Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale
Published 1/05/2017
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Biochemistry
 

Summary

La determinación de la estructura de la solución de una proteína por un pequeño ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) requiere muestras monodispersas. A continuación, se presentan dos posibilidades para asegurar un retraso mínimo entre la preparación de la muestra y de adquisición de datos: cromatografía de exclusión por tamaño en línea (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico en línea (IEC).

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Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

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Abstract

pequeño ángulo Biológica dispersión de rayos X (BioSAXS) es una poderosa técnica de la biología molecular y estructural utilizado para determinar estructura de la solución, el tamaño y forma de las partículas, y la relación de superficie a volumen de macromoléculas. La técnica es aplicable a una variedad muy amplia de condiciones de solución que abarcan una amplia gama de concentraciones, valores de pH, fuerzas iónicas, temperaturas, aditivos, etc., pero se requiere la muestra a ser monodispersa. Esta advertencia llevó a la implementación de sistemas de cromatografía de líquidos en líneas de luz SAXS. A continuación, describimos la integración aguas arriba de exclusión por tamaño (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico (IEC) en una línea de luz, diferentes métodos para la óptima sustracción de fondo, y la reducción de datos. Como ejemplo, se describe cómo usamos sec- y IEC-SAXS en un fragmento de la proteína esencial virus vaccinia D5, que consiste en un dominio D5N helicasa. Determinamos su forma general y el peso molecular, que muestra la estructura de hexameric THe proteína.

Introduction

BioSAXS es una poderosa herramienta para determinar la forma de los objetos de tamaño nanométrico 1-4. La dispersión de los rayos X por una solución que contiene macromoléculas, de un tamaño en el rango de nm, se registra en ángulos muy bajos. Este rango angular contiene información acerca de los parámetros globales: el radio de giro; la distancia entre partículas más grande; la forma de las partículas; y el grado de plegamiento, la desnaturalización, o trastorno. La técnica no requiere cristales, y la macromolécula se queda en solución y por lo tanto se puede mantener en condiciones que imitan ciertos parámetros importantes de la célula, tales como fuerza iónica, pH, etc. El conocimiento de estos factores podría ayudar a determinar, por ejemplo, el estado oligomérico fisiológicamente relevante de una proteína de interés o para validar un modelo propuesto de un complejo. La caracterización de las interacciones proteína-proteína en diferentes condiciones de tampón, la creación de modelos de dominios que faltan, el refinamiento de modelos de homología, y el dela terminación de los estados plegado y desplegado discretos se puede realizar rápida y fácilmente 5.

Al igual que con cualquier técnica, BioSAXS tiene debilidades intrínsecas: muestras de agregados o desnaturalizados, mezclas de partículas, muestras heterogéneas, daño por radiación, y los desajustes de amortiguamiento pueden resultar en datos de la ONU-interpretables. Para muchos métodos de análisis, se asume implícitamente que la muestra es monodispersa, el requisito de que es a menudo difícil de obtener en la práctica. En muchos casos, la degradación de la muestra es sutil y no se puede detectar en los datos por sí mismo, y cualquier intento de interpretar los datos da resultados inexactos o incluso engañosas. Para superar estos obstáculos, la combinación de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y SAXS se puso en práctica en muchas líneas de luz para garantizar la calidad de los datos y para hacer que esta técnica sea más accesible para las muestras cada vez más difíciles 6-11. Recientemente, hemos añadido un nuevo método para el repertorio mediante el desarrollo de intercambio iónico en líneacromatografía (IEC) -junto SAXS 12. Ambas técnicas están abriendo SAXS a una amplia gama de partículas biológicas antes imposibles de analizar. La elección del método a utilizar depende de las propiedades biofísicas de las partículas de interés.

SEC separa macromoléculas por su tamaño, por lo que se necesita al menos una diferencia del 10% en la masa molecular aparente para la separación. Las limitaciones físicas de la columna y las propiedades fisiológicas de las muestras, como las superficies hidrofóbicas, la flexibilidad y la falta de estabilidad, también complican la recogida de datos, análisis e interpretación.

Cromatografía de intercambio iónico, que separa las moléculas en base a su carga y, por lo tanto, su afinidad de unión a la columna de IEC, se puede utilizar en lugar de o además de la SEC. La carga total puede ser manipulado fácilmente cambiando el pH, o la variación de la concentración de sal del tampón, proporcionar un método relativamente simple para el el controladolución de las moléculas de la columna de la IEC. Mediante el uso de la carga, la separación de tipos y tamaños de moléculas similares, que de otro modo serían difíciles de separar, se puede realizar de forma rutinaria con la norma IEC. Además, IEC tiene la ventaja de ser capaz de hacer frente a las muestras diluidas, lo que permite que uno evite las etapas de concentración, que llevan el riesgo potencial de la desnaturalización de la proteína. Desafortunadamente, como la distribución de carga es altamente dependiente de la muestra, IEC requiere la optimización con respecto a el pH y las concentraciones de sal 13,14.

Para muchas proteínas que son difíciles de expresar, purificar, o ambos, sólo bajas cantidades de muestra están disponibles para el estudio. Es importante que sea eficiente y para reducir al mínimo el número de etapas de purificación y, por lo tanto, las pérdidas. Por esta razón, la última etapa de purificación es en línea directamente antes de la adquisición de datos SAXS, con el fin de aumentar la probabilidad de la recogida de un buen conjunto de datos.

aquí, Se presentan en línea y comparar SEC-SAXS e IEC-SAXS. Ambas técnicas se llevaron a cabo en la línea de luz BioSAXS BM29 en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Grenoble, Francia 15. Como caso de prueba, se utilizó el dominio D5N y helicasa de la proteína del virus vaccinia D5, que era bastante difícil de analizar estructuralmente utilizando otros métodos. El virus vaccinia es un miembro de la familia Poxviridae y es 98% idéntica a la virus de la viruela, la causa de la viruela. Utilizando el sistema de vaccinia, estudiamos la maquinaria de replicación, se centra aquí en la D5 esencial helicasa-primasa.

D5 es una proteína de 95 kDa con un dominio N-terminal primasa arqueo-eucariota (AEP) 16 seguido de una región de clúster cisteína (res. 240 a 345) 16. Más hacia el C-terminal viene un dominio D5N (res. 340 a 460), que siempre se asocia con helicasas de tipo D5, y, finalmente, una superfamilia 3 (SF3) de dominio helicasa (res. 460 a 785) 17 (Figure 1A). El dominio helicasa de D5 construye una estructura de anillo hexameric que se necesita para la unión apretada al ADN. Gracias a los recientes estudios de SAXS y EM, las estructuras de baja resolución de la primasa y la helicasa dominios son ahora conocidos 18.

Aquí, se muestra cómo utilizar las técnicas de cromatografía en línea ejecutados sobre la línea de luz BioSAXS BM29 en el ESRF para hacerse una idea de la estructura del fragmento C-terminal (residuos 323-785) de D5.

Protocol

1. Descripción de la Desconectado Preparación y generación de muestra de una proteína de D5 Supresión

NOTA: El D5 323-785 constructo (Figura 1A) se clonó, expresó y purificó como se describe 18.

  1. Clonar el constructo en el vector pPROEX HTB
    1. Realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en D5R utilizando los 5'-3-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC cebadores 'y 5' ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3 'y una mezcla de reacción de PCR con la polimerasa, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
    2. Purificar los fragmentos de PCR a través de columnas de centrifugación, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
    3. Digerir los fragmentos de PCR y el plásmido con la NcoI y las enzimas de restricción HindIII, siguiendo las recomendaciones del fabricante para la composición del tampón y tiempo de incubación.
    4. Ejecutar los fragmentos en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 0,5x (Tris 20 mM, 10 mM de ácido acético,y 0,5 mM EDTA) y teñir el gel con un tinte de ADN.
    5. Exponer el gel a la luz UV.
      Precaución: Use equipo de seguridad personal! Cortar las bandas de los fragmentos de PCR digeridos y el plásmido digerido y purificar el ADN utilizando un kit de columna de centrifugación de purificación de gel, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
    6. Ligar los fragmentos de PCR purificados en el plásmido utilizando un kit de ligadura rápido, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
    7. Transformar a través de choque térmico del producto de la reacción de ligación en bacterias competentes optimizados para la amplificación del plásmido.
      1. Añadir medio del producto de ligación a un vial de bacterias.
      2. Incubar el tubo de reacción en hielo durante 20 min.
      3. Incubar el tubo a 42 ° C durante 30 s.
      4. Se coloca el tubo en hielo durante 2 min.
      5. Añadir 1 ml de Luria Bertani (LB) caldo (Miller) sin antibióticos y dejar que las células se recuperen a 37 ° C durante 1 h.
      6. Centrifugar las células a 16.100 xg for 3 s en una centrífuga de mesa microtubo y eliminar la mayor parte del medio.
      7. Difundir las células sobre una placa de agar LB con ampicilina (concentración final de 50 mg / ml) y dejar que las colonias crecen a 37 ° C durante la noche.
    8. Poner una colonia en 3 ml de LB con ampicilina (concentración final de 50 mg / ml) y hacer crecer el cultivo a 37 ° C, con agitación a 160 rpm durante la noche.
    9. Siga las instrucciones del kit miniprep para extraer el plásmido.
    10. Enviar una muestra del plásmido para la secuenciación y análisis de la secuencia para la ausencia de mutaciones y para la correcta inserción.
    11. Transformar el pProEX HTB D5 323-785 construir en bacterias optimizadas para la expresión de proteínas (1 l usar y siga los pasos en el paso 1.1.7). Transmitir la bacteria en una placa de agar LB con ampicilina (50 mg / final ml).
    12. Para crear una cultura de partida, poner una colonia en 300 ml de LB con ampicilina (50 mg / FINAL ml) y crecer las bacterias a 37 ° C, agitando a 160 rpm durante la noche.
  2. Inocular 12 x 1 L de LB en presencia de ampicilina (50 mg / ml final), cada una con 20 ml de la pProEX HTB D5 323-785 bacterias cultivo iniciador a 37 ° C hasta una DO se alcanza 600 = 0,3. Reducir la temperatura a 18 ° C y inducir la expresión a una DO 600 = 0,5 con IPTG 1 mM. Se incuban las culturas, agitándolos a 160 rpm y 18 ° C durante la noche.
  3. Cosecha de las bacterias por centrifugación a 50.000 xg y a 4 ° C durante 30 min. Resuspender los sedimentos bacterianos en aproximadamente 150 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, 5 mM MgCl2, 10 mM β-mercaptoetanol y 10% de glicerol) con inhibidor de la proteasa 1x y 25 unidades ( U) / 10 ml de DNasa. Lisar las bacterias a través de sonicación en hielo (sonda 1 pulgada, la energía del 50%, 0,5-s de pulso, 0,5-s de pausa, 3x 5 min).
  4. Cargar el sobrenadante en una columna de afinidad de níquel (Ni-columna, 1,5 ml de volumen de lecho), y se lava con 10 volúmenes de columna (CV) de btampón ncontrar (mM Tris-HCl 50 [pH 7], NaCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol y 10% de glicerol), 10 CV de tampón de lavado (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 β-mercaptoetanol mM, y 10% de glicerol), y 10 CV de lavado de imidazol (50 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, e imidazol 30 mM). Eluir la D5 323-785 (mM Tris-HCl 20 [pH 7], NaCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, e imidazol 200 mM).
  5. Inspeccionar las diferentes etapas de purificación a través de dodecil sulfato de sodio (SDS) electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).
    1. Cargar 2-20 l de cada etapa de purificación de flujo a través mezclado con colorante de carga 1x (2x: 4% de SDS, 20% de glicerol, 120 mM Tris-HCl [pH 6,8], y 0,02% peso / volumen de azul de bromofenol) en un 10 % SDS gel y ejecutarlos en 200 V en 1 x tampón de Laemmli (Tris 25 mM, 0,192 M de glicina, y 0,1% SDS).
    2. Tinción del gel con una solución de azul de Coomassie-listo para el uso.
  6. Excªambiar la memoria intermedia de la proteína se eluyó con el uso de una columna de desalación de acuerdo con el manual del fabricante tampón de unión.
  7. Escindir el His-tag mediante la adición de virus del grabado del tabaco inclusión nuclear-a endopeptidasa (TEV, 1 mg / 100 mg de proteína) a la solución de proteína. Incubar a temperatura ambiente durante la noche.
  8. Compruebe la digestión mediante la realización de SDS-PAGE (véase el paso 1.5)
  9. Equilibrar la columna de Ni en tampón de unión. Deje que la solución de proteína pase a través y lavar las perlas con 2 CV de tampón de lavado imidazol mientras que recoge el flujo a través.
  10. Se concentra la proteína usando un concentrador centrífugo a un volumen final de 0,5 ml.
  11. Se inyecta la proteína concentrada en una columna de exclusión por tamaño equilibrada con tampón de filtración en gel (20 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, 10% de glicerol, y ditiotreitol 1 mM [TDT]).
  12. Recoger el flujo a través en 0,5 mL fracciones.
  13. Verificar la presencia y la pureza de la proteína en las muestras de los picos dela realización de SDS-PAGE (véase el paso 1.5).
  14. Combinar las fracciones del pico eluida de D5 323-785. Diluir la muestra a NaCl 25 mM y glicerol al 5%, manteniendo las concentraciones de Tris y DTT constante (por 5 ml de solución de proteína en 20 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, glicerol al 10%, y 1 mM de DTT, en primer lugar se añaden 5 ml de 20 mM Tris-HCl [pH 7] y DTT 1 mM, y después se añaden 20 ml de 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% de glicerol, y DTT 1 mM).
  15. Cargar la muestra en una columna de intercambio iónico. Utilizar tampón A (Tris 20 mM [pH 7], NaCl 25 mM, glicerol al 5%, y 1 mM DTT) y tampón B (Tris 20 mM [pH 7], 1 M NaCl, 5% de glicerol, y 1 mM DTT) para formar un gradiente de sal de 25 mM a 1 M.
  16. Recoger la proteína se eluyó en fracciones de 1,5 ml.
  17. Verificar la presencia y pureza de la proteína en las muestras de pico mediante la realización de SDS-PAGE (véase la etapa 1.5 y la Figura 1B)
  18. Reconcentrar la solución de proteína en un concentrador centrífugo a un volumen final de 0,5 ml.
  19. rerun la proteína concentrada en una columna de exclusión por tamaño en tampón de filtración en gel (20 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, glicerol al 5%, y DTT 1 mM; véase la etapa 1.11).

2. Recolección de Datos

NOTA: Solicitud de tiempo de haz tan pronto como sea posible. Para ESRF, directrices sobre los tipos de acceso disponibles y sobre cómo presentar una solicitud pueden encontrarse en:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Después de la aceptación de la propuesta y una invitación para el experimento, todos los participantes tienen que completar un entrenamiento de seguridad. Después de la validación de la formación, rellene el "A-forma" (a través del portal de usuario ESRF) para declarar los investigadores que visitan la línea de luz para el experimento, junto con la información de seguridad requerida en las muestras. Póngase en contacto con la persona de contacto local para discutir el experimento.

  1. La recopilación de datos SEC-SAXS
    NOTA: Para ONLpurificación INE, utilice el sistema de alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) instalado en BM29. El sistema consiste en un desgasificador en línea, una bomba binaria, una válvula para la selección de tampón y gradientes, un muestreador automático, una matriz de fotoespectrómetro UV-VIS, y un conductímetro. Se sujeta directamente a la capilaridad de flujo a través de la unidad de exposición 19 SAXS.
    1. Ponga 1 ml del tampón de filtración en gel a un lado. Conectar la botella de tampón al sistema SEC (el valor predeterminado es el puerto A).
    2. Elige la velocidad de flujo en función de la columna en uso. Nota: para la columna de exclusión por tamaño se utiliza aquí, el caudal es 0,1 ml / min. Definir la presión máxima para la columna, tomar nota de la contrapresión, y establecer el tiempo de adquisición de al menos 1,2 CV.
    3. Enjuague las bombas y los tubos de aguas arriba a través de la función "auto-purga".
    4. Esperar hasta que el sistema se llena con el tampón y conectar la columna. Equilibrar la columna haciendo pasar al menos 1,5 CV.
    5. Entrelazarla cabina y medir la memoria intermedia de lado en el paso 2.1.1, utilizando el cambiador de muestras para controlar la variación de la señal debido a los daños por radiación. Sólo continuar si no hay daño de la radiación a la memoria intermedia.
    6. Conmutar el sistema de control de la línea de luz a modo de HPLC. Hacer una prueba de funcionamiento de la memoria intermedia, la extracción de 200 fotogramas con 1 s por trama. Anote el número de cuentas dadas por el detector en la trama intensidad sumada.
      NOTA: La señal debe coincidir con el tampón de medida previamente, y la intensidad sumado con el tiempo debe permanecer constante. Si la señal no coincide o no es constante, se requiere un equilibrio más largo del sistema.
    7. Centrifugar la muestra a 13.000 xg en una centrífuga de mesa microtubo durante al menos 10 min.
    8. Introducir la muestra en un vial de vidrio con capacidad para un HPLC (siempre) y ponerlo en el autoinyector. Tenga en cuenta la posición bien.
    9. Enclavar la cabina experimental utilizando un procedimiento estándar, como se explica en la Formación Seguridad del usuario.
    10. Iniciar sesión y crear una carpeta para el almacenamiento de datos a través del software de control de la línea de luz.
    11. Programar el sistema HPLC utilizando la función "rápida por lotes". Establecer la ubicación de almacenamiento para los datos de UV a la carpeta creada en el paso 2.1.10. Asegúrese de activar la conversión ASCII automática de los datos UV, almacenar el archivo ASCII en la misma carpeta.
      1. Elija el volumen de inyección y posición bien. Añadir la medición que hacer cola pulsando el botón "Inicio". El software le pedirá para guardar el lote. Prepárese para el ahorro, pero no presione el botón "Guardar", ya que este se inicia automáticamente la medición.
    12. Configurar los parámetros de recogida de datos en el software de control de la línea de luz. Elige el número de fotogramas de modo que el tiempo total de recolección de datos se encuentra en ligero exceso del tiempo de adquisición se define en el paso 2.1.2.
    13. Abrir el obturador de seguridad e iniciar la recopilación de datos SAXS mediante el software de control de la línea de luz. Verificar que los datos son cortamente adquirida. Comparar los nuevos datos recogidos con los datos recopilados en el paso 2.1.6 y compruebe que el número de cuentas en la intensidad resumió permanece constante durante al menos 100 cuadros y coincide con el valor del paso 2.1.6.
      1. Comienza la SEC ejecuta pulsando el botón "Guardar", tal como se preparó en el paso 2.1.11, y tenga en cuenta el número de fotograma que aparece en el software CamServer cuando la inyección se ha completado y se inicia la adquisición de datos UV.
    14. Después de la recolección de datos, abra la base de datos ISPyB 20 en la ficha "adquisición de datos" y pulse el botón "Go" para acceder al conjunto de datos y los resultados del análisis automático 21.
  2. La recopilación de datos IEC-SAXS
    NOTA: En lugar de la gradiente lineal continua comúnmente aplicado en los experimentos de IEC, usar un gradiente paso a paso en el que se aumenta la cantidad de tampón B en pasos discretos prefijados.
    1. Crear el programa de HPLC para una sample-Free Run tampón. Programar un gradiente por etapas empezando desde 0% de tampón B y un aumento de 5 puntos porcentuales después de dos CV hasta que se alcanza el 100% de tampón B.
    2. Ponga un poco de cada tampón a un lado. Conectar la botella con el tampón de bajo contenido de sal de A a puerto A y el uno con el alto contenido de sal tampón B al puerto B.
    3. Elige la velocidad de flujo y mantenerse por debajo del límite de presión de la columna (en este ejemplo, 1 mL / min).
    4. Como en el paso 2.1.3, purgar las bombas y tuberías de aguas arriba mediante el uso de la función "auto-purga".
    5. Equilibrar el sistema en tampón de bajo contenido de sal A (véase la etapa 1.15) y conectar la columna de intercambio de iones. Espere hasta que la columna se equilibró por completo (al menos 1,5 CV).
    6. Utilice el tampón de lado en el paso 2.2.2 para examinar los tampones A y B para los daños por radiación utilizando el cambiador de muestras, como en el paso 2.1.5.
    7. Compruebe el tampón que sale de la columna, como en el paso 2.1.6. Comparar la señal a la señal de tampón A registrado en el paso 2.2.6. Tenga en cuenta el nuevonúmero de cuentas en la trama intensidad sumada.
    8. Crear una carpeta de almacenamiento de datos para la carrera de amortiguación.
    9. Configurar la recolección de datos en el modo de sistema de HPLC. Elige el número de cuadros de modo que el tiempo total de la recogida de datos está en exceso del tiempo total de la carrera IEC (ver paso 2.2.1).
    10. Abrir el obturador de seguridad e iniciar la recogida de datos de SAXS. Compruebe que proceda correctamente y vuelva a comprobar que la intensidad resumió permanece constante en el valor anotado en el paso 2.2.7 durante al menos 100 marcos.
    11. Utilice la función de "Single Run" del software de HPLC y empezar el gradiente escalonado programado en el paso 2.2.1. Para la inyección, establecer el número vial a -1 con el fin de inyectar ninguna muestra en este paso. Anote el número de cuadros adquiridos como se inicia el programa.
    12. Crear el programa de HPLC para el análisis de la muestra. Programar un gradiente paso a paso a partir de 0% de tampón B. estimar el porcentaje de tampón B en cada pico medido fuera de línea en el paso 1.1.5 ( (Figura 1C). Añadir un paso final en el 100% de tampón B durante 2,5 CV.
    13. Centrifugar la muestra a 13.000 xg en una centrífuga de mesa microtubo durante al menos 10 min.
    14. Diluir D5 323-785 en la concentración de sal de tampón A (25 mM) mediante su mezcla con 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% de glicerol, y DTT 1 mM.
    15. Cargar la muestra manualmente en la columna. Ponga la memoria intermedia de un tubo de entrada en la muestra diluida después de la pausa las bombas para evitar la formación de burbujas de aire. Desconectar la columna de los detectores para recoger directamente el flujo a través de la columna.
      1. Cuando el recipiente de la muestra está casi vacío, devuelva el tubo de entrada en tampón A (de nuevo haciendo una pausa las bombas mientras se mueve el tubo) y reiniciar el bombeo con tampón A para transferir la muestra de la tubería a la columna. Una vez que toda la muestra ha sidocargado, pasar 2 CV de tampón A, y luego vuelva a conectar la columna a los detectores.
    16. Para la ejecución de ejemplo, crear una carpeta para el almacenamiento de datos.
    17. Abrir el obturador de seguridad e iniciar la recogida de datos de SAXS. Compruebe que la recopilación de datos procede correctamente y vuelva a comprobar que la intensidad resumió permanece constante en el valor anotado en el paso 2.2.7 durante al menos 100 marcos.
    18. Utilice la función de "Single Run" del software de HPLC para iniciar el gradiente escalonado programado en el paso 2.2.12. Para la inyección, establecer el número vial a -1 con el fin de inyectar ninguna muestra en este paso. Anote el número de cuadros adquiridos como se inicia el programa.
    19. "Adquisición de datos" abiertos en ISPyB 20 y pulse el botón "Ir" para mirar el conjunto de datos y el análisis automático 21.
    20. Exportar los datos UV del sistema de HPLC a formato ASCII a través del software "Análisis Postrun".

3.SEC-SAXS Reducción de Datos y Análisis

  1. Abra los datos en la adquisición de datos en ISPyB pulsando el botón "Go". Apreciar, a la vista general que enmarca de la recolección de datos de SAXS se corresponden con el pico de elución. Compruebe que el radio de giro es estable a lo largo del pico.
  2. Confirmar que la corrección automática de amortiguación se ha realizado correctamente. Estructuras de carga de la parte central del pico en un programa que lleva a cabo las manipulaciones con los datos experimentales SAXS archivos 22 y un promedio de ellos. A continuación, cargue el archivo de búfer generada automáticamente y comprobar si las regiones de alta q de las tramas promediadas y el partido de los marcos de amortiguamiento.
  3. Comparación de los marcos adquiridas a lo largo del pico cuantitativamente mediante la prueba de CORMAP 23.
    1. Cargar las sustracciones creadas automáticamente (archivos * _sub.dat) de tramas que cubren la región de interés.
    2. Escalar el uno al otro pulsando el botón "Escala".
    3. Compare ellos con la característica de "Comparación de datos". No debe haber cambios sistemáticos entre los marcos a lo largo de la cima.
  4. Abre todos los marcos * -_ sub.dat de interés, fusionarlos con el botón "Combinar", y guardar el archivo en formato .dat fusionada.
  5. Determinar el radio de giro con la función "Radio de Giro" en el programa, señalando el primer punto de datos en el rango Guinier para su posterior cultivo de los datos a baja resolución.
  6. Determinar la función de distribución par-distancia con la función "Distancia de distribución" en el programa y guardar el archivo resultante como .out gnom.out.

4. Modelado ab initio

  1. En una máquina Unix, ejecute un programa de reconstrucción de 40 x ab initio modelo sin restricciones de simetría. Crear una nueva carpeta y copiar el archivo gnom.out a ella. Ejecutar el programa de la siguiente manera:
    para ((i = 1; i <= 40; i ++)); hacer dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i; reuno
  2. De forma análoga, ejecute un programa ab initio modelo de reconstrucción con restricciones de simetría de la simetría de seis veces en una segunda carpeta:
    para ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -ms -s -p P6 dammifp6_ $ i; hecho
  3. Alinear todos los archivos de salida del programa ab initio modelo de reconstrucción (* -1.pdb). En las dos carpetas de los pasos 4.1 y 4.2, ejecute damaver -a * -1.pdb.
  4. Abra la unión de todos los modelos (damaver.pdb), así como el modelo filtrado al volumen correcto (damfilt.pdb) en un software de visualización molecular adecuado 26 y compararlas.
  5. Abra el archivo damsel.log en un editor de texto. El modelo que figura como "referencia" en la parte inferior del archivo es el modelo más representativo.

5. IEC-SAXS Reducción de Datos, Análisis y Modelado

  1. En el programa que realiza la manipulación con los archivos de datos de SAXS experimentales 22, se carga sobre 50 SAXS marcos de cada etapa de mezcla dela carrera de amortiguación, pulse el botón de "promedio", y guardar los resultados.
  2. Basándose en los resultados de tratamiento de auto disponibles a través de ISPyB, identificar que enmarca del experimento corresponde a la elución de la proteína y verificar que el radio (preliminar) de giro es estable a lo largo del pico.
  3. Cargar los marcos en el programa de archivos de datos de la manipulación experimental SAXS 22 y un promedio de ellos, como lo hizo para los marcos de tampón (véase el paso 5.1). A continuación, cargar los archivos de búfer generados en el paso 5.1 y comparar las regiones de alta q (por encima de 4,2 nm -1) para encontrar un tampón que coincide con la media del pico.
    NOTA: No debe haber ningún desplazamiento entre la media del pico y el tampón sistemática. Si la curva de la muestra parece caer entre dos curvas de amortiguamiento, interpolar sus curvas mediante el cálculo de la media.
  4. Restar el tampón identificado como el mejor partido de la curva media de dispersión de la fracción del pico y guardar el resultado subtrarchivo actuado. Además, crear curvas resta utilizando las curvas de amortiguamiento promedio de las etapas de mezcla anteriores y siguientes para calcular el margen de error de la resta.
  5. Repita los pasos 5.3 y 5.4 de forma individual para las mitades izquierda y derecha del pico y comparar los resultados con los de la etapa 5.4 para comprobar la estabilidad de la señal a lo largo del pico.
  6. Siga los pasos 3.5 y 3.6 para las tres curvas restan de paso 5.4.
  7. Comparación de los resultados para las tres curvas sustraídas.
    Nota: Sólo los resultados que siguen siendo robusta dentro del margen de error de la resta se puede confiar.
  8. Realizar el modelado como en los pasos 4.1 y 4.2 para la mejor sustracción identificado en el paso 5.3.
  9. Siga el paso 4.3 a 4.5 a alinear los modelos e identificar el más representativo.

6. Comparación de los resultados

  1. Ejecutar un programa para superponer estructuras 3D 12 sobre los modelos representativos de la SEC (paso 4.5) unad datos IEC-SAXS (paso 5.9) con simetría P6: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. Importe el model_sec.pdb y la model_iec-r.pdb en un software de visualización molecular.
  3. Abrir los archivos de la .fir modelsec.pdb y la modeliec-r.pdb en una hoja de cálculo y crear un gráfico 2D de las curvas de dispersión experimentales y calculados.

Representative Results

Los resultados del análisis invariante modelo libre se enumeran en la Tabla 1. El análisis de los datos D5 323-785 SEC-SAXS mostró una estimación masa molecular (a partir de un análisis de Porod) de 345 kDa frente a 338 kDa, observó el uso de la norma IEC-SAXS. Ambos están de acuerdo con la masa esperada de 53,5 kDa 6 veces (321 kDa) para un hexámero. El ab initio de modelado de ambos conjuntos de datos se llevó a cabo sin simetría impuesta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) y el uso de la simetría C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Como los ajustes globales de los datos de dispersión, tanto para reconstrucciones son comparables en ambos casos (Figura 1D y E), C6 simetría puede ser asumida. Así, el modelo corresponde a una estructura en forma de cono hexagonal con un canal central, que aparece parcialmente obstruida (SEC: Figura 1F; IEC: Figura 1H). Un examen de los modelos individuales antes de promediar muestra que esta obstrucción es probable que sea un artefacto del proceso de promediado.

Figura 1
Figura 1: análisis de los datos SAXS y comparación de D5 323 -785 (figura adaptados de Referencias 12 y 18). A) estructura de dominio esquemática de la proteína D5 y D5 323-785. B) Desconectado cromatograma de intercambio iónico con la indicación de los tres picos. curva de naranja: la absorbancia a 280 nm (au), curva azul: porcentaje de tampón B. Los porcentajes de tampón B en los picos se indican. C) Online cromatograma de intercambio iónico. tecla de color como en B. Además, la intensidad medida se indica en verde. La curva de dispersión experimental unand calculado curva del modelo obtenido por SEC-SAXS D) y IEC E) análisis de los datos de D5 323-785. Modelo F) del grano de 323-785 D5 basado en la SEC información y datos G) IEC. H) superposición de los modelos de la SEC e IEC. Los paneles en F) a H) fueron creados usando un software de visualización molecular 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetros de recopilación de datos
Instrumento: ESRF BM29
Longitud de onda (Å) 0.99
q-rango (-1) 0,0032 - 0,49
De muestra a detector de distancia 2.864 m
Tiempo de exposición (s) 1 por trama
intervalo de concentración n / A
Temperatura (K) 293
Detector Pilatus 1M (Dectris)
Flux (fotones / s) 1 × 10 12
Tamaño del haz (m 2) 700 × 700
Parámetros estructurales para D5 323 a 785, SEC
I 0 (cm-1) [de la Guinier] 0,0237
Rg (Å) [de la Guinier] 48
q min Rg - q max Rg utilizado para Guinier 0,77 - 1,24
D max (Å) [a partir de p (r)] 145
q-gama utilizada para p (r) (Å -1) 0,02 - 0,17
Porod volumen V P (A 3) [de la dispersión] (570 ± 5) × 10 3
Masa molecular M r (kDa) [de la V p] 345
Calculado monomérica señor de la secuencia (kDa) 321
Parámetros estructurales para D5 323 a 785, IEC
I 0 (cm-1) [de la Guinier] 0,386
Rg (Å) [de la Guinier] 46,5 ± 0,1
q min Rg - q max Rg utilizado para Guinier 0,44-1,29
D max (Å) [a partir de p (r)] 120
q-gama utilizada para p (r) (Å -1) 0,03 - 0,18
Porod volumen V p (& #197; 3) [de la dispersión] (577 ± 5) × 10 3
Masa molecular M r (kDa) [de la V p] 339
Calculado hexameric señor de la secuencia (kDa) 321

Tabla 1: parámetros de datos de SAXS. La tabla resume los parámetros de SAXS adquisición y análisis de datos.

Discussion

Para muchas macromoléculas, una etapa de purificación final utilizando cromatografía se requiere antes de la recolección de datos SAXS para obtener un buen conjunto de datos de calidad. Sin embargo, no todas las muestras se mantienen estables; que pueden ser propensos a la agregación o re-equilibración a una mezcla de estados de oligomerización. Por lo tanto, se requiere una etapa de purificación final en línea en la línea de luz para minimizar el tiempo entre la purificación y la recopilación de datos con el fin de obtener los datos SAXS mejor calidad. Dependiendo de las propiedades biofísicas de la proteína de interés, SEC-SAXS o IEC-SAXS pueden ser elegidos para obtener una calidad óptima de la muestra. Aquí, en una construcción de proteína derivada de la helicasa / primasa D5, ambas técnicas se explican y discuten.

Adquisición de datos SEC-SAXS se está convirtiendo cada vez más estandarizado y está disponible en muchas líneas de luz BioSAXS. Análisis de los datos, especialmente la sustracción del fondo, es relativamente sencillo y fácil. Sin embargo, una señal de amortiguación establesy la separación suficiente de las especies macromoleculares sigue siendo esencial. Por lo tanto, es crítico para reservar el tiempo suficiente para equilibrar la columna a fondo. El fallo de este método puede ser debido a los contaminantes persistentes de tamaño similar a la proteína de interés, las concentraciones bajas, y tampones sensibles a la radiación.

En la práctica, inicialmente, SEC-SAXS es ​​probable que se utilicen como el método de elección para la mayoría de las muestras macromoleculares. Sin embargo, muchos protocolos de purificación requieren una etapa de IEC antes debido a la presencia de contaminantes o agregación. Dado que cada etapa de concentración y la cromatografía se asocia con pérdidas de muestra (estimado en 30 a 50%) y el tiempo, directa IEC-SAXS es ​​ventajoso. Para las muestras que no se pueden purificar por SEC, ya sea debido a la presencia de "contaminantes" de tamaño similar o porque severamente agregado a las concentraciones necesarias, IEC-SAXS siempre sería el mejor enfoque adecuado. Además, los caudales más altos compatiblespor el número de columnas de IEC pueden ayudar a reducir el tiempo de tránsito entre la purificación y la medición. En el ejemplo que aquí se presenta, IEC se utilizó con una etapa de elución, lo que permite la separación de los estrechos picos de D5 323-785 de contaminantes eligiendo cuidadosamente las etapas de concentración de sal. En principio, el número de pasos es ilimitado, pero en la práctica, se requiere al menos 1 paso por el pico, y no demasiados debe ser elegido. Para el método de sustracción de fondo se ha descrito anteriormente, es crucial para medir un número relativamente alto de diferentes composiciones de amortiguamiento con el fin de encontrar el juego.

Un inconveniente común de las dos técnicas es la falta de información precisa la concentración de proteína. Debido a esto, la determinación de masas precisa basada en la dispersión hacia delante no es posible. Para las proteínas globulares como D5 323 a 785, el volumen Porod ofrece una alternativa, aunque menos precisa estimación, la masa, pero para las proteínas altamente flexibles o desordenados, Este enfoque no sería válida.

Una variación del gradiente por etapas método IEC-SAXS se presenta aquí es el uso de un gradiente lineal en su lugar. Si bien es posible trabajar con tantos pasos como se desee para aislar sub-picos usando una elución por etapas, en el enfoque de gradiente lineal, se requiere para optimizar las condiciones de gradiente cuidadosamente con el fin de separar los picos completamente antes de iniciar el SAXS experimentar. sustracción de fondo en este enfoque podría hacerse frame-sabia y pudo ser verificada mediante la comparación de los cuadros individuales, pero requiere el manejo de datos más avanzada y un software dedicado no existe todavía.

La elección de una columna adecuada es crítica para ambas técnicas, ya que determina la separación de las especies macromoleculares. columnas de exclusión por tamaño difieren en la capacidad de carga, el rango de tamaño de macromoléculas separables, y la resolución, mientras que las columnas de intercambio iónico varían en el tipo y la densidadde sus cargos inmovilizados.

Mientras que el protocolo presentado aquí es específica de la línea de luz ESRF BM29, la adaptación a cualquier otra línea de luz SAXS es, en principio, sencillo. Los principales requisitos son un suficientemente alto flujo de rayos X y un detector adecuado (idealmente un solo contador de fotones), para adquirir datos razonables de señal a ruido en el intervalo de segundos o menos, y un sistema de cromatografía líquida en línea capaz de crear gradientes. La implementación exacta sería, por supuesto, dependerá del entorno en línea de haz local.

Los resultados obtenidos en D5 323-785 utilizando los dos métodos difieren ligeramente. El radio de giro es ligeramente menor para los datos de IEC que para los datos de la SEC, y los mínimos locales de la curva de dispersión se desplaza a vectores de dispersión de un poco más grandes. Esto significa que el D5 323-785 medido con IEC-SAXS es ligeramente más compacto que el D5 323-785 medido con SEC-SAXS. Esto podría be debido a diferencias en la preparación de la muestra, en el tiempo transcurrido entre la purificación y medida (IEC es más rápido), o, menos probable, a un contaminante en la muestra purificada-SEC. Los modelos de talón obtenidos de forma totalmente independiente con ambos métodos son comparables (Figura 1H). D5 323-785 muestra la estructura hueca hexameric espera 18.

En conclusión, en línea de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño en línea son importantes métodos de purificación bioquímicas que pueden ser acoplados directamente a SAXS 6,7,9-12,25,26. La sustracción de fondo de los datos IEC-SAXS es ​​un poco más difícil y ambigua que para SEC-SAXS, pero sin embargo es posible. Dependiendo de las propiedades biofísicas de la proteína de interés, tanto SEC y IEC-SAXS permiten la optimización de la separación de las especies con las ventajas inherentes. Proporcionar el ingenio que los pasos de validación (como se describe) se observan correctamente, los datos resultantes pueden ser analizadosla confianza h, y los modelos se pueden determinar usando las herramientas estándar disponibles en la comunidad. Juntos, los dos técnicas permiten la separación en línea para una amplia gama de macromoléculas biológicas, produciendo datos no accesibles a través de mediciones estáticas estándar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

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References

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