  3. Beregne massen av det oppvarmede bladareal (m S [kg]) ved bruk av ligning 7, hvor d S [m] er bladet tykkelse i henhold til 2.1), r Laser [m] er radien av den laserpunkt, V S [ m 3] er det oppvarmede blad volum, og ρ S [kg m -3] er bladet tettheten i henhold til 2.2).
    Ligning 7: ligning
  4. Beregn c p, s [J kg -1 -1 K] i henhold til ligning 8 ved å dividere den absorberte energi E S ved produktet av det oppvarmede bladareal masse m S og maksimal temperaturforskjell AT.
    Ligning 8: ligning

8. Forbered temperaturprofilen Data for Thermal ledningsevne Beregninger

  1. Bruk "Export" kommandoen over NIR sensor kontroll programvare for å eksportere tid og temperatur rådata som en * .dat fil og åpne filen i et regneark prosessor.
  2. Anvende 1: 100 datareduksjon, for eksempel ved bruk av en "IF (MOD (verdi = 100) = 0;" x "," 0 ")" -kommandoen, noe som resulterer i en datatetthet av ett datapunkt per 0,1 s.
  3. Beregne gjennomsnittlig referansetemperatur T B [° C] for hvert temperaturprofil i løpet av de første 10 s med en måling, under hvilken laseren var fremdeles av. Deretter beregner differansen mellom T B og den aktuelle omgivelsestemperaturen T 0 [° C].
  4. Bruk denne forskjellen til individuelt normalisere hver profil ved å flytte det mot T 0 (y-normalisering), for eksempel hvis T B - T 0 = 2,0 K, deretter trekke 2,0 K fra hver temperaturverdien i temperatur profile (figur 3A).
  5. Normaliser tiden koordinat for hvert temperaturprofil (x-normalisering) ved å slette alle data punkt før den maksimale prøvetemperaturen (T maks) og tilordne nye tidsverdier som starter med t = 0 til t max (figur 3B).
  6. Screen hver profil for plutselige temperatur skift, dvs. temperaturforskjeller som er mer enn tre ganger baseline støynivå, noe som er typisk 3 × 0,31 K ≈ 1,0 K. Fjern disse regionene fra datasettet fordi de svarer til måle artefakter (Figur 3C ).
  7. Monter en eksponentiell (ligning 9) til dataene ved hjelp av et regneark prosessor, hvor T t [K] er utstyrt blad prøvetemperatur på tidspunktet t [s], T 0 er omgivelsestemperaturen, A [K] er amplituden og t 1 [s] desintegrasjonskonstanten (Figur3D).
    Ligning 9: ligning
  8. Bruk tilpasset funksjonen for å beregne temperaturen nedgang i bladet prøven 0-80 s etter laserpulsen.
  9. Omforme temperaturdataene målt i [° C] til [K] skala ved tilsetning av en verdi av 273,15 til hver temperatur datapunkt (figur 3E).

Figur 3
Figur 3: Databehandling ordning for beregning av λ. A. Etter datareduksjon, temperaturprofilene er normalisert til omgivelsestemperatur. B. Deretter blir alle datapunkter før den maksimale prøvetemperaturen (T maks) fjernet. C. Måle artefakter (vist i "inkonsekvent" datasett) er identifisert basert på temperaturen skifter større enn thRee ganger grunnverdien støy og fjernet fra datasettet før montering til en eksponentiell funksjon. D. Den Celsius temperatur skala omdannes til Kelvin skalaen. E. For hvert tidsintervall, blir λ beregnet basert på temperaturprofilen. F. Et vindu av 20 s er definert som en aktuell temperaturendring kan observeres. G. Basert på den valgte tidsvinduet, er gjennomsnittet og standardavviket beregnet for λ. H. Representative resultater for to forskjellige N. tabacum blad prøver. Orange piler og linjer indikerer effekten av den tilsvarende behandlingstrinn på de presenterte data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

9. Beregning av varmeledningsevne av Leaf Sample

  1. Beregn temperaturen difference mellom bladet prøven og miljøet for hvert 0,1-s-intervallet i henhold til ligning 10, hvor AT x [k] er temperaturforskjellen, er T t [° C] det monterte blad prøvetemperatur og T 0 [° C] i omgivelsestemperatur (figur 3E).
    Ligning 10: ligning
  2. Anta at nedgangen i temperaturen på grunn av den kombinerte effekten av konvektiv varmeoverføring, varmestråling og varmeledning. Bruke det tilsvarende energibalanse (ligning 11) som en basis for beregning av λ, hvor AE Temp [J] er forskjellen i den termiske energien til prøven ved to etterfølgende tidspunkter, AE rad [J] er energiforskjellen skyldes varme~~POS=TRUNC, AE konv [J] er energiforskjellen på grunn av konvektiv varmeoverføring, og Δ; E dirigent [J] er energiforskjellen på grunn av varmeledning.
    Ligning 11: ligning
  3. Erstatt de generelle vilkårene i energibalansen med de faktiske fysiske egenskaper som ga ligning 12, der AT t [K] er forskjellen i den monterte blad prøvetemperaturen, ε den glasserings emissivitet, σ [kg s -3 K -4] Stefan -Boltzmann konstant, A rad [m 2] befinner seg i termisk stråling, h [J s -1 m K -2 -1] den konvektive varmeovergangstallet, A konv [m 2] arealet av konvektiv varmeoverføring, A dirigent [m2] befinner seg i termisk ledning og l [m] den karakteristiske lengde.
    Ligning 12:
    ligning
  4. Beregn characteristic lengde l basert på sammenhengen: l = V / A.
  5. Bruke oppvarmet prøvevolumet V S og tverrsnittsarealet av bladet prøven for å beregne A [m 2]. Tverrsnittsbladareal tilsvarer en dirigent i henhold til ligning 13, hvor A dirigent er det område hvor det oppstår overledning, r Laser er radien for den laserpunktet og d s er bladet tykkelse.
    Ligning 13: ligning
  6. Beregne en rad og en konvertering i henhold til ligning 14, hvor en laser er det området av laserpunktet.
    Ligning 14: ligning
  7. Erstatning Ligningene 9, 12 og 13 inn i ligning 11, og løser den sistnevnte for λ, hvilket ga Ligning 15 hvor t er t LaserHan laserpulsvarighet [s].
    Ligning 15:
    ligning
  8. Anta en verdi på 0,94 for ε og beregne λ for hvert 0,1-s tidsintervall i løpet av de første 20 s med temperaturprofilen. Gjennomsnittlig de 200 verdier for λ oppnås på denne måten, og beregne standardavviket (figur 3F - H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling av Leaf Properties

Ved å bruke den ovennevnte mikroskopiske fremgangsmåte, et blad tykkelse på 0,22 til 0,29 x 10 - 3 m, ble bestemt for både N. tabacum (0,25 ± 0,04 x 10 - 3 m, n = 33) og N. benthamiana (0,26 ± 0,02 x 10 - 3 m, n = 24), noe som er godt innenfor det 0,20 til 0,33 x 10 - 3 pm området som tidligere er rapportert for bladene av forskjellige plantearter 3. Bestemme tykkelsen med en ekstern måler ga verdier av ~ 0,28 × 10 - 3 m (n = 10), som var innenfor ett standardavvik av resultatene fra den mikroskopiske måling. Dermed kan dial-gauge måling foretrekkes fremfor mikroskopisk metode for tykkelse besluttsomhet i rutine søknader som det var enklere å bruke ogresultatene for c p, s og ʎ merkelig mindre enn 10% fra de mer arbeidskrevende teknikk. Tettheten av N. tabacum og N. benthamiana blader var 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), som samsvarer med 631-918 kg m - 3 rekkevidde tidligere rapportert for bladene i andre arter 3.

Beregning av spesifikk varmekapasitet

Temperaturprofiler som er samlet for Nicotiana arter viste en hurtig økning over tid av laserpulsen inntil maksimumstemperaturen (t maks) ble nådd i løpet av mindre enn 1 sek. Etter at puls, redusert temperatur eksponentielt inntil den nådde romtemperatur (T 0) (figur 3A - E). Den spesifikke varmekapasitet (c p, s -1 K -1 for N. tabacum og 2252 ± 285 J kg -1 K -1 for N. benthamiana. To dyrking innstillinger og varighet ble anvendt for hvert arter (se avsnitt 1.2), men dette påvirket ikke c p, s (figur 4). Imidlertid c P, S-verdier ble redusert lineært fra den gamle (bunnen) til unge (øverst) blader (R 2 = 0,85) i tilfelle av N. tabacum (figur 4A), som korrelert til vanninnholdet [gg -1 biomasse] som hadde blitt bestemt som forskjellen i våt biomasse ved tidspunktet for høsting og massen etter 72 timers inkubering ved 60 ° C 11. Denne sammenhengen mellom vanninnhold og spesifikk varmekapasitet var i samsvar med tidligere observasjoner av andre forfattere 13. En invers korrelasjon ble observert for N. benthamiana (R 2 = 0,79), hvor forskjellen mellom de spesifikke varmekapasiteter av blader av forskjellig grad av modenhet (under = gamle; top = ung) var bare 13% sammenlignet med 21% for N. tabacum. Denne forskjellen kan stamme fra det faktum at vanninnholdet i blader av N. benthamiana er nesten konstant over forskjellige grader av blad modning 11. En sensitivitetsanalyse viste at forskjeller i c p, s var proporsjonal med svingninger i måleparametere i ligning 8. Effekten av det reflekterte og overførte lasereffekt var sub-proporsjonalt, fordi disse parameterne var ikke individuelle forhold i ligning 7. Følgelig virkningen av feil i disse to parametrene var mindre enn de som er forårsaket av fluktuasjoner i lasereffekten eller omgivelsestemperatur. Generelt, ble målingen ansett for å være robuste fordi alle parametre som er involvert i beregningen av c p, s hadde en koeffisientvariasjon på mindre enn 10% (figur 4C og D).

Figur 4
Figur 4: Spesifikk varmekapasitet og varmeledningsevne verdier bestemt for N. tabacum og N. benthamiana. A. Spesifikk varmekapasitet og varmeledningsevne av N. tabacum later ifølge bladet posisjon på anlegget (nederste = gamle blader, midt = modne bladene; top = unge blader). Stjerner og trekanter tyder på planter som var 49 og 56 dager gamle, henholdsvis. B. Spesifikk varmekapasitet og varmeledningsevne av N. benthamiana blader i henhold til bladet stilling på anlegget. Stjerner og trekanter tyder på planter som ble dyrket i et fytotron eller drivhus, henholdsvis. C. Sensitivitet av spesifikke varmekapasitetsverdier for endringer i inngangsparametre. triangles vise spesifikke varmekapasitet verdier som følge av en 10% økning (rød, oppover) eller reduser (blå, nedover) i enkle modellparametere. D. Sensitivitet av termiske konduktivitetsverdier for endringer i inngangsparametre. Triangles markere skoen termisk ledeevne som følge av en 10% økning (rød, oppover) eller reduser (blå, nedover) i enkle modellparametere. Feilfelt i A og B indikerer standardavvik (n≥3), mens i C og D de representerer hele spekteret av verdier oppnådd i løpet av 10% variasjon sensitivitetsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Beregning av varmeledningsevne

Den termiske ledningsevne (ʎ) ble beregnet fra temperaturprofilene etter eksponensiellfitting (Figur 3) kombineres med ligninger for ledende og konvektiv varmeoverføring og varmestråling. Ligning 15 ga gjennomsnittsverdier på 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - en K - 1 (n = 19) for N. tabacum og 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - en K - 1 (n = 25) for N. benthamiana. Det var ingen sammenheng mellom ʎ og plante alder eller dyrking innstillingen, selv om en sammenheng mellom bladet alder og ʎ ble observert for N. benthamiana (figur 4B), enige med tidligere rapporterte aldersavhengige forskjeller i andre plantearter 14. Som diskutert ovenfor, vanninnholdet var en usannsynlig Årsaken til denne forskjell som det ble funnet å være homogent tvers av blader av varierende modenhet for N. benthamiana. I stedet spekulerer vi at endringer i lEAF vev, for eksempel celleveggen sammensetning, var ansvarlige for denne observasjonen ved å endre varmeoverføringsegenskaper av bladene og dermed påvirke verdien av ʎ. Bestemmelsen av ʎ var følsom for endringer i omgivelsestemperaturen. En sensitivitetsanalyse viser at svingninger på ± 2,3 K endret verdien av ʎ med 64-125%. I henhold til ligning 15, er omgivelsestemperaturen en effekt i kraft av fire på termisk stråling og dermed direkte påvirker verdien av ʎ.

Evaluering av måleapparat

Det var mulig å sette opp måleenheten innen 3 timer. Når dette var fullført, oppstartstiden for systemet var omtrent 15 minutter per måleserier. Enkeltmålinger tok mindre enn 3 min, inklusive prøvepreparering og hele målesyklusen. Analyse av lasereksponeringstiden avslørte at enoppvarmingstid av 0,5 s resulterte i en temperaturøkning på 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) var det beste kompromiss mellom høy AT (oppnådd ved lange laserpulser) som kreves for en god signal-til-støy-forhold (SNR) og den lave aT (oppnådd ved å korte laserpulser) som er nødvendig for å unngå vevsskade. Pulsvarigheter som er lengre enn 0,5 s resulterte i tap av masse fra prøven, som sannsynligvis gjenspeiler fordampning av vann og / eller skade på bladvev som prøvetemperaturen nådde opp til 70 ° C, mens kun 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) ble observert i 0,5 s laserpulser. For varighet på mindre enn 0,5 s, temperaturen støy på ± 0,31 K (standardavvik, n = 25) utgjorde mer enn 5% av AT og var således en betydelig del av AT. I motsetning til dette, ved 0,5 s støyen utgjorde bare 2,5% av signalet, og ble således ansett som ubetydelig. I tillegg ble prøvene ikke varmes opp til mer enn ~ 45 ° C, noe som gjøren temperatur som tobakksplanter kan også bli utsatt for i den naturlige tropiske til subtropiske habitat og som bare er skadelig for plantearter som finnes i tundra habitater 15. Den effekttetthet på laseren var 170 kW m -2, mens naturlig solstråling er typisk i området fra 1,0-1,4 kW m -2 16,17. Men på grunn av den meget korte tid av pulsen, den høyere energidose har sannsynligvis ikke skade bladvev som indikert ved en nylig publisert mikroskopisk analyse 11. Temperaturdataene som brukes til å beregne ʎ var begrenset til de første 20 s etter at laserpulsen, fordi bare i løpet av denne perioden fikk støy (± 0,31 K) utgjør mindre enn 5% av prøvens temperatur signal og ble således ansett som ubetydelig. Når temperaturdata fra utenfor 20 s tidsrammen ble brukt, verdiene som er beregnet for ʎ avvist (figur 3F). En mulig forklaring er at noen av forutsetningenelaget for beregning av ʎ ikke gjelder for lave verdier av AT. Spesielt er uttrykket som beskriver termisk stråling i ligning 15 kan ha blitt påvirket som det påvirkes av den fjerde strøm av temperatur. Dessuten kan det hende at bladareal rundt prøven sted utsatt for laser har varmet opp litt og dermed kanskje ikke har vært den ideelle varmeleder antas i modellen reduserer den effektive AT x og til slutt den beregnede ʎ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontakten-fri, ikke-destruktiv målemetode som er beskrevet ovenfor kan anvendes for å bestemme c p, s og ʎ i en simultan og reproduserbar måte. Beregningen av ʎ særlig avhenger av flere parametre som er følsomme for feil. Ikke desto mindre, virkningen av disse feilene var enten lineær eller under proporsjonal, og variasjonskoeffisienten for alle parametre ble funnet å være mindre enn 10%. Selv om fremgangsmåten kan således betraktes som robust, kan noen tekniske forbedringer gjøres for å redusere de gjenværende feilkilder.

Montering av prøven i sammenstillingen var teknisk utfordrende fordi en flat bladoverflate er å foretrekke for måling men prøven har naturligvis en bølgende overflate. Dette problemet kan overvinnes ved å utforme en dedikert prøveholder med geometrier nøyaktig justert til bladet prøven, f.eks, bladtykkelse og bredde, fastklemming av prøven i det forestand orientering. Denne tilnærmingen vil gjøre målingene mer reproduserbar, men vil gå ut over kontaktfrie natur av målingen, fordi fast kontakt mellom prøven og holderen ville være nødvendig å trekke bladet overflaten flat. Fordelene med å bruke en slik holder vil derfor være avhengig av konteksten av målingen, dvs. hvorvidt den presisjon eller kontaktfrie natur av målingen er viktigst. I motsetning til dette, kan slike betraktninger ikke være nødvendig i det hele tatt for blader med en iboende plant underlag, f.eks, ris og beslektede arter.

Konvektiv varmeoverføring som følge av luftbevegelse i miljøet til prøven bør holdes på et minimum under målingene, fordi dette i høy grad påvirke beregningen av både c p, s og ʎ 18. Apparatet bør derfor plasseres i god avstand fra luftstrømmer generert av air condition systemer, radiatorer eller annet utstyr, som for eksempel datamaskin medintegrert kjølevifter. Dette er også viktig fordi forandringer i den relative vanninnhold av bladene 19 som kan oppstå før eller under målingen på grunn av fordampning, som kan økes ved hjelp av luftbevegelser 20, ikke ble ført i modellen. Således målinger, spesielt med frittliggende blader, bør utføres raskt som beskrevet i fremgangs delen for å unngå feil under datainnsamling. I fremtiden, kan effekten av fordampning på målingen reduseres eller unngås dersom målingen utføres i et i det minste delvis lukket målekammeret med en implementert fuktighetskontroll.

Nøyaktigheten av c p, s og ʎ verdier kan økes ved å måle parameterne som brukes i de tilsvarende ligningene mer presist. I tilfellet med c p, s disse parameterne er lasereffekt, maksimal og omgivelsestemperatur, og prøvevolumet, dvs. produktet av laser flekk område og tykkelse, og prøven tetthet (ligning 8). De to sistnevnte parametrene må bestemmes i eksperimenter som følger med selve målingen og deres pålitelighet kan bli bedre hvis flere representative biologiske replikater testes. Imidlertid, selv når en enkel summe-gauge målingen ble anvendt, forskjellen i tykkelse i forhold til bladet en mikroskopisk analyse var bare 11%, som påvirkes verdiene som er beregnet for c p, s og ʎ av samme grad. I motsetning til dette kan temperaturer og lasereffekt overvåkes gjennom hele målingen. Nøyaktigheten av c p, kan s bli bedre hvis disse elektroniske dataene blir brukt i stedet for faste verdier for laser makt og omgivelsestemperatur, og dataene er samlet inn ved hjelp av godt kalibrerte sensorer. Disse hensyn gjelder også for ʎ, men ambient og eksempel temperaturer er de viktigste parametrene fordi begge påvirke den beregnede verdien av kraften i fire.

Den nåværende beregning av ʎ var basert på flere forutsetninger om konvektiv varmeoverføring og varmestråling. For eksempel ble det emissivitet (ε) og konvektiv varmeovergangstallet (h) ikke måles eller beregnes eksplisitt i fremgangsmåten presentert ovenfor, men var avledet fra tidligere publikasjoner 18,21. Nøyaktigheten av ʎ kan derfor forbedres ved å bestemme disse to parametrene under de faktiske måleforholdene. Men ved hjelp av litteraturdata for beregningene ga likevel ʎ verdier som var innenfor rekkevidde eksperimentelt bestemt for andre plantearter som lignende egenskaper kan forventes på grunn av deres fylogeni til Nicotiana arter og deres fysiologi, dvs. urteaktige planter 3. Selv om verdiene for ε og h ble variert over hele området som tidligere er rapportert for disse verdiene hos planter, f.eks 0,93 til 0,98 for ε 21, deres effekt på den endelige verdien av ʎ var <10% og dermed innenfor naturlig variasjon observert her.

Fremgangsmåten er beskrevet ovenfor var ikke bare i stand til å bestemme de termiske egenskapene til intakte uskadd blader og frittliggende blad, men det er også korrekt identifisert forskjellige typer av mer alvorlige skader innført med hensikt før måling. Derfor kan forskjellige typer av blad prøver lett kan skilles, og gir et verktøy for å fjerne, før analyse, eventuelle dårlige prøver som ville vike lav kvalitet data. Denne funksjonen kan brukes for kvalitetskontroll ved overvåkning av biologisk materiale, for eksempel, prøver ikke å møte spesifikasjonene i form av c p, s og ʎ kan bli ekskludert fra videre behandling. Dette ville være en ressurs i forbindelse med et strengt regulerte prosesser som molekylær jordbruk 4.

Fordelene ved denne nye fremgangsmåten i forhold til andre ilitteraturen inkluderer den raske prøvehåndtering, minimal forberedelse, kontakt-fri og ikke-destruktiv samtidig måling av c p, s og ʎ, og bruk av felles utstyr som kan finnes i mange optiske laboratorier. Dette vil lette bredere anvendelse av metoden i forhold til de som krever spesialiserte og kostbare enheter som differensial skanning kalori. Videre krever kalorimetri direkte kontakt med prøven 22 slik at det er en risiko for skade, og fremgangsmåten er vanligvis begrenset til måling av spesifikk varmekapasitet 22. I kontrast, mens termografi kan oppdage nekrose eller fysiske endringer i blader eller hele anlegg i en kontakt-fri måte 23, det krever også komplekse bildeanalyse og dedikerte spesialiserte enheter 24 som kan overvinnes i fremtiden ved billigere og kraftigere IR-kameraer og medfølgende eksterne enheter. Spektralanalyse er en annen kontakt-free metode for analyse av vanninnholdet og klorofyll nivå 25, men det har ennå ikke blitt benyttet for å bestemme spesifikk varmekapasitet og / eller termiske ledningsevnen.

Målingen tilnærmingen er rapportert heri er en robust metode for å bestemme de termiske egenskaper av planteblader med lave investeringskostnader og korte måletider. Det ble med hell anvendt for å bestemme c p, s og ʎ i N. tabacum og N. benthamiana, to arter som er relevante i området av molekylære jordbruk 4. De beregnede for begge parametrene basert på bladtemperaturprofiler verdier var i god overensstemmelse med de som tidligere er rapportert for andre plantearter 3. Fremgangsmåten er ikke-destruktiv, kontakt-fri, og ikke krever komplisert prøvepreparering, som gir fordeler i forhold til alle aktuelle alternative metoder for analyse av termiske egenskaper. Den enkle designen kan også legge til rette for utvikling av hånd held enheter for å øke fleksibiliteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" tube Thorlabs SM1L10E Tube for fiber holder
Agarose Sigma Aldrich A0701 Agarose
Bi-Convex lense f=25.4 Thorlabs LB1761 Lense
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console Thorlabs PM100D Console for thermal surface absorber sensor
Digital Phosphor Oscilloscope  Tektronix DPO7104 Oscilloscope
DMR light microscope Leica n.a. Light microscope
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-2 Pycnometer
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Fiber holder Thorlabs Fiber holder
Forma -86 °C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Infrared Detector Optris CT Optris OPTCTLT15 Infrared detector
Infrared Detector Software Compact Connect Optris n.a. Control software for infrared detector
Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer PerkinElmer L1050 UV/VIS Spectrophotometer
Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module DILAS M1F-SS2.1 Laser
Laser cover Amtron LM200 Laser Cover
Laser Driver  Amtron CS 408 Laser Driver
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Photodiode sensor  Thorlabs PDA20H-EC Power sensor for transmission measurements
Precision weight Ohaus Analytical Plus Ohaus 80251552 Precision weight
Sample frame Fraunhofer ILT n.a. Fixation of the leaf sample
Software Pyro Control Amtron n.a. Laser Power Control Software
Stainless-steel-holder n.a. n.a. Holder for measurement set-up
Teflon plates 2 cm Fraunhofer ILT n.a. Teflon attenuation
Thermal surface absorber Power sensor Thorlabs S314C Sensor for laser power measurements
Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome
Zoc/Pro 6.51  EmTec Innovative Software n.a. Laser Control Software 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilhelm, E. Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. Royal Society of Chemistry. 516 (2010).
  2. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).
  3. Jayalakshmy, M. S., Philip, J. Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature. International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).
  4. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  5. Schuster, A. C., et al. Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures. AoB PLANTS. 8, (2016).
  6. Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity. J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).
  7. Hays, R. L. The thermal conductivity of leaves. Planta. 125, 281-287 (1975).
  8. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. (2015).
  9. Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts. J. Vis. Exp. Under review (2015).
  10. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  11. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Tödter, N., Wehner, M. Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing. J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).
  12. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. (2015).
  13. Hedlund, H., Johansson, P. Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants. Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).
  14. Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation. Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).
  15. Larcher, W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. Springer Science & Business Media. (2003).
  16. Cowen, R. A gamma-ray burst's enduring fireball. Science News. 152, 197 (1997).
  17. Jones, H. G., et al. Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field. Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).
  18. Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives. Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).
  19. Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves. Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).
  20. Jones, H. G., Schofield, P. Thermal and other remote sensing of plant stress. General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).
  21. Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. Radiation measurement for plant ecophysiology. J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).
  22. Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues. Fuel. 115, 644-651 (2014).
  23. Chaerle, L., et al. Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue. Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).
  24. Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry. J. Agron. Crop. Sci. 415-429 (2012).
  25. Yuan, L., et al. Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects. Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics