Colon-26 karcinom tumörbärande mus som en modell för studier av cancerkakexi

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Muskelförtvining är en allvarlig komplikation av olika kliniska tillstånd såsom cancer, sepsis, lever, cirros, hjärta och njursvikt, kronisk obstruktiv lungsjukdom, och AIDS. I synnerhet, är muskelförtvining tydlig i åtminstone 50% av patienterna med cancer 1. Förlust av skelettmuskel i cancer resultat från ökad proteinnedbrytning på grund av överaktivering av skelettmuskel proteolytiska system och / eller från minskad proteinsyntes 6. Lipolys är också uppenbart, vilket leder till utarmning av fettvävnad. Kliniskt, kakexi förknippas med minskad kvalitet och livslängd och beräknas vara dödsorsaken i 20-30% av cancerpatienter 7. Användning av experimentella modeller som liknar den mänskliga sjukdomen så nära som möjligt skulle vara fördelaktigt. En optimal djurmodell kännetecknas av hög reproducerbarhet, liksom med begränsad interferens från olika terapier och oförutsägbara faktorer avdiet, kön och genetisk bakgrund som vanligtvis är associerade med det kliniska tillståndet 8. Hittills har cancerkakexi studerats huvudsakligen i djurmodeller som kännetecknas av transplantation av cancerceller eller injektion av cancerframkallande ämnen, även om en ny metod är att använda genetiskt modifierade möss som är mottagliga för utveckling av cancer.

Möss som bar den C26-karcinom (även hänvisad till som kolon-26 och adenokarcinom) utgör en väl karakteriserad och i stor utsträckning använt modell av cancerkakexi 2,5. Tillväxten av C26 tumörresulterar i kroppen och muskel viktminskning, främst genom ökad fett och protein katabolism 9. I allmänhet är en 10% tumörvikten kontra den totala kroppsvikten i samband med en minskning på 20-25% i skelettmuskel vikt och en ökad utarmning av fett 3,10. Hepatomegali och splenomegali observeras också med tumörtillväxt, tillsammans med aktiveringen av akutfassvar och höjden av pro-INFLAmmatory cytokinnivåer 3,11. Bland dessa är det väl känt att IL-6 spelar en central roll i att medla muskelförtvining i C26-modellen, även om detta cytokin är förmodligen inte den enda inducerar kakexi 12. Förhöjda IL-6 orsakar muskelatrofi genom aktivering av JAK / STAT3-vägen, och hämma denna transkriptionsfaktor kan förhindra muskelförtvining 3,4.

Under C26-inducerad muskelförtvining, som i många villkor för muskelatrofi är muskelmassa förlorade till stor del genom minskningar i muskelproteinhalt över muskelfibrer, inte genom celldöd eller förlust av fibrer 13. I C26 kakexi, är en förskjutning mot mindre tvärsnittsarea observerades i både glykolytiska och oxidativa fibrer 2. Detta är också i linje med minskad muskelstyrka 5. Många grupper i världen har dragit nytta av C26-modellen för att upptäcka nya förmedlare av muskelförtvining eller kliniskt relevanta läkemedel för cancer cachexia. Emellertid har många olika förfaranden för användning av denna modell har rapporterats som lyfter bekymmer om konsistensen av de erhållna data och utgör hinder för reproducerbarhet i olika experimentella betingelser. Här rapporterar vi en typisk användning av denna modell för studier av cancerkakexi som ger standardiserade och reproducerbara data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Alla studier som beskrivs godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittéer Thomas Jefferson University och Indiana University School of Medicine.

1. C26 celltillväxt och beredning

  1. Erhålla C26 kolorektala cancerceller (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) och förbereda komplett tillväxtmedium (dvs hög-glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 1% glutamin och 1% streptomycin / penicillin).
    NOTERA: För att möjliggöra bättre inter-experimentella reproducerbarhet, är det föredraget att använda C26-celler vid en passage så låg som möjligt.
  2. Använd en kommersiellt tillgänglig cell mot plattan 50.000 celler / cm2 i kolvar med komplett tillväxtmedium. Inkubera dem i en fuktad atmosfär vid 37 ° C och 5% CO2 till dess att sub-konfluenta. Undvik odling dem med hög densitet att bakåtent differentiering och drivande av cell fenotyper.
  3. Efter den första passagen, att platt tillräckligt med celler implanteras i den planerade antalet djur. På dagen för cellimplantation, dissociera cellerna genom trypsinering med 0,02 ml 0,25% trypsin-EDTA-lösning per cm 2, neutralisera trypsinet genom att tillsätta åtminstone 3 ml färskt medium per ml trypsin, bestämma cellkoncentrationen i celler / ml , och återsuspendera antalet celler som behövs för experimentet (1 x 10 6 celler per mus) i steril PBS.
    OBS: C26 cellerna når sammanflytning när densiteten är ca 500.000 celler / cm 2.

2. Möss

  1. Slumpmässigt vuxna CD2F1 möss (minst 8 veckor gamla) i grupper (vanligtvis kontrollerar och tumörbärare) med minst n = 6 per grupp.
    OBS: C26 tumörer växer i Balb / c-möss också. Baserat på vår erfarenhet, CD2F1 möss representerar en mer mångsidig och ekonomisk värd för denna tumörmodell. Dessutom,liknar de kliniska och iakttagelser som rapporterats i andra experimentella modeller av cancerrelaterad muskelförtvining 14-16, kan könsskillnader i svaret på C26 kakexi även observeras 17 (se även tabell 1).
  2. Söva musen med isofluran genom inhalation (3% syre). Upprätthålla djuret under anestesi enbart för den tid som krävs för att utföra tumörinokuleringen. Att kontrollera att musen ligger på en uppvärmd dyna för att förhindra förlust av kroppsvärme. Innan du börjar tumörinjektionsproceduren, bekräfta korrekt anesthetization genom att försiktigt klämma de bakre tår.
    OBS: På grund av den tid som detta förfarande (vanligen några sekunder), inte är nödvändigt att använda veterinärögonsalva. Av samma anledning är kontrolldjur genomgår skenoperation förväntas inte gå ner i vikt.
  3. Med hjälp av en steril spruta 1 ml insulin med en 26-gauge nål, snabbt injicera 250 ul av lösningen innehållande tumor celler subkutant och intrascapularly i fettkudden på musen.
    OBS: Kontrolldjuren får 250 pl steril saltlösning intrascapularly i fettkudden.
  4. Placera djuret tillbaka i sin bur. Direkt observera musen åtminstone en gång varje 15 min tills den kan svara på varsam manipulation och har återfått en rätande reflex.
    OBS: Låt inte musen utan uppsikt, och förvara den på en varm återhämtning bur som innehåller ett fast substrat. Dessutom inte tillbaka musen för att djuret rummet tills det är helt återhämtat sig från anestesi. Generellt behöver möss behöver inte vara individuellt inhysas om utredaren syftar till att bedöma enskilda födointag. Om så är fallet och användning av automatiserade metaboliska burar inte finns, måste manuell registrering av livsmedelskonsumtionen ska utföras, möjligen dagligen och vid samma tidpunkt varje dag.
  5. Kontrollera mössen dagligen och spela deras kroppsvikter.
    OBS: Spela in kondition poäng ochburen beteenden kan skilja grader av kakexi och sjukdomsbeteende, som är användbar för behandlingsstudier 18.

3. dödshjälp och Blood Collection

  1. När viktminskning i tumör värdar kontra kontroller når 5%, 10%, eller 15% (mild, måttlig och svår utmärgling, respektive) jämfört med deras initiala kroppsvikt, avliva möss.
    OBS: Ett typiskt experiment kommer att utföras, tills en grupp når 10% viktförlust, på vilken tid alla grupper avlivas. Förlust av kroppsvikt bedöms genom mätning av kroppsvikten inclusive av tumören.
  2. Placera mus under isofluran narkos (3% syre). Dra blod med hjälp av en hjärtpunktion (ca 1 - 1,5 ml).
  3. Samla blodet i K 2 EDTA (18 mg) tomrör och placera dem på is. Centrifugera blodet (2000 x g under 15 min vid 4 ° C) och samla upp plasma / serum.
  4. Avliva musen med hjälp av cervical dislokation. Fortsätt till vävnad excision och insamling organ.

4. vävnader och organ Excision

OBS: För användning av vävnader i biokemiska eller molekylärbiologiska analyser, planerar att väga varje organ och vävnad och placera ett fragment omedelbart i förväg märkta cryotubes. Snap frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.

  1. För att undvika kontaminering av vävnadsprover med päls, spraya 70% etanol över hela kroppen.
  2. Placera musen på en dissektion säng i ryggläge och förlänga en lem vertikalt genom att fästa foten till en förhöjd byrett klämma.
  3. Ta tag i huden på nedre extremiteten med Dumont pincett och använda de krökta fina saxar för att försiktigt ta bort huden och fascia, utsätta den underliggande muskeln belliesna av den nedre extremiteten.
  4. Identifiera gastrocnemius på den bakre nedre extremiteterna av sitt ursprung i de laterala och mediala kondyler på bakre lårbenet och dess införande påcalcaneus via hälbenet senan.
    1. Fortsätt att skära gastrocnemius hälbenet senan. Greppa den distala änden av gastrocnemius med Dumont pincett och dra muskeln magen mot dess ursprung. Med sax, klippa muskeln på så nära som möjligt till lårbenet ursprung. Placera muskeln i en skål. Väg den omedelbart och fryser den i ett rör i flytande kväve.
      OBS: Var noga med att inte skära soleusmuskeln tillsammans med gastrocnemius. Om detta inträffar, försiktigt bort soleus genom att försiktigt dra bort det med pincett.
  5. Fortsätt att identifiera och skära ut tibialis anterior från sitt ursprung på anterolateralt ytan av skenbenet och dess införande på den mediala kilskrift via dess distala senan.
    1. För att få hävstångseffekt, håller foten genom att greppa siffrorna med pekfingret och tummen. Sätt spetsen på Dumont pincett omedelbart under den ytliga distala senan i tibialis och flytta pincetten så att blunt sidan kan användas för att lösgöra tibialismuskeln magen från den underliggande bindväven.
    2. Skär distala senan med hjälp av fina böjd sax, och sedan klippa muskeln i origo, så nära som möjligt till skenbenet.
  6. Öppna bukhålan genom att utföra en sagittal snitt med början i hypogastric regionen och flytta superiorly till epigastrisk regionen stoppa snittet precis ovanför membranet.
    OBS: Djupet på snittet bör endast vara tillräckligt för att bryta den abdominala muskeln väggen och den underliggande peritoneal fascia.
  7. Försiktigt bort levern genom att greppa den med de trubbiga spets pincett, och använda de fina böjd sax för att dissekera bort eventuella blodkärl eller bindväv som fäster levern till kaviteten. Se till att inte lämna några lober bakom. Väga och snäppa frysa levern i ett rör i flytande kväve.
  8. Använda trubbig spets pincett, flytta bort tarmen, och sedan exponera och fint bortmjälten. Ta tag i mjälten försiktigt med de trubbiga spets pincett och använda baksidan eller trubbig sidan av de fina böjd sax för att dissekera bort eventuella bindväv eller blodkärlen som vidhäftar mjälten till kaviteten. Väg och snäpp frysa den i ett rör i flytande kväve.
  9. Identifiera gonadala fettkuddar, som gränsar till bitestiklarna (hos män) eller livmoder (hos kvinnor). tag försiktigt epididymal fettkudden med trubbig spets pincett och dra vävnaden ut ur kaviteten. Genom att använda de fina böjd sax, skära bort för gonadal vävnad som kan vara bunden till fettkudden. Väg fettkudden och snäpp frysa den i ett rör i flytande kväve.
    OBS: I allmänhet är denna fettvävnad anses vara representativa för den totala kroppsfett massa hos möss och avtar i vikt med kakexi. Andra fettkuddar kan på liknande sätt identifieras, dissekeras, avlägsnades och vägdes.
  10. Använda de krökta fina saxar för att öppna bröstkorgen av djuret. Skär bort revbenen knutna till båda sido gränser sternum. Ta bort bröstbenet. Med hjälp av två par pincett, ta tag varje sida av bröstkorgen och dra varje sida i sidled för att öppna brösthålan.
  11. Fint dra hjärtat med pincett. Noggrant skära ut hjärtat med de krökta fina sax genom att bryta aorta till vänster förmak. Se till att tömma organ eventuellt kvarvarande blod genom fint blotting den mot några absorberande papper. Väg och snäpp frysa den i ett rör i flytande kväve.

5. Muskel Frysning och montering

  1. Doppa den nedre halvan av en liten plastbägare (50 ml) innehållande isopentan i flytande kväve. Den isopentan är klar att använda när det blir lätt viskös och bildar en solid vit laminat foder insidan av bägaren (temperatur: -160 ° C).
    OBS: Använd alltid gnistfria brons eller aluminium handverktyg. Undvik inandning av produktånga. Använd med tillräcklig ventilation. Om att hantera spill och ventilation är omöjlig eller impractical, bära en lämplig andningsskydd.
  2. Frysa några bädda medium på en chuck (kork) genom att doppa det kort (10 sek) i isopentan.
  3. Hantera muskeln (eg., Tibialis eller gastrocnemius) genom att hålla den av senan, vertikalt relativt korken, för att bibehålla orienteringen av fibrerna och för att medge tvärsektioner.
  4. Sätt försiktigt änddelen av den färska muskeln ovanpå den frusna inbäddning mediet.
    OBS: Muskeln kommer att hålla. Det är viktigt att inte helt omge muskeln med inbäddning medium. Det är också viktigt att upprätthålla den vertikala orienteringen för efterföljande bestämning av tvärsnittsarean.
  5. Doppa chucken med den bifogade muskel i isopentan bad (den vanliga frystiden är 7-15 sekunder, beroende på provet storlek och sammansättning).
    OBS: Immersion i fryslösning bör inte vara längre än vad som behövs för att helt frysa provet. Frysning alltför länge kommer fracture vävnadsblocket, medan en alltför kort tid kommer att orsaka iskristallbildning. En väl frusna provet blir kritvit.
  6. Efter frysning av provet och placera det i en liten plastpåse eller provrör (50 ml) och omedelbart lagra den i en frys vid -80 ° C eller i flytande kväve.

6. Analys av rådata

  1. För att kontrollera för variationer i storleken av mössen, normalisera den slutliga kroppsvikten (FBW); tumörfria kroppsvikt; och kadaver, organ och vävnadsvikt (uttryckt i gram) i enlighet med den initiala kroppsvikten (IBW), och uttrycka dem som "vikt / 100 mg IBW".
    OBS: Alternativt vissa forskare normalisera muskelmassa till tibia längd.
  2. Använda en mjukvara för dataanalys. Hitta medelvärdet och SD av de normaliserade vikter. Utföra statistiska analyser med oparade Students t-test mellan kontroller och C26-bärande möss.
    OBS: Resultaten kan presenteras i förhållande till kroppen (IBWoch tumörfria FBW) tumör, organ och vävnadsvikter.

7. Muscle Sektione

  1. Ställ in arbetstemperaturen för kryostaten inre kammaren till omkring -23 ° C.
  2. Tillåt provet (tidigare lagrad vid -80 ° C) för att acklimatisera vid arbetstemperaturen (ett par timmar bör vara tillräckligt).
  3. Cut multipel 8-im tjocka sektioner av provet (företrädesvis tibialis anterior eller gastrocnemius muskler) och samla dem på objektglas.
    OBS: Skär sektionen vid mitt magen regionen i muskeln. Även för den skull noggrannhet, skär sektionerna vinkelrätt mot monteringsaxeln.
  4. Hålla glasskivor inuti kryostaten kammaren. Låt inte dem tina om syftet är att utföra IF / IHC studier eller enzymatisk färgning.
  5. Lagra objektglasen vid -80 ° C för vidare analyser.

8. Utvärdering av Myofiber storlek av laminin Immunofluorescens (Alternativ 1)

19. Även om H & E-färgning av muskel sektioner representerar en värdefull och bekväm metod för analys av morfologi, är användningen av en IF-tillvägagångssätt 14 betydligt snabbare och anspråkslöst mer exakt än H & E-baserad metod. H & E metoder beskrivs nedan.

  1. Ta bort vävnadssnitt från antingen kryostaten eller -80 ° C lagring och låt dem ekvilibrera till rumstemperatur (ca 5 - 10 min).
    OBS: För att undvika icke-specifika interaktioner i samband med primära antikroppar framkallade i möss, är det lämpligt att antingen använda antikroppar upp i en annan art eller att använda sig av kommersiellt tillgängliga "mus-on-mus" immunodetektion kit.
  2. Doppa delarna i pre-cooled metanol (-20 ° C) under 10 min.
  3. Tvätta sektioner i rumstemperatur 1x PBS i 5 min.
  4. Ta bort PBS och använda en penna för immunohistokemiska applikationer att omringa avsnitten på bilden. Låt inte delar helt torr när som helst.
  5. Tillämpa en lämplig blockerande buffert (5-8% FBS i PBS eller 5% getserum i PBS) på sektionerna under 1 h vid RT.
  6. Avlägsna den blockerande buffert.
  7. Tillämpa antingen en kanin anti-laminin (1:30) eller en mus anti-dystrofin (01:30) primär antikropp i blockerande buffert i avsnitten under 2 h vid rumstemperatur (eller över natten vid 4 ° C) i en fuktkammare.
  8. Tvätta sektioner med 1 x PBS under 5 min.
  9. Ta bort tvättbufferten och tvätta sektioner igen i 1 x PBS under 5 min.
  10. Ta bort tvättbufferten och tillämpa en lämplig fluorescerande sekundär antikropp (1: 1000 i blockeringsbuffert) till de avsnitt i en fuktig kammare under 1 h vid RT.
  11. Ta bort den sekundära antikroppen och tvätta sektionerna med 1x PBS för 5min.
  12. Ta bort tvättbufferten och upprepa tvätt med 1 x PBS under 5 min. Avlägsna tvättbuffert och täcka sektioner med ett täckglas med användning av ett vattenbaserat medium.
  13. Identifiera de morfologiska egenskaperna hos muskeln med användning av digitala bilder av det färgade sektionen. För att göra detta, använd en inverterad fluorescerande ljusmikroskop för IF sektioner (en 10X eller 20X förstoring målet är lämplig), tillsammans med en digitalkamera och bildbehandlingsprogrammet. Placera en skala bar i varje digital bild (20 - 30 slumpmässiga fält rekommenderas för varje muskel avsnitt) för att underlätta kvantifieringen av CSA. Bilder ska sparas i .TIF-format för att vara kompatibel med bildanalysprogram med hjälp av ImageJ programmet.
  14. Använd en ImageJ makro att skilja bindväv från kontraktil vävnad (myofiber storlek) genom närvaron av fluorescerande sekundär antikropp i endomysium 20.
    OBS: makro- och instruktioner finns tillgängliga från authyttersta randområdena, Richard Lieber och Shannon Bremner.
  15. Öppna ImageJ programmet genom att dubbelklicka på ikonen på skrivbordet.
  16. Ladda CSA makro genom att klicka en gång på "Plugins" -fliken. Flytta markören nedåt för att välja "installera" genom att klicka på den en gång.
  17. Ladda tvärsnitts makro genom att välja den från mappen det har sparats i, och klicka sedan på "Öppna".
  18. När makrot har öppnats öppnar histologiska bilden innehåller skalfältet genom att klicka på "File" och sedan "Öppna" från ImageJ verktygsfältet.
  19. När bilden öppnas, välj "rak linje funktionen" i ImageJ programmet genom att klicka på ikonen med den raka linjen.
  20. När "Rak linje verktyg" har valts, klicka en gång på den vänstra änden av skalan fältet och sedan klicka en gång på längst till höger änden av skalan bar. När du gjort korrekt, bör det finnas en gul linje överlagras på skalan baren.
  21. Att se till att den yellow linje fortfarande överlagras på skalan fältet, välj "Analysera" -fliken från ImageJ verktygsfältet genom att klicka på den en gång.
  22. Under fliken "Analysera", flytta markören nedåt och välj "set skala" genom att klicka på den en gång.
  23. I "Ange skala" fönster, inte ändrar värdet i "Avstånd i bildpunkter" rutan. Ange känd sträcka av skalan bar i "kända avståndet" låda. Ändra enheterna i "Unit längd" rutan för att motsvara de bar skalenheter (dvs mikrometer = pm). Slutligen, välj "globala" genom att klicka på rutan till vänster om "Global" en gång.
  24. Stäng "Set skala" fönstret.
  25. Öppna den första bilden som ska mätas genom att trycka på "O" på tangentbordet. Observera ett fönster pop-up som gör det möjligt för användaren att hitta och välja den bild som ska mätas från mappen det har sparats i. Markera bilden genom att klicka på den en gång och sedan klicka på "Öppna".
  26. <li> öppnad bör ett fönster för val av det acceptabla området för CSA mätningar och cirkel.
    OBS: Dessa inställningar är vanligtvis kvar till sina standardvärden. Men om man vill ändra inställningarna, se till att hålla de värden densamma för varje rad bild som ska mätas i experimentet.
  27. Efter inställning av CSA intervall och cirkel, observera bilden täckt av röda pixlar med en "Threshold" fönster. Justera tröskeln till bilden med hjälp staplarna i "Threshold" fönster tills muskelfibrer korrekt ifylld med röda pixlar.
    OBS: Försök att få det största antalet fibrer som inte vidrör varandra; om fibrer vidrör, kommer de att mätas som en stor fiber, som måste redigeras nedströms.
  28. Efter inställning av tröskeln genom att trycka på "1" -knappen på tangentbordet för att mäta muskelfibrerna.
  29. Cirkel de enskilda muskelfibrer med en gul linje.Flytta genom bilden och ta bort artefakter eller dubbla fibrer som har valts av programmet. För att göra detta, väljer de strukturer som inte är fibrer genom att klicka på dem en gång och tryck sedan på knappen "D" på tangentbordet. Detta kommer att ta bort dem från mätningarna.
  30. Välj och kopiera mätningar från "Mätvärde fönster" och klistra in dem i ett kalkylprogram för vidare analys.
    OBS: De värden som erhålls kan också användas för att bedöma analys fiberfördelningen, som i allmänhet representerar en användbar parameter för att bestämma huruvida tumörtillväxt befrämjar en förskjutning mot mindre muskelfibrer.
  31. Stäng alla öppna fönster i ImageJ genom att klicka på "X" i det övre vänstra hörnet av fönstren.
  32. Öppna en ny bild som ska mätas genom att trycka på "O" och upprepa steg från 8,24 till 8,29.

9. Utvärdering av Myofiber storlek från H & E färgade snitt (Alternativ 2)

  1. Placera glasglider in Coplin burkar innehållande filtrerad Harris hematoxylin under 8 minuter.
    OBS: Alternativt kan Mayer hematoxylin användas om en mindre intensiv fläck önskas.
  2. Skölj objektglasen i avjoniserat vatten.
  3. Doppa dem i kranvatten under upp till 5 min.
  4. Snabbt skölja dem i avjoniserat vatten, och sedan inkubera dem i filtrerat 1% eosin lösning för mindre än två minuter.
    OBS: Om en mer intensiv fläck önskas, tillsätt 1 - 2 droppar ättiksyra (0,01% eller mindre) till eosin lösning.
  5. Påbörja uttorkning steg. Skölj objektglasen i 70% etanol under mindre än 1 min.
  6. Doppa dem i 90% etanol under 1 min.
  7. Doppa dem i 95% etanol under 1 minut.
  8. Doppa dem i 100% etanol i 2 min.
  9. Doppa dem i xylen under 2 minuter. Flytta bilderna till en annan Copley burk innehållande färsk xylen för 2 mer min.
    OBS: Håll glasen i xylen (inte längre än en timme) tills de täck.
  10. Placera coverslips på muskel sektioner med hjälp Permount eller Xylen baserat monteringsmedel val.
  11. Beakta H & E-färgade objektglas under ett mikroskop med en 20X förstoring, och förvärva bilder av hela muskelarea. Få bilder med hjälp av en ljus-ljusmikroskop, digitalkamera, och bildbehandlingsprogrammet.
    OBS: Närvaron av en skala bar eller bild av en mikrometer tagen vid samma förstoring kommer att krävas för att bestämma CSA. Som ovan, spela in åtminstone 20 - 30 slumpmässiga fält för varje muskelsektion.
  12. Utvärdera myofiber storleken med ImageJ programvara. Öppet varje digital bild. Ställ in skala som ovan. Mät minst 1,500-2,000 muskelfibrer per muskel använder frihand markeringsverktyget, spåra fiber omkrets med en mus eller för snabbare inmatning, med en tablett inmatningsenhet och penna.

10. Datainsamling och analys

  1. För att fastställa muskelfiberstorleken, bedöma medelfiber "område."Beräkna medel och SD för mätningarna som erhålls för varje muskel, både området och Féret diameter. Dessutom, i syfte att utvärdera om den experimentella inställning är associerad med en förskjutning mot antingen mindre eller större muskelfibrer, analysera" fiberfördelning . "
  2. Utvärdera betydelsen av resultatet genom att utföra ett oparat t-test för två grupper. Bestämma förhållandet mellan de värden som erhållits för C26 möss gruppen och kontrollgruppen. Rita värdena i ett diagram rapporterar medel SD och frekvensfördelningen / histogram syftar till att påvisa förändring i fiberstorlekar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C26 tumörtillväxt kinetik visar en eftersläpning fas för första 7-8 d efter injektion, följt av exponentiell celltillväxt (4-5 d). Tumörmassan når så småningom ~ 10% av kroppsvikten (cirka 2 g, Figur 1A-B). Under den första fasen, kan tumören lokaliseras med endast palpation och visas som en liten utskjutande i huden. I den andra fasen, är tumören observerades som en massa under huden. I sällsynta fall blir tumören såriga, vilket resulterar i ett öppet sår; i detta fall är musen uteslutna från den experimentella grupp och är ett humant avlivas.

Kroppsvikt är oförändrad i den första fasen, men det är signifikant minskad i den andra fasen, när den når 10 - 15% av den initiala kroppsvikten (30% i fallet med tumörfria vikt, figur 1 A). Tumörbärande möss verkar slösas bort och visade dishevelled päls vid slutet av denförsöksperioden, med en kondition (BC) poäng lika med en 18 (Figur 1C). BC1 representerar en svårt utmärglad mus, där skelettdelar är uppenbara och kotorna är tydligt segmenterad. Viktminskning främst förklaras av både skelettmuskel och fettvävnad slöseri (Figur 1B). Viktminskning är förenlig med en minskning med cirka 20-30% i skelettmuskel vikt, särskilt i gastrocnemius, tibialis anterior, och quadriceps (Figur 2). Hjärtmuskeln är minskade också signifikant i vikt, om än i mindre utsträckning jämfört med de andra skelettmuskulaturen (Figur 2). Interestingly, hepatomegali (+ 16%, p <0,01) och splenomegali (+ 110%, p <0,01) är allmänt detekteras i tumör värdar, samtidigt som fettmassa, liknande skelettmuskel, allvarligt utarmas (-70%, p <0,001 ; Figur 3).

(figur 4A-B). I synnerhet, visade analys frekvensfördelning i en förskjutning mot mindre storlek fibrer i C26-bärande möss, vilket tyder på att hela muskeln undergår atrofi i närvaro av en C26 tumör (figur 4C). Liknande resultat kan observeras genom att dra fördel av ett traditionellt H & E-baserad metod för kvantifiering av fiberstorleken, även om storleken på förändringen i muskel CSA associerat med cancertillväxt är något annorlunda (38% mot kontroll, p <0,01 för IF -baserad metod; -18% mot kontroll, p <0,01 för H & E-baserad metod, Figur 5).

Figur 1
Figur 1: Kroppsvikter i Kontroll och C26-bärande möss. A) Kroppsvikt kurvan i kontroll och C26 värdar över hela försöksperioden (14 dagar efter tumörinjektion). B) Ursprunglig kroppsvikt (IBW), sluttumörfria kroppsvikt (FBW), och tumörvikt i kontroll och C26- bärande djur. C) Representativa bilder av kontroller och C26-bärare vid tidpunkten för avlivning (dag 14 efter tumörinokulering). Data uttrycks som medelvärdet SD. n = 6. Betydelsen av skillnaderna: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 jämfört med kontrollgruppen med hjälp av t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Muscle vikter i Kontroll och C26 bärande möss. Tibialis, gastrocnemius, quadriceps, och hjärt vikter i kontroll och C26 tumörbärare redovisas som vikt / 100 mg IBW. Data uttrycks som medelvärde SD. n = 6. Betydelsen av skillnaderna: ** p <0,01 och *** p <0,001 jämfört med kontrollgruppen med användning av Students t-test.

Figur 3
Figur 3:. Organvikter i Control and C26 bärande möss Levern, mjälten och epididymala fettkudden vikter i kontroll och C26 tumör-bärare redovisas som vikten / 100 mg IBW. Data uttrycks som medelvärde SD. n = 6. Betydelsen av skillnaderna: ** p <0,01 i förhållande till kontrollgruppen.

figur 4
Figur 4: morfometri för Myofiber storlek genom immunofluorescens. A) Lysrör immunhistokemisk reaktion av tibialis sektioner med hjälp av en anti-dystrofin antikropp (Vector Laboratories) från kontroll och C26 värdar. Förstoring: 10X. Storlek bar. 100 um B) Kvantifiering av CSA i tibialis muskeln mätt med ImageJ makro C) Frekvensdistribution av CSA i tibialis muskeln i kontroll och C26-bärande möss.. Data uttrycks som medelvärde ± SD. n = 6 för varje grupp. Betydelsen av skillnaderna: ** p <0,01 i förhållande till kontrollgruppen med användning av Students t-test.

figur 5
Figur 5: morfometri för Myofiber storlek av H & E. A) Hematoxylin & eosin färgning av tibialis sektioner från kontroll och C26 värdar. Förstoring: 20X. Storlek bar. 100 um B) Kvantifiering och frekvensfördelningCSA i tibialismuskeln. Data uttrycks som medelvärde SD. n = 6. Betydelsen av skillnaderna: *** p <0,001 jämfört med kontrollgruppen med användning av Students t-test.

författarna musstam mus kön Mobilnummer Ursprung Implanteras som fast tumör? Injektionsstället dagar
Lazarus et al., 1999 CD2F1 M 5 x 10 5 NCI NEJ ryggregionen 17
Al-Majid och McCarthy, 2001 CD2F1 F 2,5 x 10 6 OSUMC NEJ ryggregionen 17
Samuels et al., 2001 Balb / c M 0,5 g / ml av tumör suspension ns JA ryggregionen Upp till 11
Acharyya et al., 2004 CD2F1 M 1 x 10 7 OSUMC NEJ höger flank Upp till 24
Aulino et al., 2010 Balb / c ns 0,5 mm 3 NCI JA ryggregionen 21
Benny-Klimek et al., 2010 CD2F1 F 1 x 10 6 OSUMC NEJ ryggregionen 14
Bonetto et al, 2011. 2012 CD2F1 F 1 x 10 6 OSUMC NEJ ryggregionen
Cosper och Leinwand, 2010 CD2F1 M + F 5 x 10 5 ns NEJ höger flank Upp till 27
Murphy et al., 2012 CD2F1 ns 5 x 10 5 NCI / OSUMC NEJ ryggregionen 14
Cornwell et al., 2014 CD2F1 M 5 x 10 5 NCI NEJ Höger och vänster flank Upp till 26
Assi et al., 2016 Balb / c ns 1 x 10 6 Cell Line Service NEJ ryggregionen Upp till 22

Tabell 1:. Jämförelse av de olika protokollen som används för C26 Implantation different protokoll för C26 implantation finns, med särskild hänvisning till musstam används cellantalet och typ av tumör ympades cell ursprung, injektionsstället, och längden på försöksperioden. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Kommersiell cellinje tjänsten NS: specificeras inte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Särskilt i sina senaste stadier, är kolorektal cancer i samband med utvecklingen av kakexi, som är ansvarig för dålig utfall och minskningar i patienternas livskvalitet. Många studier har fokuserat på behandling av tillstånd sekundärt till cancer; Trots många insatser i denna riktning, finns det fortfarande ingen godkänd behandling för cancerkakexi 21. Således är det viktigt att djurmodeller liknar människans patologi så nära som möjligt för att maximera översättningen av resultaten.

C26 tumörbärande möss är en vanligen använd experimentell modell av cancerkakexi 22-24. Denna modell liknar den mänskliga sjukdomen, visar minskningar i kroppen, muskler och fettmassa, liksom muskelfiber atrofi och ökat uttryck av inflammatoriska gener och ubiquitin ligas förenliga med markant protein hyperkatabolism 2,5. Trots detta, några skillnader med uppgifter som erhållits i cancer patieNTS har rapporterats 25,26. Faktum är att vissa funktioner i modellen, inklusive icke-fysiologisk tillväxtmiljö (t.ex. en ektopisk tumör vuxit subkutant i stället för ortotopiskt implanteras i mag-tarmkanalen), den relativt korta försöksperioden jämfört med andra modeller (t.ex. genetisk eller orthotopic injektion av tumörer), beroendet av IL-6 handling, och den nödvändiga användningen av CD2F1 eller Balb / c-möss kan representera allvarliga begränsningar och kunde begränsa tolkningen av resultaten.

Det nuvarande protokollet har visat sig vara mycket reproducerbar över många experiment som utförs i vårt laboratorium, bibehålla samma egenskaper och att jämförelser mellan resultat som erhållits vid olika tidpunkter, i olika geografiska platser, och av olika forskare 3,10. Men i syfte att främja reproducerbarhet av data, är det viktigt att fastställa tydliga och gemensamma riktlinjer.

som gathered från litteraturen, kanske flera varningar förhindra reproduktionen av samma data i två olika laboratorier. Av samma skäl kan användningen av olika protokoll generera olika fenotyper och utfall, samt leda till motstridiga och tvivelaktiga resultat. I själva verket har skillnaderna i att utföra denna djurmodell har rapporterats, främst till följd av stammen (Balb / c eller CD2F1) 2,5,27-29 eller kön av möss används 17, vilken typ av tumör som implanterades (en cellsuspension 3 , 29 i stället för en fast tumör i ett transplantat 2,30), tumörkälla (NCI, ATCC, eller OSUMC), antalet C26 celler som injicerades, och platsen för injektion eller implantation (flankerna 6,17, 31 eller ryggregionen 3,10,32). Ingen direkt jämförelse av effekter i samband med implantation av C26 cellinjer som erhållits från olika källor (främst OSUMC mot NCI) har någonsin gjorts, vilket hindrar oss från att dra några definitiva conclusions. Det är dock troligt att valet av källan till celler också signifikant kan påverka de förväntade resultaten. När man överväger valet av män kontra kvinnor, bör utredarna bli påmind om signifikanta skillnader i resultaten. I själva verket, enligt uppgifter från Cosper och Leinwand 17 manliga tumörbärande möss, på grund av frånvaron av östrogen, kan visa en mer allvarlig fenotyp än kvinnor, inklusive större hjärtmassförlust och dödlighet, en mer robust pro-inflammatoriska svar på tumören och större hjärt autophagy.

Speciellt för de forskare som inte är bekant med denna modell och kan inledningsvis inför problem, baserad på både en maktanalys och vår tidigare erfarenhet, användning av åtminstone 6 djur per experiment tillstånd (n = 6) är lämpligt för att upptäcka statist signifikanta skillnader. Det är också viktigt att randomisering utförs noggrant, så att initiala kroppsvikt i försöksdjurskiljer sig inte markant mellan grupper. På samma sätt är det tillrådligt att, i syfte att undvika inter-operatör variabilitet samma utredare utföra vävnads- och organsamling på varje djur. Vidare är det absolut nödvändigt att vävnader (särskilt muskel) fryses så snabbt som möjligt för att bevara RNA och enzymatiska struktur och aktivitet, speciellt om målet med studien är att utvärdera genuttryck eller för att bedöma enzymatiska aktiviteter. Dessutom i ett försök att bestämma muskel CSA, visade vi att rapportera fiberområdet är allmänt accepterat och företrädare för muskelfiberstorlek. Här presenterar vi två olika metoder för att bedöma muskel CSA. Såsom visas i figurerna 4-5, båda metoderna skulle kunna detektera en signifikant reduktion i myofiber storlek mellan kontroller och tumör värdar, även om graden av slösa verkade olika.

Denna diskrepans kan bero på det faktum att, även om båda metoderna är acceptabla sätt att åsnors muskelfiberstorlek, kvantifiering av muskelegenskaper från H & E-färgade objektglas är fortfarande en manuell eller halvautomatisk process, oftast arbetsintensiv, tidskrävande, och påverkas av begränsad noggrannhet. Baserat på vår erfarenhet, vi tror att IF-baserad metod är en mer exakt teknik för att rapportera muskel CSA. I själva verket är antalet fibrer som kan mätas automatiskt genom att dra fördel av denna teknik betydligt större, vilket sålunda ökar noggrannheten för mätningen. Notera, för båda teknikerna, är en alternativ metod för rapportering muskelmassa bedöma Ferets diameter. Intressant nog anses detta vara ett mycket tillförlitligt verktyg på grund av det faktum att denna parameter är till stor del oberoende av vinkeln av snittning. Andra parametrar, såsom "minimal innerdiameter" och "minimal ytterdiameter" är också okänslig mot planet för sektionering och kan användas i stället för Féret diameter som alternativa indikationer på fiber storlek.

Sammanfattningsvis, även om kakexi samfundet måste tydligt att etablera mer fysiologiska modeller för studier av tumörassocierade muskelförtvining, vi tror att möss som bär C26 kolonkarcinom representerar en väl standardiserad och lätt att använda modellen för att undersöka molekylära förändringar och fysiologiska störningar vanligtvis detekteras efter uppträdandet av en tumör. Framtida tillämpningar kommer att innebära att utreda huruvida orthotopic implantation av C26-celler i tjocktarmen kan utgöra en korrekt och mer fysiologisk modell av kolorektal cancer kakexi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Flasks Falcon - Becton Dickinson 35-5001
DMEM Cellgro 10-017-CV
FBS Gibco 26140
Streptomycin-Penicillin  Cellgro 30-002-CI
CD2F1 mice Harlan 060
Anesthesia apparatus EZ-Anesthesia EZ-7000
2-Methyl Butane Sigma-Aldrich M32631
OCT Tissue-Tek 4583
Cryostat Leica CM1850
Cork disks Electron Microscopy Sciences 63305
Superfrost plus glass slides VWR 48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody Vector Laboratories VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG Life Technologies A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG Life Technologies A21211
Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS216
Eosin Sigma-Aldrich HT110332
Xylene Acros Organics 422680025
Cytoseal-XYL Thermo 8312-4
Microscope Zeiss Observer.Z1 
Bamboo Tablet Wacom CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011 Microsoft Corp.
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer BD 365873

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
  2. Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
  3. Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
  4. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
  5. Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
  6. Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
  7. Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
  8. Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
  9. Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
  10. Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
  11. Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
  12. Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
  13. Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
  14. Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
  15. Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
  16. Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
  17. Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
  18. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
  19. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
  20. Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
  21. Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
  22. Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
  23. Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
  24. Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
  25. Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
  26. Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
  27. Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
  28. al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
  29. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
  30. Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
  31. Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
  32. Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics