Un laser Rapid Probing Metodo Facilita la determinazione non invasiva e senza contatto di Leaf Proprietà termiche

Biochemistry

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Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Wehner, M. A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties. J. Vis. Exp. (119), e54835, doi:10.3791/54835 (2017).

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Abstract

Le piante possono produrre sostanze preziose come metaboliti secondari e proteine ​​ricombinanti. La purificazione di questo dalla biomassa vegetale può essere semplificato mediante trattamento termico (scottatura). Apparecchiatura scottatura può essere progettato con maggiore precisione se le proprietà termiche delle foglie sono noti in dettaglio, cioè, il calore specifico e la conducibilità termica. La misurazione di queste proprietà è in termini di tempo e manodopera, e di solito richiede metodi invasivi che contattano direttamente il campione. Ciò può ridurre la resa del prodotto e può essere incompatibile con i requisiti di contenimento, ad esempio, nel contesto di buona fabbricazione. Per affrontare questi problemi, un non-invasiva, metodo senza contatto è stato sviluppato che determina la capacità termica specifica e conducibilità termica di un foglio della pianta intatta in circa un minuto. Il metodo prevede l'applicazione di un breve impulso laser di lunghezza e di intensità definito ad una piccola area dellacampioni di foglie, causando un aumento della temperatura che viene misurata utilizzando un sensore infrarosso vicino. L'aumento di temperatura è combinato con note proprietà foglia (spessore e densità) per determinare la capacità termica specifica. La conducibilità termica viene poi calcolato sulla base del profilo del calo di temperatura successiva, prendendo radiazione termica e scambio termico convettivo in considerazione. I calcoli associati e gli aspetti critici della manipolazione del campione sono discussi.

Introduction

La lavorazione su larga scala di materiali biologici spesso richiede fasi di trattamento termico come pastorizzazione. L'attrezzatura per tali processi può essere progettato con maggiore precisione se le proprietà termiche dei materiali biologici sono ben caratterizzati, compresa la capacità di calore specifico (c p, s) e la conducibilità termica (λ). Questi parametri possono essere determinati facilmente per liquidi, sospensioni e omogenati mediante calorimetria 1. Tuttavia, la misurazione di tali parametri in campioni solidi può essere laborioso e spesso richiede il contatto diretto con il campione o addirittura la distruzione 2. Ad esempio, tecniche fototermiche richiedono un contatto diretto tra il campione e rivelatore 3. Tali limitazioni sono accettabili durante la lavorazione, ma sono incompatibili con processi altamente regolati come la produzione di proteine biofarmaceutiche nelle piante nel contesto della pratica buona fabbricazione 4. ion tale contesto, ripetuto (per es, settimanale) il monitoraggio delle proprietà termiche può essere richiesto nel corso di un periodo di crescita di sette settimane per impianti individuali come uno strumento di controllo della qualità. Se un tale monitoraggio richiederebbe e consumare una foglia per ogni misura, non ci sarebbe biomassa sinistra per elaborare al momento del raccolto.

Inoltre, utilizzando solo parti foglia invece causerebbe ferendo alla pianta ed aumentare il rischio di necrosi o infezione patogeno, ancora diminuendo la resa del processo. La probabilità di infezione patogeno può anche aumentare se sarebbe utilizzato un metodo con contatto diretto al campione, inducendo il rischio che un intero lotto di piante possono essere infettati attraverso il contatto con un dispositivo sensore contaminato. Aspetti simili devono essere considerati per il monitoraggio della pianta sottolinea come la siccità, ad esempio, in un contesto ecofisiologica. Ad esempio, la perdita di acqua è spesso controllata da un cambiamento nella biomassa fresca, che richiede un tre invasivaatment degli impianti oggetto di indagine 5, ad esempio, dissezione una foglia. Invece, determinare la capacità termica specifica, che dipende dal contenuto di acqua di un campione, in modo non invasivo come descritto qui, può essere utilizzato come parametro surrogato per lo stato di idratazione delle piante. In entrambi i casi (produzione farmaceutica e ecofisiologia), sollecitazioni artificiali indotti da tecniche di misurazione distruttive o invasive sarebbe deleterio quanto possono falsare i dati sperimentali. Metodi istantanei Pertanto, precedentemente riportati 6 o il posizionamento dei campioni tra le piastre 7 argento sono inadatti per tali processi ed esperimenti perché o richiedono un contatto diretto con il campione o sono distruttive. I parametri c p, s e λ devono essere determinati al fine di progettare apparecchiature di processo per un passo sbollentare in grado di semplificare la purificazione dei prodotti e ridurre i costi di produzione 8-10 così. entrambi cp, s e λ possono ora essere rapidamente determinati da non distruttivo vicino infrarosso (NIR) laser senza contatto sondare in modo coerente e riproducibile 11 e questo nuovo metodo saranno spiegate in dettaglio di seguito. I risultati ottenuti con questo metodo sono stati usati con successo per simulare il trasferimento di calore in foglie di tabacco 12, consentendo la progettazione di apparecchiature per il trattamento appropriato e la selezione dei parametri corrispondenti quali la temperatura scottatura.

Il metodo è facile da configurare (Figura 1) e presenta due fasi, misurazione e analisi, ciascuna delle quali comprende due fasi principali. Nella fase di misurazione, un campione foglia viene prima riscaldato localmente con un breve impulso laser e la temperatura massima campione viene registrato. Il profilo di temperatura del campione viene quindi registrato per una durata di 50 s. Nella fase di analisi, proprietà foglia come densità (facilmente e accuratamente determinate da measurem picnometricoent) sono combinati con la temperatura massima del campione per calcolare c p, s. Nella seconda fase, il profilo di temperatura del foglio è usato come ingresso per un equazione di bilancio energetico, tenendo conduzione, convezione ed irraggiamento in considerazione, per calcolare λ.

Dettagliate istruzioni passo-passo sono forniti nella sezione del protocollo, ampliando il contenuto del video di accompagnamento. Misure tipiche vengono quindi visualizzati nella sezione risultati. Infine, i vantaggi ei limiti del metodo sono evidenziati nella sezione di discussione insieme con i potenziali miglioramenti e ulteriori applicazioni.

Figura 1
Figura 1: La strumentazione utilizzata per determinare le proprietà termiche del foglio. A. Fotografico dell'apparecchiatura di misurazione utilizzato per determinare il calore specifico e la conduttività termica di leAves. I dispositivi periferici (computer, oscilloscopio) non sono presentati. B. Rappresentazione schematica del dispositivo di misurazione. Il laser e apparecchiature collegate sono evidenziati in rosso, il rivelatore NIR per misurare la temperatura è mostrato in viola, il campione foglia è verde e il sensore di potenza fotodiodo è blu. C. Disegno degli elementi del sistema di misura con lo stesso codice di colore come in B. La barra indica dimensioni 0,1 m. D. Schermata che illustra gli elementi tipici del software di controllo laser. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. La coltivazione delle piante e preparazione del campione

  1. Lavare ogni blocco lana minerale con 1-2 L di acqua deionizzata e quindi con 1 L di 0,1% [m / v] Soluzione di concime. Mettere una tabacco (Nicotiana tabacum o N. benthamiana) seme in ogni blocco e delicatamente a filo con 0,25 L di soluzione fertilizzante senza lavare via il seme.
  2. Coltivare le piante per 7 settimane in una serra o fitotrone con il 70% di umidità relativa, a 16 ore fotoperiodo (180 micromol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) e una temperatura 25/22 ° C chiaro / scuro regime.
  3. Spostare le piante al apparato di misura. Se le piante sono immobile, raccogliere foglie singole per la misura delle proprietà termiche.

2. Stabilire Foglia spessore e densità

  1. Determinare lo spessore foglia
    1. Preparare una [m / v] soluzione di agarosio 2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) eautoclave esso. Lasciare raffreddare la soluzione fino a 40 ° C e incorporare un campione foglia posto in una capsula di Petri. Solidificare l'agarosio posizionando la piastra di Petri in frigorifero a 4 ° C per 30 min.
    2. Tagliare il blocco di agarosio in fette da 200 micron utilizzando un vibratome con un angolo di taglio lama di rasoio di 15 °. Utilizzare una velocità di taglio di 1,0 mm s -1 e un'ampiezza di 0,5 mm.
    3. Mount cinque sezioni foglia trasversale su un vetrino con cianoacrilato come fissativo. Determinare lo spessore del foglio sotto un microscopio con un obiettivo 20 × e un oculare con 10 × ingrandimento, utilizzando gli strumenti di misurazione integrati nel software del microscopio in base alle istruzioni del produttore.
    4. Determinare lo spessore del foglio in aree campione senza venature.
    5. In alternativa, determinare lo spessore foglia con un quadrante calibro in una zona di libero vena della lamina fogliare. Assicurarsi che la linea a scartamento ridotto è tenuto perpendicolare al piano della lamina fogliare.
      CAUTION: cianoacrilato è irritante per la pelle e può anche incollare le dita insieme, se non maneggiati con cura.
  2. Determinare la densità di foglia
    1. Determinare la massa a vuoto (m 0) di un picnometro asciutto, quindi riempirlo con acqua e determinare di nuovo la massa (m 1). Essiccare il picnometro completamente, posizionare un foglio all'interno e determinare la massa (m 2) una volta. Con la foglia all'interno, accuratamente riempire il picnometro con acqua e determinare la massa (m 3).
    2. Calcolare la densità foglia (Ps) con l'equazione 1.
      Equazione 1: Equazione

3. Determinare la trasmissione spettrale e Riflessione di foglie

  1. Mettere una foglia nella camera campione di un UV / VIS fissandolo tra i morsetti di esempio-holding. Per misure di trasmissione, posizionare il foglio di fronte alla det ettore. Per la riflessione misurazioni posizionare il foglio nella parte posteriore della camera di rilevamento.
  2. Avviare il software di controllo spettrofotometro. Selezionare uno spettro da 900 nm a 1600 nm. Avviare una nuova scansione e registrare i valori per la trasmissione T) e riflessione R) visualizzato dal software UV / VIS spettrofotometro, basati sulla curva spettrale.
  3. Eseguire tutte le misurazioni con almeno tre repliche biologiche. Aumentare il numero di repliche biologiche per cinque o più, se un campione di qualità eterogenea può essere previsto, ad esempio, la variazione nella morfologia superficie fogliare e spessore.
  4. Calcolare la potenza di trasmissione (P T) e la riflessione (P R) moltiplicando i valori di R μ misurato μ T o dal laser laser di potenza P misurata secondo equazioni 2 e 3.
    Equazione 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
    Equazione 3: Equazione
    NOTA: La trasmissione può essere determinata anche con un sensore fotodiodo durante la misurazione (vedere 6.3).

4. Sistemare il dispositivo di misurazione

  1. Montare una fibra-accoppiato single-bar NIR diodo laser (lunghezza d'onda = 1.550 nm) in un cono di diametro 25,4 mm su un supporto in acciaio inox. Collegare un regolatore per impostare la potenza di uscita (P Laser) del laser NIR per 4-6 W.
  2. Inserire una lente biconvessa con una lunghezza focale di 25,4 mm all'estremità del cono per regolare la larghezza del fascio a 13 mm.
  3. Posizionare un sensore di potenza fotodiodo 354 mm sotto la parte inferiore della lente. Poi attenuare il fotodiodo inserendo un filtro a densità neutra con una densità ottica di 1,0 e 22 mm strato ceramico sopra il sensore.
  4. Collegare il sensore di potenza fotodiodo ad un oscilloscopio utilizzando un cavo coassiale.
  5. Collegareun telaio 10 × 10 cm, ha un'area di esposizione 6 × 6 cm circa campione con l'impalcatura del sistema di misura ad un'altezza di 308 mm al di sotto della lente (Figura 1). Fissare la posizione di foglia nello spazio montandolo nella cornice cm 10 × 10.
  6. Collegare un rilevatore NIR ad un personal computer tramite un cavo (USB) Universal Serial Bus e installare il software di interfaccia per il rivelatore.
  7. Posizionare il rilevatore ad un angolo di 45 ° al fascio laser 135 mm sopra lo strato ceramico. Allineare l'area di misura del rivelatore per il punto laser sul campione variando la posizione del sensore e l'angolo fino si osserva il segnale di temperatura massima.
  8. Utilizzare il software di interfaccia controllo laser per regolare la potenza del laser potenza a 5 W e la durata dell'impulso laser a 0,5 s. Selezionare il comando "controllo di corrente" nella finestra delle opzioni di controllo sotto la rappresentazione grafica della potenza del laser e regolare la potenza del laser digitando "5" in & #34; Potenza [W] ". Campo Regolare la durata dell'impulso laser digitando" 0.5 "in" Tempo [s] "campo.
  9. Per determinare la potenza del laser assoluto per ogni serie di esperimenti, sostituire il sensore di potenza fotodiodo con un sensore di potenza superficie dell'assorbitore termica alla fine di ogni serie di esperimenti e misurare la potenza di uscita del laser per 20 s senza campione.

5. Preparare i campioni di foglie

  1. Utilizzare foglie incolumità per le misurazioni.
  2. Se rilevante per l'indagine, imitare i tipi tipici danni foglia forando la foglia con un bisturi, strofinando la foglia tra i guanti in lattice, esponendo la foglia di una fiamma o un raggio laser per 2-3 s, oppure utilizzare altre tecniche per simulare altri tipi di danni.
  3. Con attenzione ma presto montare il campione foglia tra i morsetti di esempio-holding.

6. prendere la temperatura Misure

  1. Evitare il contatto diretto tra la foglia e la ceramicaattenuatore posto sopra il sensore fotodiodo per impedire il trasferimento di calore artificiale che interferisce con il calcolo del c p, s e λ (vedi paragrafo 9).
  2. Utilizzare il software di misura della temperatura per raccogliere il profilo di temperatura del campione foglia per un totale di 60 s tramite il rivelatore NIR. In primo luogo, registrare la linea di base della temperatura per 10 s, quindi attivare il laser per 0,5 s e continuare la raccolta dei dati per il 49,5 s.
    1. Inizia una misura cliccando su "misura" e quindi "nuova misura". Successivamente fare clic sulla freccia verde sopra la rappresentazione grafica del profilo termico. Salvare il profilo di temperatura, cliccando sull'icona "Salva" (un disco stilizzato) sopra la rappresentazione grafica del profilo.
  3. Conferma la potenza laser trasmesso utilizzando il sensore di potenza fotodiodo calcolando la differenza di segnale per misurazioni con e senza un campione foglio utilizzando un oscilloscopio collegatoal sensore di potenza fotodiodo attraverso un cavo coassiale (Figura 2).
    1. Determinare l'altezza dei due fianchi (f 1, f 2 S e, S) nel profilo di tensione acquisita con l'oscilloscopio.
    2. Ripetere la misurazione senza campione foglio come riferimento (f 1,0 e f 2,0). Calcolare trasmissione μ T come il rapporto di queste misurazioni secondo l'Equazione 4 (vedere anche figura 2).
      Equazione 4: Equazione

figura 2
Figura 2: Misurazione trasmissione foglio utilizzando un sensore di potenza fotodiodo. A. profilo di tensione tipico per un esperimento di riferimento senza campione foglia visualizzato per mezzo di un oscilloscopio. B. profilo di tensionecon un campione foglio montato nell'apparecchiatura. In entrambi i casi, la potenza del laser trasmessa è proporzionale a ciascuno dei due fianchi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

7. calcolare la capacità termica specifica del campione Leaf

  1. Calcolare la differenza di temperatura massima DT [K] durante l'impulso laser sottraendo il T temperatura ambiente 0 [K] dalla temperatura massima T foglio ma x [K] (Equazione 5).
    Equazione 5: Equazione
  2. Calcolare l'energia assorbita da una foglia (E S [J]) in base alla effettiva potenza del laser e il laser durata dell'impulso (Equazione 6), dove P R [W] è la potenza del laser riflessa e P T [W] è il laser trasmesso energia.
    Equazione 6: Equazione
  3. Calcolare la massa della superficie fogliare riscaldata (m S [kg]) usando l'equazione 7, dove d S [m] è lo spessore del foglio secondo 2.1), r laser [m] è il raggio dello spot laser, V S [ m 3] è il volume foglia riscaldata, e ρ S [kg m -3] è la densità del foglio secondo 2.2).
    Equazione 7: Equazione
  4. Calcolare c p, s [J kg -1 K -1] secondo l'Equazione 8 dividendo l'energia assorbita E S dal prodotto della superficie fogliare riscaldata massa m S e massima delta di temperatura.
    Equazione 8: Equazione

8. Preparare i dati di temperatura del profilo per ThermCalcoli al conducibilità

  1. Utilizzare il comando "Esporta" del software di controllo sensore NIR per esportare il tempo e la temperatura dati grezzi in un file * .dat e aprire il file in un elaboratore di fogli di calcolo.
  2. Applicare 1: riduzione del 100 dati, usando ad esempio un "IF (MOD (Value; 100) = 0;" x ";" 0 ")" di comando, con un conseguente densità dei dati di un punto di dati per 0,1 s.
  3. Calcolare la media delle temperature T B basale [° C] per ogni profilo temperatura oltre i primi 10 s di una misurazione, durante la quale il laser era ancora spento. Poi, calcolare la differenza tra T B e la temperatura effettiva ambiente T 0 [° C].
  4. Utilizzare questa differenza di normalizzare individualmente ciascun profilo spostando verso T 0 (y-normalizzazione), per esempio, se T B - T 0 = 2.0 K, quindi sottrarre 2,0 K da ogni valore di temperatura nella temperatura proFile (Figura 3A).
  5. Normalizzare coordinata temporale di ciascun profilo di temperatura (x-normalizzazione) eliminando ogni punto di dati prima che la temperatura massima del campione (T max) e assegnare nuovi valori di tempo iniziano con t = 0 per T max (Figura 3B).
  6. Schermo ogni profilo per improvvisi cambiamenti di temperatura, ad esempio, differenze di temperatura che sono più di tre volte il livello di rumore della linea di base, che in genere è 3 × 0.31 K ≈ 1.0 K. Rimuovere queste regioni dal set di dati perché corrispondono alla misura artefatti (Figura 3C ).
  7. Applicare una funzione di decadimento esponenziale (Equazione 9) ai dati utilizzando un processore foglio, dove T t [K] è la temperatura del campione foglio aderente al tempo t [s], T 0 è la temperatura ambiente, A [K] è l'ampiezza e t 1 [s] la costante di decadimento (Figura3D).
    Equazione 9: Equazione
  8. Utilizzare la funzione montato per calcolare il calo di temperatura nel campione foglia da 0-80 s dopo l'impulso laser.
  9. Trasformare i dati di temperatura misurati in [° C] a [K] scala aggiungendo un valore di 273,15 a ciascun punto di dati di temperatura (Figura 3E).

Figura 3
Figura 3: schema di elaborazione dei dati per il calcolo di λ. A. Dopo la riduzione dei dati, i profili di temperatura sono normalizzati alla temperatura ambiente. B. Successivamente, tutti i punti di dati prima che la temperatura massima del campione (T max) vengono rimossi. C. artefatti di misura (mostrato nel set di dati "incoerente") sono identificati in base alla temperatura si sposta più grande di thvolte ree il rumore di fondo e rimosse dal set di dati prima del montaggio di una funzione esponenziale. D. La scala di temperatura Celsius viene convertita in scala Kelvin. E. Per ogni intervallo di tempo, λ è calcolata in base al profilo di temperatura. F. Una finestra di 20 s è definito nei quali la variazione di temperatura corrispondente può essere osservato. G. Sulla base della finestra di tempo selezionato, la media e deviazione standard di sono calcolati per λ. H. Risultati rappresentativi per due differenti campioni di foglie N. tabacum. Frecce arancioni e linee indicano l'effetto della fase di lavorazione corrispondente sui dati presentati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

9. Il calcolo della conducibilità termica del Campione Leaf

  1. Calcolare la differe temperaturaSNO tra il campione foglia e l'ambiente per ogni 0,1-s intervallo secondo l'Equazione 10, dove DT x [K] è la differenza di temperatura, T t [° C] è la temperatura del campione foglia mobili e T 0 [° C] il temperatura ambiente (Figura 3E).
    Equazione 10: Equazione
  2. Si supponga che il calo di temperatura è dovuto all'effetto combinato di scambio termico convettivo, radiazione termica e conduzione termica. Utilizzare il corrispondente bilancio energetico (equazione 11) come base per il calcolo di λ, dove AE Temp [J] è la differenza di energia termica del campione in due punti temporali consecutivi, AE rad [J] è la differenza di energia dovuta alla radiazione termica, AE conv [J] è la differenza di energia dovuto al trasferimento di calore convettivo, e Δ; E cond [J] è la differenza di energia dovuto alla conduzione termica.
    Equazione 11: Equazione
  3. Sostituire i termini generali del bilancio energetico con le proprietà fisiche effettive rendimento Equazione 12, dove DT t [K] è la differenza di temperatura del campione foglia attrezzata, ε l'emissività senza unità, σ [kg s -3 K -4] il Stefan costante -Boltzmann, Un rad [m 2] l'area di radiazione termica, h [J s -1 m -2 K -1] il coefficiente di scambio termico convettivo, Un conv [m 2] l'area di trasferimento di calore convettivo, A cond [m 2] la zona di conduzione termica e l [m] la lunghezza caratteristica.
    Equazione 12:
    Equazione
  4. Calcolare il Characteristic lunghezza l basato sulla correlazione: l = V / A.
  5. Utilizzare riscaldata volume del campione V S e l'area della sezione trasversale del campione foglio per calcolare A [m 2]. La superficie fogliare sezione trasversale corrisponde alla A cond secondo l'equazione 13, dove A cond è la zona dove si verifica la conduzione, r è il raggio laser dello spot laser e d s è lo spessore del foglio.
    Equazione 13: Equazione
  6. Calcolare A rad e A conv secondo l'Equazione 14, dove A è l'area del laser dello spot laser.
    Equazione 14: Equazione
  7. Equazioni sostitutivi 9, 12 e 13 in Equazione 11 e risolvere la seconda per λ, cedendo Equazione 15 dove t laser è tha durata dell'impulso laser [s].
    Equazione 15:
    Equazione
  8. Assumere un valore di 0,94 per ε e calcolare λ per ogni intervallo di 0,1 s tempo nei primi 20 s del profilo di temperatura. La media dei valori 200 per λ ottenuti in questo modo e calcolare la deviazione standard (Figura 3F - H).

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Representative Results

Misura della Proprietà Leaf

Utilizzando il metodo microscopico sopra, uno spessore del foglio di 0,22-0,29 × 10 - 3 m è stata determinata sia tabacum N. (0,25 ± 0,04 × 10 - 3 m, n = 33) e N. benthamiana (0,26 ± 0,02 × 10 - 3 m, n = 24), che è ben all'interno della 0,20-0,33 × 10 - gamma m 3 precedentemente riportato per le foglie di diverse specie vegetali 3. 3 m (n = 10), che era in una deviazione standard dei risultati derivanti dalla valutazione al microscopio - Determinazione dello spessore con un quadrante calibro valori di ~ 0,28 × 10 prodotto. Pertanto, la misura quadrante calibro può essere preferito il metodo microscopico per la determinazione dello spessore in applicazioni di routine come era più facile da applicare ei risultati per c p, s e ʎ deviati meno del 10% dal più manodopera tecnica. La densità di N. tabacum e foglie benthamiana N. era di 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), che corrisponde al 631-918 kg m - 3 gamma precedentemente segnalato per le foglie in altre specie 3.

Calcolo della capacità Calore specifico

Profili di temperatura raccolti per specie Nicotiana mostrato un rapido aumento nel tempo dell'impulso laser fino alla temperatura massima (Tmax) è stato raggiunto in meno di 1 s. Dopo l'impulso, la temperatura diminuisce esponenzialmente fino a raggiungere la temperatura ambiente (T 0) (Figura 3A - E). Il calore specifico (c p, s -1 K -1 per N. tabacum e 2.252 ± 285 J kg -1 K -1 per N. benthamiana. Due impostazioni di coltivazione e durate sono stati utilizzati per ogni specie (vedi paragrafo 1.2), ma questo non ha influenzato c p, s (figura 4). Tuttavia, i valori p c, s diminuita linearmente dal vecchio (basso) per giovani (in alto) foglie (R 2 = 0,85) nel caso di N. tabacum (Figura 4A), che correlato al contenuto di acqua [gg -1 biomassa] che era stato determinato come differenza di biomassa umida al momento della raccolta e della massa dopo 72 ore di incubazione a 60 ° C 11. Questa correlazione tra il contenuto d'acqua e capacità termica specifica era in accordo con precedenti osservazioni da altri autori 13. Una correlazione inversa è stata osservata per N. benthamiana (R 2 = 0,79), dove la differenza tra i calori specifici di foglie di diversi gradi di scadenza (bottom = vecchie; top = giovane) erano solo il 13% rispetto al 21% per N. tabacum. Questa differenza può derivare dal fatto che il contenuto di acqua in foglie di N. benthamiana è quasi costante sui diversi gradi di foglia di stagionatura 11. Un'analisi di sensibilità rivelato che le differenze di c p, s erano proporzionali alle fluttuazioni dei parametri di misura in Equation 8. L'effetto del riflesso e potenza del laser trasmessa era sub-proporzionale, perché questi parametri non sono stati fattori individuali nell'equazione 7. Pertanto, l'effetto degli errori di questi due parametri era più piccola di quelle causate da fluttuazioni nella potenza del laser o la temperatura ambiente. In generale, la misura è stata considerata robusto quanto tutti i parametri coinvolti nel calcolo di c p, s avevano un coefficientevariazione inferiore al 10% (Figura 4C e D).

Figura 4
Figura 4: calore specifico e la conducibilità termica dei valori determinati per N. tabacum e N. benthamiana. A. Capacità di calore specifico e la conducibilità termica di N. tabacum lascia in base alla posizione del foglio sulla pianta (bottom = vecchie foglie; middle = foglie adulte; top = foglie giovani). Stelle e triangoli indicano le piante che erano 49 e 56 giorni, rispettivamente. B. Calore specifico e conducibilità termica di N. benthamiana foglie secondo la posizione del foglio sulla pianta. Stelle e triangoli indicano piante che sono state coltivate in una serra o fitotrone, rispettivamente. C. La sensibilità dei valori di capacità termica specifica alle variazioni dei parametri di input. Triangles mostrano valori di capacità termica specifica derivanti da un aumento del 10% (rosso, verso l'alto) o diminuire (blu, verso il basso) nei parametri singolo modello. D. Sensibilità dei valori di conducibilità termica alle variazioni dei parametri di ingresso. I triangoli segnano valori di scarpe conducibilità termica derivanti da un aumento del 10% (rosso, verso l'alto) o diminuire (blu, verso il basso) dei parametri di singolo modello. Le barre di errore in A e B indicano la deviazione standard (n≥3), mentre in C e D rappresentano la gamma completa dei valori ottenuti durante il 10% sensitività variazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Calcolo della conducibilità termica

La conducibilità termica (ʎ) è stata calcolata dai profili di temperatura di esponenzialeraccordo (Figura 3) in combinazione con le equazioni per il trasferimento di calore conduttivo e convettivo così come radiazione termica. Equazione 15 ha prodotto valori medi di 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) per N. tabacum e 0.41 ± 0.20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) per N. benthamiana. Non c'era alcuna correlazione tra ʎ ed età dell'impianto o l'impostazione di coltivazione, anche se una correlazione tra l'età delle foglie e ʎ è stato osservato per N. benthamiana (figura 4B), concordando con differenze di età-dipendente precedentemente segnalati in altre specie vegetali 14. Come discusso sopra, il contenuto di acqua era un motivo improbabile di questa differenza come è stato trovato per essere omogeneo in foglie di varia scadenza per N. benthamiana. Invece, ipotizziamo che i cambiamenti nella leaf tessuto, ad esempio, la composizione della parete cellulare, erano responsabili per questa osservazione alterando le proprietà di scambio calore foglie e comprometta il valore del ʎ così. La determinazione di ʎ era sensibile alle variazioni della temperatura ambiente. Un'analisi di sensibilità ha rivelato che le fluttuazioni di ± 2.3 K alterato il valore di ʎ da 64-125%. Secondo Equazione 15, la temperatura ambiente influisce dalla potenza di quattro sulla radiazione termica e quindi influenza direttamente il valore di ʎ.

Valutazione del apparato di misura

E 'stato possibile impostare il gruppo di misura entro 3 ore. Una volta che questo era completa, il tempo di avvio del sistema è stata di circa 15 min per serie di misurazioni. Misurazioni singole hanno meno di 3 minuti, inclusa la preparazione del campione e l'intero ciclo di misura. Analisi del tempo di esposizione laser rivelato che untempo di riscaldamento di 0,5 s ha determinato un aumento della temperatura di 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) era il migliore compromesso tra l'alta DT (raggiunto da impulsi laser di lunghezza) richiesto per un buon rapporto segnale-rumore (SNR) e il DT basso (raggiunto da impulsi laser corti) necessario per evitare danni ai tessuti. durata dell'impulso maggiore di 0,5 s provocato la perdita di massa dal campione, riflettendo probabilmente l'evaporazione dell'acqua e / o danni al tessuto fogliare come la temperatura del campione raggiunge fino a 70 ° C, mentre solo 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) sono stati osservati per 0,5 s impulsi laser. Per durate inferiori a 0,5 s, il rumore di temperatura di ± 0,31 K (deviazione standard, n = 25) hanno rappresentato per più del 5% del DT ed era quindi una parte significativa del DT. Al contrario, a 0.5 s rumore rappresentato solo il 2,5% del segnale ed è stato quindi considerato trascurabile. Inoltre, i campioni non riscaldare fino a più di ~ 45 ° C, che èuna temperatura che le piante di tabacco possono anche essere esposti nel tropico naturale habitat sub-tropicale e che è dannoso solo per le specie vegetali presenti in habitat tundra 15. La densità di potenza del laser era 170 kW m -2, mentre la radiazione solare naturale è tipicamente nell'intervallo di 1,0-1,4 kW m -2 16,17. Tuttavia, a causa del tempo molto breve dell'impulso, questa dose più alta energia ha probabilmente non danneggiare il tessuto fogliare come indicato da una analisi microscopica recentemente pubblicato 11. I dati di temperatura utilizzati per calcolare ʎ stati limitati ai primi 20 s dopo l'impulso laser perché solo in questo periodo ha il rumore (± 0,31 K) rappresentano meno del 5% del segnale di temperatura del campione ed era quindi considerato trascurabile. Quando sono stati utilizzati dati di temperatura da oltre il 20 s periodo di tempo, i valori calcolati per ʎ diminuite (Figura 3F). Una possibile spiegazione è che alcune delle ipotesifatta per il calcolo di ʎ non era applicabile per bassi valori di DT. In particolare, il termine descrive radiazione termica nell'Equazione 15 potrebbe essere stato colpito sia influenzata dalla via di alimentazione della temperatura. Inoltre, l'area circostante foglio macchia del campione esposta al laser potrebbe aver riscaldato leggermente e pertanto potrebbe non essere il dissipatore ideale assunto nel modello ridurre l'efficacia DT x ed infine il ʎ calcolato.

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Discussion

Il metodo di misura non distruttiva senza contatto sopra descritto può essere utilizzato per determinare c p, s e ʎ in modo simultaneo e riproducibile. Il calcolo dei ʎ in particolare dipende da diversi parametri che sono sensibili agli errori. Tuttavia, l'impatto di questi errori era lineare o sub-proporzionale, e il coefficiente di variazione per tutti i parametri è risultato essere inferiore al 10%. Anche se il metodo può quindi essere considerata robusta, alcuni miglioramenti tecnici possono essere apportate a ridurre i rimanenti fonti di errore.

Montaggio del campione nel complesso era tecnicamente difficile perché una superficie di foglia piatta è preferibile per la misurazione, ma il campione naturalmente ha una superficie ondulata. Questo problema potrebbe essere risolto progettando un portacampioni dedicato con geometrie regolato con precisione al campione foglio, ad esempio, lo spessore del foglio e larghezza, bloccaggio del campione nel preferireorientamento grado. Questo approccio renderebbe le misurazioni più riproducibile, ma comprometterebbe la natura senza contatto della misura perché il contatto ferma tra il campione e il titolare sarebbe necessario per tirare la piatta superficie del foglio. I vantaggi di usare questo tipo di supporto sarebbero pertanto dipendono dal contesto della misura, cioè, se la natura di precisione o senza contatto della misura è più importante. Al contrario, tali considerazioni non possono essere necessari a tutti per i fogli con una superficie piatta per sé, ad esempio, il riso e specie affini.

Trasferimento di calore convettivo dovuto al movimento dell'aria nell'ambiente del campione deve essere mantenuto al minimo durante le misurazioni perché questo incide fortemente il calcolo di entrambi c p, s e ʎ 18. L'apparecchio deve quindi essere collocato lontano da correnti d'aria generate dai sistemi di condizionamento, radiatori o altre apparecchiature, come computer conventole di raffreddamento integrali. Questo è importante anche perché variazioni del contenuto d'acqua relativa dei fogli 19 che potrebbero verificarsi prima o durante la misura a causa dell'evaporazione, che può essere aumentata da movimenti d'aria 20, non sono state valutate nel modello. Così, misurazioni, in particolare con i fogli staccati, dovrebbero essere effettuati rapidamente, come descritto nella sezione del protocollo per evitare errori durante l'acquisizione dei dati. In futuro, effetto dell'evaporazione sulla misura possono essere ridotti o evitati se la misura viene effettuata in una camera di misurazione almeno parzialmente chiuso con un controllo dell'umidità implementato.

La precisione di c p, s e valori ʎ può essere aumentata mediante la misura dei parametri utilizzati nelle corrispondenti equazioni più precisamente. Nel caso di c p, s questi parametri sono la potenza del laser, il volume massimo e temperatura ambiente e del campione, cioè, il prodotto di Laser area dello spot e lo spessore e la densità del campione (Equazione 8). Gli ultimi due parametri devono essere determinati in esperimenti che accompagnano la misura effettiva e la loro affidabilità può essere migliorata se diverse repliche biologiche rappresentativi sono testati. Tuttavia, anche quando è stata utilizzata una misura quadrante calibro semplice, la differenza di spessore del foglio rispetto ad un'analisi microscopica solo 11%, che ha influenzato i valori calcolati per c p, s e ʎ dallo stesso grado. Al contrario, la temperatura e la potenza del laser possono essere monitorati durante la misurazione. La precisione di c p, s può essere migliorata se questi dati on-line sono utilizzati al posto dei valori fissati per potenza del laser e la temperatura ambiente, ed i dati sono raccolti mediante sensori ben calibrati. Queste considerazioni valgono anche per ʎ, ma l'ambiente e le temperature del campione sono i parametri più importanti perché entrambi influenzano il valore calcolato dalla potenza di quattro.

Il calcolo attuale ʎ si è basata su diverse ipotesi per quanto riguarda il trasferimento di calore per convezione e radiazione termica. Ad esempio, l'emissività (ε) e il coefficiente di scambio termico convettivo (h) non sono stati misurati o calcolati esplicitamente nel metodo presentato sopra, ma sono stati ottenuti da precedenti pubblicazioni 18,21. L'accuratezza di ʎ potrebbe quindi essere migliorata determinando questi due parametri nelle condizioni di misura reali. Tuttavia, utilizzando i dati della letteratura per i calcoli, tuttavia, dato valori ʎ che erano all'interno della gamma determinata sperimentalmente per le altre specie vegetali per i quali le proprietà simili possono essere previsto a causa della loro filogenesi a specie Nicotiana e la loro fisiologia, vale a dire, piante erbacee 3. Anche se i valori per ε e h variavano sull'intero campo precedentemente riportato per questi valori nelle piante, ad esempio, 0,93-0,98 per ε 21, il loro effetto sul valore finale ʎ era <10% e quindi nel variazione naturale osservata qui.

Il metodo sopra esposto non solo era in grado di determinare le proprietà termiche di foglie indenni intatte e foglie staccate, ma anche correttamente identificato diversi tipi di danni più gravi introdotto intenzionalmente prima della misurazione. Pertanto, vari tipi di campioni di foglie possono essere facilmente distinti, fornendo uno strumento per rimuovere, prima dell'analisi, i campioni poveri che dovrebbe fornire dati a bassa qualità. Questa caratteristica potrebbe essere utilizzato per il controllo di qualità durante il monitoraggio di materiali biologici, come ad esempio, i campioni non riuscendo a soddisfare le specifiche in termini di c p, s e ʎ potrebbero essere esclusi dalla ulteriore elaborazione. Questo sarebbe un bene nel contesto di un processo altamente regolamentati come l'agricoltura molecolare 4.

I vantaggi di questo nuovo metodo rispetto ad altri inletteratura comprendono la movimentazione rapida del campione, minima preparazione, misura simultanea e non distruttiva senza contatto c p, s e ʎ, e l'uso di attrezzature comuni che possono essere trovati in molti laboratori ottici. Ciò faciliterà ampie applicazioni del metodo rispetto a quelli che richiedono dispositivi specializzati e costose come calorimetri scansione differenziale. Inoltre, calorimetria richiede il contatto diretto con il campione 22 per cui vi è un rischio di danni, e il metodo è di solito limitata alla misura della capacità termica specifica 22. Al contrario, mentre immagini termiche in grado di rilevare necrosi o cambiamenti fisici in foglie o intere piante in un modo senza contatto 23, ma richiede anche l'analisi delle immagini complesse e dispositivi specializzati dedicati 24 che potrebbe essere superata in futuro da telecamere IR meno costosi e più potenti e accompagnare periferiche. L'analisi spettrale è un altro contatto-frMetodo ee per l'analisi del contenuto di acqua e livelli di clorofilla 25, ma non è ancora stato utilizzato per determinare la capacità termica specifica e / o conducibilità termica.

Il metodo di misurazione qui riportate è un metodo efficace per determinare le proprietà termiche delle foglie delle piante con bassi costi di investimento e tempi di misurazione brevi. E 'stato utilizzato con successo per determinare c p, s e ʎ in N. tabacum e N. benthamiana, due specie che sono rilevanti nel settore dell'agricoltura molecolare 4. I valori calcolati per entrambi i parametri sulla base dei profili di temperatura foglia erano in buon accordo con quelli precedentemente riportati per altre specie vegetali 3. Il metodo è non distruttiva, senza contatto, e non richiede la preparazione del campione complesso, fornendo vantaggi rispetto tutti i metodi alternativi correnti per l'analisi delle proprietà termiche. Il design semplice può anche facilitare lo sviluppo di mano-held dispositivi per aumentare la flessibilità.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" tube Thorlabs SM1L10E Tube for fiber holder
Agarose Sigma Aldrich A0701 Agarose
Bi-Convex lense f=25.4 Thorlabs LB1761 Lense
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console Thorlabs PM100D Console for thermal surface absorber sensor
Digital Phosphor Oscilloscope  Tektronix DPO7104 Oscilloscope
DMR light microscope Leica n.a. Light microscope
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-2 Pycnometer
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Fiber holder Thorlabs Fiber holder
Forma -86 °C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Infrared Detector Optris CT Optris OPTCTLT15 Infrared detector
Infrared Detector Software Compact Connect Optris n.a. Control software for infrared detector
Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer PerkinElmer L1050 UV/VIS Spectrophotometer
Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module DILAS M1F-SS2.1 Laser
Laser cover Amtron LM200 Laser Cover
Laser Driver  Amtron CS 408 Laser Driver
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Photodiode sensor  Thorlabs PDA20H-EC Power sensor for transmission measurements
Precision weight Ohaus Analytical Plus Ohaus 80251552 Precision weight
Sample frame Fraunhofer ILT n.a. Fixation of the leaf sample
Software Pyro Control Amtron n.a. Laser Power Control Software
Stainless-steel-holder n.a. n.a. Holder for measurement set-up
Teflon plates 2 cm Fraunhofer ILT n.a. Teflon attenuation
Thermal surface absorber Power sensor Thorlabs S314C Sensor for laser power measurements
Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome
Zoc/Pro 6.51  EmTec Innovative Software n.a. Laser Control Software 

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References

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