Quantification histologique chronique Infarctus du myocarde chez le rat

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Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. N. Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats. J. Vis. Exp. (118), e54914, doi:10.3791/54914 (2016).

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Abstract

Introduction

L'infarctus du myocarde (MI) est une cause majeure de décès et d'invalidité dans le monde entier. La maladie coronarienne est la principale cause; MI résulte d'une ischémie coronarienne consécutive à des événements tels que l'occlusion. Lorsque reperfusion est pas effectuée dans les 6 premières heures, l'ischémie induit une nécrose myocardique irréversible. Chez les patients, la caractérisation des MI repose sur différents outils de diagnostic, y compris les signes cliniques, l' électrocardiographie, l' évaluation des niveaux plasmatiques de biomarqueurs, l' échocardiographie, l' imagerie IRM, et des analyses histologiques 1. MI aiguë et chronique sont classés comme deux phases différentes de blessures selon le calendrier de la nécrose myocardique par rapport au temps de l'occlusion coronaire. La phase aiguë, survenant pendant les 7 premiers jours, est associée à la perte de cardiomyocytes, une inflammation généralisée, et le recrutement de fibroblastes. La phase subaiguë, caractérisé par cicatrisation du tissu cardiaque et la formation d'une cicatrice, surviententre 1 et 4 - 6 semaines. Expansion de l'infarctus, paroi du ventricule amincissement, et le ventricule dilatation caractérisent la phase chronique. Remodelage extensif du ventricule gauche entraîne progressivement une insuffisance cardiaque sévère 2.

MI induite par artère descendante antérieure gauche permanente (LAD) ligature représente le modèle standard pour rongeurs d'infarctus du myocarde chronique. Les ligatures imite coronaires l'occlusion coronaire. La taille de l'infarctus dépend du site de la ligature. Caractérisation de la lésion ischémique du myocarde chez un modèle de rongeur est réalisée de façon classique en utilisant les taux plasmatiques des marqueurs biologiques tels que la troponine I et T 3 échocardiographie, l' IRM et l' histologie 4,5. les niveaux de biomarqueurs sont corrélés avec le degré de cardiomyocytes mort. Échocardiographie évalue la gauche altération de la fonction ventriculaire résultant d'anomalies de mouvement de la paroi régionales. En outre, les techniques d'imagerie non invasives, telles que l'IRM à haute résolution ouéchocardiographie, permet l'évaluation de la réduction du mouvement de la paroi, le volume de la zone de cicatrice réduite et la perfusion myocardique viable et l'amincissement de la paroi. dimensions LV permettent l'évaluation précise de la taille de l'infarctus. Enfin, la quantification du myocarde viable et morte peut être effectuée en utilisant des taches spécifiques post-mortem de coupes histologiques de coeurs récoltés et permet de vérifier la taille de l'infarctus (IS). Une autre caractéristique importante est l'évaluation de l'indice d'expansion de l' infarctus (IE) 6. L'assurance-emploi est associé à l'infarctus transmural et commence dans les 3 premiers jours. L'assurance-emploi est caractérisé par une réduction progressive de l'épaisseur de paroi, une augmentation de la taille de la cavité LV, et les changements qui en découlent dans la forme de LV.

Afin d'évaluer l'efficacité thérapeutique des nouveaux traitements - en particulier, les stratégies de régénération basée sur des cellules, des matrices, et le gène évaluation de la prestation-précise de MI chez les rongeurs est d'une importance primordiale.Lorsqu'elle est mesurée sur une section transversale unique obtenue au niveau du muscle papillaire, la taille IS peut être biaisée en raison de la grande variabilité qui existe dans le développement des infarctus après ligature LAD; l'infarctus apex pourrait alors être occultée. Fait important, des méthodes plus précises à la taille MI déterminée ont été décrits pour les souris ou les rats 7-9 10. Néanmoins, IS est insuffisante pour quantifier avec précision le remodelage du VG ou des réductions thérapeutiquement induites (ou empêchements) du remodelage. En effet, IS est généralement exprimée en pourcentage du volume de LV totale évaluée sur des coupes transversales du coeur. Bien que cette méthode est valable pour l' IM aigu, l'amincissement de la paroi de LV se produisant pendant le remodelage reste sous-évalué 11,12. Une quantification morphométrique complète de la taille de l'infarctus et des changements structurels devrait quantifier plusieurs paramètres, tels que la longueur endocardique et épicardique et de diamètres, ainsi que des infarctus et des zones saines. Nous décrivons une appr méthodologiqueoche d'évaluer avec précision MI et le remodelage dans un modèle de rat chronique.

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Protocol

Tous les animaux ont reçu des soins humains en conformité avec la Convention européenne de protection des animaux. Les interventions chirurgicales ont été réalisées conformément à la loi suisse sur la protection des animaux après avoir obtenu l'autorisation de l'Office vétérinaire de l'Etat, Fribourg, approuvé par l'Office vétérinaire fédéral, Suisse.

1. Coeur de récolte

REMARQUE: Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie isoflurane. Des efforts ont été faits pour diminuer la souffrance animale. En particulier, tous les animaux ont reçu une injection sous-cutanée de 0,1 mg / kg de buprénorphine pré-anesthésie. Le protocole chirurgical pour introniser un infarctus du myocarde a été précédemment décrit ailleurs 13.

  1. Effectuer une sternotomie sur un animal myocardially infarci sous anesthésie (animal intubé, 2,5% d'isoflurane, l'anesthésie appropriée confirmée par la patte de pincement réflexe).
    1. Ouvrez l'animal en coupant la peau et les musclesavec des ciseaux chirurgicaux. Couper les nervures sur la gauche et à droite, puis retirez la poitrine.
    2. Retirez les adhérences qui restent après la chirurgie antérieure (LAD de ligature). Couper l'aorte et retirer le cœur. Mettez le tissu dans 1 M KCl (dans du PBS), puis le laver avec du PBS.

2. Préparation des tissus

  1. Mettez le cœur infarci longitudinalement dans une matrice de coeur de rat acrylique. Gardez-le à -20 ° C pendant 1 heure.
  2. Couper le coeur directement dans la matrice à l'aide d'une lame de rasoir avec une sécante. Veiller à chaque tranche est de 2 mm d'épaisseur. Couper environ 5-7 diapositives pour chaque coeur (en fonction du niveau de remodelage); ce qu'on appelle l'échantillonnage systématique.
  3. A ce stade, effectuer la coloration chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium de (TTC) est facultatif (conserver l'orientation des tranches cardiaques base-apex).
    1. Incuber à 1% dans du PBS CTT pendant 50 min à 37 ° C. Incuber dans 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 min à 1 h. Mettez les sections between deux plaques de verre avec 2 mm d'écartement et de prendre des photos avec un microscope stéréologique couplé avec un appareil photo à un grossissement 15X.
      PRUDENCE! Paraformaldéhyde est toxique.
  4. Glisser congélation (1 er choix)
    1. Mettre chaque lame dans un moule en plastique (10 x 10 x 5 mm) avec un milieu pour Cryotomie (température de coupe optimale, EAO) de montage, de maintenir l'orientation (placer le côté de sommet orienté de la section vers le bas sur le fond du moule). Congeler les blocs avec les vapeurs 2-méthylbutane sous azote liquide de refroidissement pendant 10 - 15 min. Enfin, stocker le tissu à -80 ° C.
  5. Paraffinization (2 e en option)
    1. Placer chaque lame dans l'intégration des cassettes (maintenir l'orientation en plaçant le côté orienté vers le sommet, de la section vers le bas sur le fond de la cassette), puis dans 4% de PFA pendant 24 heures. Mettez-le dans une machine pendant la nuit du processeur de tissus.
      1. Incuber dans de l'éthanol à 70% pendant 2 heures. Incuber dans ethanol 95% pendant 2 heures. Incuber dans de l'éthanol à 100% pendant 3 h. Incuber dans du xylol pendant 4 heures. Incuber dans de la paraffine (fondu à 60 ° C dans un four) pendant 5 heures. Enfin, faire des blocs en intégrant chaque diapositive de coeur dans de la paraffine.

3. Masson-Goldner trichrome Coloration

  1. Faire des coupes de tissus provenant des blocs de paraffine avec un microtome manuel (épaisseur: 5 pm) ou à partir de blocs d'OCT avec un cryostat fixé à -18 ° C (épaisseur: 7 pm).
  2. Colorer une diapositive de chaque partie de coeur pour chaque rat (3 - 4 sections transversales par diapositive) avec Masson-Goldner trichrome coloration (voir annexe).
    REMARQUE: à partir de cette étape pour les sections de paraffine.
    1. Faire fondre les lames à 60 ° C dans un four. Sous une hotte, Déparaffiner eux xylol deux fois pendant 10 minutes chacun. Réhydrater dans 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol et de l'eau distillée pendant 3 min à chaque fois.
      REMARQUE: à partir de cette étape pour le cryosections.
    2. Fixez-Bouin solution du jour au lendemain. Ensuite, rincez-les dans de l'eau du robinet pendant 10 - 15 min. Rincez-les dans de l'eau distillée. Incuber eux dans l'hématoxyline de Mayer pendant 3 min.
    3. Retirez les diapositives et les laisser dans l'eau distillée pendant 5 min. Ensuite, les incuber dans de l'acide Fuchsine-Ponceau pendant 5 min. Rincer dans de l'acide acétique à 1% pendant 1 min.
    4. Ensuite, les incuber dans de l'acide phosphomolybdique Orange G pendant 1 min. Rincez-les dans de l'acide acétique à 1% pendant 1 min, les incuber dans la teinture vert clair pendant 10 minutes, et rincez-les dans de l'acide acétique à 1% pendant 1 min.
    5. Déshydrater dans 70% d'éthanol (30 s), 95% d'éthanol (30 s) et 100% d'éthanol (5 min). Mettre une goutte d'un milieu de montage résineux sur les coupes de tissus, les couvrir avec des lamelles, et les laisser sécher.

4. Infarctus Analyse de la taille

  1. Acquérir une image de chaque diapositive sur un stéréomicroscope (grossissement 15X) couplé avec un appareil photo. Photographie d'une règle avec le même réglages.
  2. Utiliser un logiciel d'analyse d'image pour mesurer l'épaisseur de la cicatrice au milieu de l'infarctus, l'épaisseur de la cloison, le ventricule gauche (VG), la zone de cavité, la zone de l'infarctus et de la zone de tissu à l'aide de LV.
    1. Réglez l'échelle avec l'image de la règle (figure 1A).
      1. Cliquez sur Mesures puis sélectionnez Conversion Factor Set. Tracez une ligne sur la barre d'étalonnage. Faites un clic droit sur l'image et cliquez sur Terminer le calibrage. Notez la valeur de la barre, puis cliquez sur OK.
    2. Sélectionnez le LV de l'image du cœur teinté (figure 1B). Utilisez l'outil multiple de segment. Sélectionnez le point par point LV, et cliquez ensuite à droite Copier / Coller partout.
    3. Mesurer l'épaisseur de la cicatrice et le septum en utilisant l'outil de mesure du seul segment (figure 1C
    4. Détecter automatiquement la LV cavité, Infarctus, et les zones BT en utilisant l'outil de mesure de la zone automatique en mode RGB (figure 1D).
      1. Cliquez sur l'outil. Activer seulement les frontières et Contigu en mode RVB. Enfin, cliquez dans la zone d'intérêt pour le détecter. Si nécessaire, utiliser des outils de précision.
  3. Calculer la taille de l'infarctus comme étant le rapport de la zone de l'infarctus dans la zone basse tension.
  4. Calculer l'indice d'expansion comme suit: [LV zone de cavité / surface entière LV] / [épaisseur de l'infarctus / épaisseur de la cloison], avec toute la surface LV comprenant à la fois de la cavité VG et des zones de tissu BT.
  5. Enfin, calculer une "moyenne" pour chaque coeur comme suit: [moyenne de l'indice d'expansion des diapositives infarcis] * [Nombre de diapositives infarcis / Nombre total de diapositives].

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Representative Results

Six semaines après la ligature LAD, les cœurs ont été récoltées à partir de rats Lewis. coupes de tissus de 2 mm ont été obtenus à partir de l'apex à la base. Une procédure de coloration TTC a été réalisée pour visualiser la zone de l' infarctus, qui apparaît en blanc, et le myocarde sain, qui apparaît en rouge (Figure 2). Selon le site de la ligature de la LAD, la taille de l'infarctus varie. Pour les grands MI, Infarctus transmural ont été observées du sommet à la base (figure 2A). Petits infarctus présentés blanc tissu infarci visible depuis le sommet de la section médiane du coeur (figure 2B). Pour les petits infarctus non transmural, un tissu fibrotique a été observée sur une ou deux sections à partir du sommet (figure 2C).

Minces sections de 5 um de chaque tranche de coeur ont été coupées et colorées avec Masson-Goldner trichrome. Les photos de toute la section transversale du coeur étaientacquise sous un stéréomicroscope (Figure 3). tissus sains sont apparus dans le tissu rouge et le connectif en vert. La discrimination entre chaque couleur peut être facilement réalisée avec un logiciel d'analyse d'image.

Les épaisseurs de l'infarctus et de la cloison, la surface de la cavité VG et la surface totale LV ont été mesurés et calculés pour calculer l'EI (tableau 1). L'assurance-emploi a été calculé pour chaque section. En fonction de la taille du coeur, le nombre de sections varie de 5 à 7. Pour chaque cœur, l'assurance-emploi est une moyenne de l'assurance-emploi de chaque section. L'assurance-emploi variait de 0 à 0,278 et a révélé un large éventail d'infarctus du myocarde, avec un CV de 58%. En comparaison, la moyenne du pourcentage d'infarctus du LV varie de 0 à 0,241, avec un CV de 54% (tableau 1). L'assurance-emploi et le pourcentage d'infarctus étaient significativement corrélées; une analyse non paramétrique de Spearman a fourni un coefficient de corrélation r-vaLue de 0,491 (p = 0,005) (figure 4A). Pour des valeurs de l'IE proches, comme 0,11 et 0,13, le pourcentage d'infarctus a varié de 5,8 à 24,1%.

La fonction cardiaque a été évaluée par haute résolution échocardiographie à 6 semaines post-LAD ligature sur des animaux anesthésiés et a été réalisée une fois avant la récolte cardiaque. L'assurance-emploi calculé à partir de la quantification histologique corrélée de manière significative avec l'EF. Une analyse non-paramétrique de Spearman a fourni une valeur r de -0,709 (p = 0,005) (figure 4B).

Figure 1
Figure 1. Étape par étape Illustration de l'utilisation du logiciel d'analyse d'images. délimitation automatique des couleurs et la longueur des mesures inclus les différentes étapes. A. Calibration: L'échelle de l'image a été mis en place. Une photo deune règle a été prise dans la même condition que la section de coeur. La longueur de la règle a été marquée pour définir le facteur de conversion d'échelle. Conversion de pixel en millimètres a été réalisée. Sélection B. LV: a été coupée Le ventricule droit hors de l'image en utilisant l'outil du logiciel de sélection. C. LV mesure de l' épaisseur de la paroi et le septum: L'outil de mesure unique a été utilisé pour quantifier les distances. Les barres d'échelle indiquent à 3 mm. Zone D. automatique quantification: délimitation automatique des couleurs a été réalisée en mode RVB. Auto-sélection a été effectuée après avoir sélectionné le mode de sélection automatique. sélection de couleur peut être modifiée; l'investigateur effectué un contrôle visuel des tissus verts sélectionnés et augmente ou diminue la région sélectionnée selon les besoins. Les barres d'échelle indiquent à 3 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2
Figure 2. Coeur coupes colorées avec TTC. sections de 2 mm du cœur plein ont été colorées avec TTC. myocardique Healthy est apparu dans les tissus rouges et fibrotiques en blanc. Trois coeurs avec différentes tailles d'infarctus sont présentés. Un grand Infarctus transmural, B: Infarctus moyen et C: petit infarctus. Les barres d'échelle indiquent à 3 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Coeur Sections colorées avec Masson-Goldner trichrome. sections 5 um ont été découpées dans chaque section de coeur obtenu 6 semaines post-LAD ligature. Stasections de l'INED ont été placées sous un stéréomicroscope. Photos des sections complètes ont été obtenues avec un grossissement 15X. L'image représentative, obtenue au niveau des muscles papillaires (retour flèche), montre myocardique saine dans les tissus rouges et fibrotiques en vert. Le tableau illustre le tracé automatique des couleurs avec le logiciel d'analyse d'image, ainsi que l'emplacement où l'épaisseur de l'infarctus et le septum a été mesurée (lignes noires). Les barres d'échelle indiquent à 3 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Corrélation entre l'Expansion Index (EI) et le pourcentage de l'infarctus liés à LV (A) ou de la fraction d'éjection (EF) (B). La régression linéaire (ligne noire) et 95% confientintervalles nce (lignes en pointillés) sont représentés. Le Spearman r-valeur non-paramétrique est rapporté. A: Le pourcentage d'infarctus et d' assurance - emploi en corrélation significative (r = 0,567; p = 0,003). L'indice de l'expansion de l'infarctus (EI) a été calculé comme [LV zone de cavité / zone entière LV] / [épaisseur de Infarctus / épaisseur du septum]. Toute la zone LV a été mesurée comme la cavité LV combinée et zone de tissu LV. Le pourcentage de l'infarctus a été calculée comme étant la zone de tissu zone de tissu BT / infarctus. B: La fonction évaluée à 6 semaines post-LAD ligature en utilisant une échocardiographie haute résolution significativement corrélée avec l' assurance - emploi. Les deux paramètres étaient significativement corrélés (r = -0,709; p = 0,005). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Table1: Paramètres mesurés sur les sections cardiaques Masson Goldner colorées.

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Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

tissu fibrotique peut être évalué avec précision dans un modèle de rat MI chronique en utilisant l'échantillonnage systématique du cœur et de l'image récoltées analyses de coupes histologiques trichromatiques tachés obtenus de la base à l'apex. Deux étapes sont particulièrement importantes pour la mise en oeuvre du protocole de succès. Tout d'abord, l'utilisation de KCl pour le coeur la récolte permet au muscle cardiaque doit être maintenue dans un état détendu. Cette étape est importante pour les comparaisons des dimensions de l'infarctus de différents cœurs. Deuxièmement, la fixation du jour au lendemain de la section en solution Bouin est critique pour obtenir brillante coloration trichrome.

Modifications et dépannage

Absence de coloration peut être due à des difficultés lors de la fixation du profilé dans une solution de Bouin, tels que la réduction du temps d'incubation des solutions ou expirés Bouin. La coloration TTC est facultative et could être utilisé pour visualiser la taille de l'infarctus de façon rapide mais non quantitative. Il est important de noter que TTC peut être effectuée pour le même cœur avant l'inclusion dans les deux PTOM ou de la paraffine.

Limites de la technique

La présente approche permet un à choisir entre sections cardiaques paraffine et cryo-conservés et peuvent être utilisés pour immunocoloration. Néanmoins, le cœur plein doit être sectionnée, et le tissu ne peut pas être utilisé pour une analyse plus poussée, comme Western blot ou RT-PCR pour les protéines et l'expression des gènes analyses.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

Parce que les procédures de quantification et, en particulier, le nombre de sections analysées varient largement entre les enquêtes, définissant le nombre minimal de sections nécessaires pour obtenir une quantification fiable est primordiale. Takagawa et al. 9 démontré que la fiabilité est maximisée avec un coeur numéro de la tranche minimale de 6 - 8 sections de tout le cœur d'une souris à l' aide des intervalles de 1 mm. Dans le présent protocole, 5 - 7 sections du coeur de rat ensemble ont été obtenus lors de l'exécution de 2 mm d'épaisseur tronçonnage. En outre, les sections de 2 mm sont une norme et la taille souvent utilisée pour TTC coloration. En outre, l'échantillonnage systémique est simple à appliquer et présente un aspect périodique qui permet de caractériser l'ensemble du coeur.

A partir de chacune des tranches de 2 mm, les sections 5 um ont été coupées et colorées. Pour chaque section 5 um, la quantification de l'épaisseur de la cloison, l'épaisseur de la cicatrice et la longueur, la zone de cicatrice totale, la superficie totale LV et LV zone de cavité ont été réalisées, et la moyenne de chaque paramètre a été calculé par animal. Nous avons utilisé Masson-Goldner coloration des coupes minces plutôt que TTC coloration des sections de 2 mm pour améliorer la précision de la fois la détection de couleur automatique et l'évaluationdes longueurs. En effet, la coloration TTC est principalement intéressante pour le début de la phase ou des modèles d'ischémie - reperfusion pour la détection de la zone à risque 8,14, plutôt que pour la phase chronique.

MI induite par la ligature de CONT peut varier en fonction du site de ligature. Dans le modèle d'infarctus chronique présenté, la taille de ligature a été intentionnellement modifiée pour chaque animal et les résultats pour diverses conditions de la taille de l'infarctus et le remodelage étaient présents au bout de 6 semaines. En conséquence, l'assurance-emploi calculé a révélé un large éventail d'infarctus du myocarde et soutenu la différence observée dans la fonction cardiaque en corrélation avec EF. Lors de l'amincissement excessif du segment infarci a eu lieu, la zone de l'infarctus a été fortement réduite dans le cas de la fibrose transmurale. Dans cette condition, la définition de la taille de l'infarctus en calculant la zone du tissu de l'infarctus par rapport à l'ensemble de BT (exprimé en pourcentage du VG) serait faiblement évaluer l'étendue de l'infarctus. L'absence de cXAMEN pour induite remodelage-LV dilatation et extrême amincissement de la paroi Infarctus de LV peut sous-estimer la taille de l'infarctus, tandis qu'un Infarctus présente en l'absence d'amincissement de la paroi serait surestimer la taille de l'infarctus, tel que représenté par les valeurs en dehors de la confiance de 95% intervalle. Cette lacune pourrait être éliminé par le calcul de l'assurance-emploi.

Il a été montré que le changement de forme LV est positivement corrélée avec l'assurance - emploi et un amincissement des parois 15, 16. Bien que l'assurance-emploi peut être un prédicteur de la fonction LV, il est important de souligner que l'échocardiographie et les analyses histologiques sont des méthodes complémentaires pour évaluer l'infarctus du myocarde au niveau fonctionnel et de tissus, respectivement. Échocardiographie permet l'étude longitudinale et analyse histologique fournir des analyses fondamentales de point final qui permettent la quantification supplémentaire de LV morphologie, tels que l'épaisseur de la paroi.

Applications futures ou à l' arrière parer maîtrise de cette technique

L'échantillonnage systématique de l'ensemble du cœur et le calcul de l'assurance-emploi sont d'un intérêt particulier lors de l'évaluation MI chronique. En outre, ce procédé sera adapté à l'évaluation de l'efficacité du traitement, par rapport à matrice, en particulier pour de nouveaux traitements, tels que les cellules et les traitements qui visent à réduire la taille de l'infarctus et de remodelage. Reliable quantification de l'expansion de l'infarctus est d'une importance capitale pour les comparaisons entre les animaux non-traités et traités comme des analyses de point final histologique empêche la comparaison des pré-taille de l'infarctus et de post-traitement.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic rat heart matrix 2 mm 72-5015 Harvard Appartus
Inspira advanced volume controlled ventilator Harvard Apparatus 557058
Catheter Insyte 14 G BD 381267
O.C.T BDHA361603E VWR
TTC T8877-10G Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin MHS32-1L Sigma Aldrich
Acid Fuchsin
CI 42685
F8129-50G Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150
P2395-25G Sigma Aldrich
Orange G
CI 16230
O3756-100G Sigma Aldrich
Light green
CI 42095
L5382-25G Sigma Aldrich
KCl P9333-500G Sigma Aldrich
Xylol 10315083 HoneyWell
Ethanol absolute 10303990 HoneyWell
2-methylbutane M32631-1L Sigma Aldrich
Stereogical microscope SM2800 Nikon
Formaldehyde 99340 Reactolab
Embedding cassette K113.1 Carl Roth
Bersoft Image measurement Software Bersoft.com Licensed software

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References

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