3D الجامع القلب تحليل الأنسجة عضلة القلب

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة للمقارنة 3D من نسيج عضلة القلب بكل القلب مع التصوير بالرنين المغناطيسي. تم تصميم هذا لتقييم دقيق للحقن داخل عضلة القلب في المنطقة الحدودية احتشاء نموذج الخنازير المزمن من احتشاء عضلة القلب.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van den Broek, H. T., De Jong, L., Doevendans, P. A., Chamuleau, S. A., Van Slochteren, F. J., Van Es, R. 3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54974, doi:10.3791/54974 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتهدف علاجات التجدد القلب لحماية وإصلاح القلب جرح في المرضى الذين يعانون من أمراض نقص تروية القلب. عن طريق حقن الخلايا الجذعية أو البيولوجية الأخرى التي تعزز angio- أو تكون الأوعية في منطقة الحدود احتشاء (IBZ)، تم تحسين نضح الأنسجة، وعضلة القلب يمكن أن تكون محمية من مزيد من الضرر. لأقصى قدر من التأثير العلاجي، وافترض أن هذه المادة التجدد هو أفضل تسليمها إلى IBZ. وهذا يتطلب حقن دقيقة وأدى إلى تطوير تقنيات حقن جديدة. للتحقق من صحة هذه التقنيات الجديدة، قمنا بتصميم بروتوكول المصادقة على أساس تحليل الأنسجة عضلة القلب. ويشمل هذا البروتوكول كله القلب معالجة الأنسجة عضلة القلب التي تمكن مفصل ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثي الأبعاد تحليل (3D) للتشريح القلب والحقن داخل عضلة القلب. في الخنازير، تم إنشاء احتشاء عضلة القلب عن طريق انسداد 90 دقيقة من الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي. بعد أربعة أسابيع، وMIXTتم حقن لدى عودتهم من هيدروجيل مع جسيمات أكسيد الحديد مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (SPIOs) والخرز الفلورسنت في IBZ باستخدام نهج الشغاف الحد الأدنى الغازية. 1 ساعة بعد إجراء الحقن، والموت الرحيم الخنازير، وتم رفعه القلب وجزءا لا يتجزأ من الاغاروز (أجار). بعد تصلب أجار، أجريت التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، تشريح القلب، والتصوير مضان. بعد صورة مرحلة ما بعد المعالجة، تم إجراء التحليل 3D لتقييم دقة الاستهداف IBZ. يوفر هذا البروتوكول طريقة منظم وقابلة للتكرار لتقييم دقة استهداف الحقن داخل عضلة القلب في IBZ. بروتوكول يمكن استخدامها بسهولة عند الرغبة في معالجة ندبا و / أو التحقق من دقة حقن القلب كله.

Introduction

وكان مرض نقص تروية القلب السبب الرئيسي في العالم للوفيات على مدى العقود الماضية 1. العلاج حادة بعد احتشاء عضلة القلب وتهدف إلى استعادة تدفق الدم الى عضلة القلب عن طريق رأب الوعاء التاجي أو التاجي تطعيم الشريان. في احتشاء شديدة، وقد أصاب مساحة كبيرة من عضلة القلب، وهذه الحالات غالبا ما تؤدي إلى فشل القلب الإقفاري (HF) 2. خيارات العلاج الحالية للتركيز HF على الوقاية والحفاظ على وظيفة القلب للمرضى HF، ولكن ليس على التجدد.

في العقد الماضي، وقد تم التحقيق علاجات التجدد القلب كخيار علاجي لHF 3. ويهدف هذا العلاج إلى تقديم البيولوجية، مثل الخلايا الجذعية أو عوامل النمو، مباشرة إلى عضلة القلب جرح للحث على إعادة التوعي، وحماية cardiomyocyte، والتمايز، والنمو 4. لأفضلتأثير علاجي، والافتراض بأن البيولوجية يجب أن يتم حقنه في المنطقة الحدودية احتشاء (IBZ) لتسهيل نضح الأنسجة جيد للبقاء البيولوجية وتأثير الأمثل إلى منطقة الهدف 6. وقد تم تطوير تقنيات متعددة لأداء تحديد وتصور من IBZ لتوجيه الحقن داخل عضلة القلب 10، 11. وبالاضافة الى تحديد وتصور من IBZ، يعتمد أيضا على تسليم المواد الحيوية والقسطرة الحقن المستخدمة. للتحقق من صحة دقة حقن تقنيات التسليم، لا بد من وضع طريقة دقيقة وقابلة للتكرار الكمي.

لقد قمنا بتطوير بروتوكول لكامل القلب معالجة الأنسجة عضلة القلب التي توفر ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثة dimensio-نال (3D) التصوير، والتي يمكن استخدامها لدراسة نوعية وكمية الأهداف. ويشمل البروتوكول عملية التضمين وتحليل الصور الرقمية. في هذه الورقة، ونحن يبرهن على وجود بروتوكول لتقييم دقة استهداف الحقن داخل عضلة القلب في IBZ في نموذج الخنازير كبير من احتشاء عضلة القلب المزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت التجربة في الجسم الحي وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من قبل معهد مختبر أبحاث الحيوان مستعدة. وتمت الموافقة على التجربة من قبل اللجنة تجارب على الحيوانات المحلية.

1. إعداد حقن وتضمين الحل

  1. تحضير هلام عن طريق الحقن.
    1. إعداد 1 مل من ureido-بريميدونون (UPy) جل وفقا للبروتوكولات التي سبق وصفها، 12، 13.
    2. إضافة جسيمات أكسيد الحديد مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (SPIOs) إلى حل للحصول على تركيز 15 ميكروغرام / مل ويقلب الخليط لمدة 5 دقائق لتوزيع موحد.
    3. إضافة ميكروبيدات الفلورسنت إلى حل للحصول على تركيز 10000 حبات / مل ويحرك الخليط لمدة 5 دقائق لتوزيع موحد.
    4. تخزين الخليط الناتج في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة. دافئة ودوامة أو ضجة رانه حل قبل وقت قصير من إجراء الحقن.
  2. إعداد الحل التضمين.
    1. بدء مع الاستفادة من المياه في درجة حرارة الغرفة وإضافة الاغاروز (أجار) إلى تركيز 4٪ بالوزن.
    2. الحرارة ببطء الحل لنقطة الغليان باستخدام فرن الميكروويف ويقلب في كثير من الأحيان أثناء التسخين. عند الوصول إلى نقطة الغليان، وتخزين والحفاظ على حل أجار فوق 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للهواء المحبوس على السطح.
    3. السماح للأجار ليبرد في درجة حرارة الغرفة إلى درجة حرارة بين 50 و 60 درجة مئوية حتى وقت التضمين.

إجراء 2. حقن

  1. أداء تخدير (مضادات عدم اتساق نبضات القلب، العلاج المضاد للصفائح الدموية، ومسكنات للألم)، والتخدير، والوصول الوريدي، والتنبيب، كما هو موضح سابقا (14).
  2. أداء الحقن باستخدام القسطرة حقن داخل عضلة القلب (جدول المواد). لكل الحقن، 0.يتم حقن 2 مل من الخليط في بلعة واحدة على معدل ثابت من حوالي 0.3 مل / دقيقة باستخدام جهاز الحقن. وضع الحقن في مواقع مختلفة على طول IBZ 12.
  3. إدارة 0.2 مل / كغ (1.0 مليمول / مل) من دقيقة على أساس الجادولينيوم عامل تباين 15 قبل القتل الرحيم للحيوان.
  4. إدارة 20 مل من 7.5٪ كلوريد البوتاسيوم عن طريق الوريد إلى الموت ببطء الحيوان.
  5. وصول المنصف آمن بعد بروتوكول الخطوات من 8،2-8،3، كما وصفها Koudstaal وآخرون. 14. قطع الوريد الأجوف السفلي 5 سم من الأذين الأيمن وإزالة متدفق الدم مع جهاز الشفط. استئصال القلب وشطفه مع المياه المالحة 0.9٪ في درجة حرارة الغرفة.

3. إجراء التضمين

  1. إعداد القلب.
    1. إزالة التامور من القلب مع الحفاظ على الأذينين والبطينين سليمة. تشريح الشريان الأبهر الصاعد ± 1 سم فوق الصمام الأبهري باستخدام Klinkenbergمقص. قطع الوريد الأجوف السفلي ± 1 سم من الأذين، وتفعل الشيء نفسه بالنسبة للالأوردة الرئوية.
    2. خياطة قمة القلب في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك التضمين (17 × 15 × 15 سم، والعرض × العمق × H) باستخدام خياطة 2-0 لمنع التعويم للقلب خلال تضمينها (الشكل 1A).
    3. خياطة الجزء المتبقي من الشريان الأورطي إلى الحافات الحاوية باستخدام 2-0، والتأكد من أن يتركز القلب وعدم لمس جدران الحاوية (الشكل 1B).

شكل 1
الشكل (1): نظرة عامة تخطيطي وصورة من حاوية التضمين. (A) نظرة عامة تخطيطي لعملية التضمين. يتم تأمين القلب (الحمراء) في حاوية (الأزرق) باستخدام الخيوط الجراحية. بعد ملء القلب مع الحل أجار، يمتلئ الفضاء حول القلب. أخيرا،يتم وضع اثنين من أنابيب بلاستيكية جامدة (الأصفر) في حاوية، بجانب ولكن ليس لمس قلب، ليكون بمثابة إشارة أثناء التسجيل صورة. (B) صورة لقلب المضمون في حاوية التضمين. وفرضت الغرز إلى حافة الحاوية باستخدام المشابك البعوض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تضمين القلب في هندسة نهاية الانبساط مثل.
    ملاحظة: الوقاية من خلق فقاعة الهواء ضروري. إذا فقاعات الحالي في حل أجار الهواء كبير، والحفاظ على أجار عند 40 درجة مئوية، والسماح للفقاعات الهواء على السطح.
    1. المشبك الأجوفية أدنى الوريد باستخدام المشابك البعوض. حقن ببطء آغار السائل باستخدام حقنة 50 مل في الأذين الأيمن عن طريق الوريد الأجوف متفوقة حتى يتم شغل كل من الأذين الأيمن والبطين تماما.
    2. المشبك الأوردة الرئوية باستخدام mosquitس المشابك. تمر بلطف حقنة أجار مليئة 50 مل retrogradely من خلال صمامات الأبهر. حقن ببطء الحل في البطين الأيسر (LV) حتى LV والأذين الأيسر تمتلئ تماما. بعد ملء LV، المشبك الشريان الأورطي للحفاظ على أجار في LV.
    3. صب آغار المتبقية في وعاء حتى يتم تغطية القلب تماما. وضع اثنين من أنابيب بلاستيكية جامدة داخل الحاوية تضمين لتكون بمثابة هياكل مرجعية لتسجيل صورة لاحق (الشكل 1A). تأكد من الأنابيب لا تلمس جدران الحاوية أو القلب.
    4. السماح للأجار يصلب في 2-7 ° C.

4. الحصول على الصور

  1. أداء عرضي خارج الحي فحوصات الرنين المغناطيسي للقلب مضمن في الحاوية.
    1. وضع الحاوية مع قلب جزءا لا يتجزأ من داخل لفائف الرأس (جدول المواد).
    2. Angulate شرائح موازية لقاع الإناء. استعمالنفس التوجه والتزوي في كل المجراة سابقا تسلسل MRI.
    3. لتصور عضلة القلب، إجراء استرداد معكوس-الموهن السائل (FLAIR) تسلسل مع المعلمات التالية: وقت التكرار [TR] الوقت / صدى [TE] = 10 ق / 140 مللي ثانية، وزاوية الوجه = 90 درجة، حجم بكسل = 0.5 X 0.5 مم، مجال الرؤية [فوف] = 169 س 169 مم، 320 × 320 مصفوفة، و 3 ملم سمك شريحة.
    4. لتصور احتشاء عضلة القلب، وإجراء أواخر الجادولينيوم تعزيز (إل جي) تسلسل مع المعلمات التالية: [TR] [/ TE] = 5.53 مللي / 1.69 مللي، وزاوية الوجه = 25 درجة، حجم بكسل = 1.0 X 1.0 ملم، [ فوف] = 169 س 169 مم، 176 × 176 مصفوفة، و 3 ملم سمك شريحة.
    5. لتصور SPIOs، إجراء T2 * التدرج -weighted تسلسل صدى مع المعلمات التالية: [TR] [/ TE] = 88.7 مللي / 15 TES موزعة بالتساوي مع مجموعة من 1،9 حتي 24،6 مللي، وزاوية الوجه = 15 درجة، بكسل حجم = 0.5 X 0.5 ملم، [فوف] = 169 س 169 مم، 320 × 320 مصفوفة، و 3 ملم سمك شريحة.
  2. بروسس الأنسجةيغنى
    1. تحويل الحاوية رأسا على عقب والسماح الجوي بين أجار وجوانب الحاوية لإزالة حل أجار الصلبة، بما في ذلك القلب، من الحاوية. إزالة قضبان البلاستيك من أجار الصلبة.
    2. قسم كتلة آغار تحتوي على القلب في شرائح 5 ملم من قمة إلى قاعدة للقلب باستخدام تقطيع اللحوم. الحفاظ على التزوي من قطع شرائح هي نفسها كما في الصور MR المكتسبة عن طريق خفض بالتوازي مع الجزء السفلي من كتلة آغار.
    3. وصمة عار على شرائح أجار (بما في ذلك القلب) لمدة 15 دقيقة في 1٪ بالوزن من 2،3،5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) الذائب في المياه المالحة 0.9٪ عند 37 درجة مئوية، وتصوير شرائح على كلا الجانبين من وجهة نظر عمودي (الشكل 2A). بعد ذلك، شطف بعناية شرائح في المياه المالحة 0.9٪.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمنا الإعداد دسلر مع عدسة / الهدف المناسب، ترايبود، والإضاءة موحدة. ومع ذلك، خدم الصور فقط كعنصر تحكم لتقييم المنطقة ندبة،ولذا فإننا يمكن أن تستخدم لإعداد مختلف.
  3. التصوير مضان
    ملاحظة: اعتمادا على الإثارة وانبعاث موجات من ميكروبيدات الفلورسنت، وتحديد كتلة تصفية والإثارة الليزر المناسبة (على سبيل المثال، ميكروبيدات الحمراء المستخدمة هنا لها الإثارة وانبعاث موجات من 580 نانومتر و 605 نانومتر، على التوالي، وبالتالي، ليزر الإثارة المختارة وتم تعيين المرشحات ممر الموجة إلى 532 نانومتر، 580/30 نانومتر و 610/30 نانومتر، على التوالي).
    1. حدد التصوير مضان وضع على الماسح الضوئي متغير واسطة. تعيين أنبوب مضخم إلى 430 V أو ما يعادلها وحجم بكسل إلى 100 × 100 ميكرون. حدد الليزر الإثارة (532 نانومتر) الأقرب إلى الطول الموجي الإثارة من ميكروبيدات الفلورسنت.
    2. لكتلة الفلتر الأول، حدد ممر الموجة مرشح (580/30 نانومتر) التي تتداخل مع الطول الموجي الانبعاثات من الخرز مضان حقن (القناة 1). اختر ممر الموجة مرشح لكتلة مرشح الثاني (610/30) خارج هالطول الموجي البعثة (قناة 2).
      ملاحظة: يقدم كتلة مرشح الثاني كعنصر تحكم السلبية وإزالة السيارات ومضان مع الحفاظ على مواقع الحقن سليمة.
    3. مسح جانبي شرائح أجار في وضع مضان من ماسح ليزر متغير وضع استخدام القناتين. تأكد من أن كل شريحة يتم فحص تماما، بما في ذلك الثقوب المرجعية.

5. بعد المعالجة

ملاحظة: الخطوة الأولى في صورة مرحلة ما بعد المعالجة هي تجزئة اليدوية للعضلة القلب باستخدام البرامج النصية في المنزل وضعت لتتبع لانهائي والحدود النخابية، فضلا عن مواقع الحقن. هذا هو نفسه لكل من التصوير بالرنين المغناطيسي والمسح الضوئي مضان.

  1. جزء من عضلة القلب في التصوير بالرنين المغناطيسي.
    1. جزء من الشغاف ولف بوردرس النخابية على FLAIR MRI تسلسل الصور.
    2. نسخ تجزئة LV من الخطوة 5.1.1 لبيانات شركة إل جي-MRI وقطاع ندبة على تسلسل إل جي MRI.
    3. نسخ تجزئة عضلة القلب من الخطوة 5.1.1 إلى T2 * بيانات -weighted وجزء من ترسبات SPIO في عضلة القلب LV.
  2. معالجة الصور مضان وأداء الانقسامات.
    1. تحميل الملفات التي تم الحصول عليها من الماسح الضوئي متغير الوضع وتقديم صورة منفصلة لكل شريحة القلب مستعرضة.
    2. الوجه شرائح التي تم مسحها ضوئيا في قاعدة لقمة التوجيه وفرز الصور مضان في كومة لكل القنوات التي توجه من قمة إلى القاعدة.
    3. جزء من الشغاف ولف بوردرس النخابية على الصور مضان.
    4. قطاع ندبة يدويا على الصور مضان واستخدام إل جي-MRI المسح الضوئي والصور لتأكيد ندبة التشكل.
    5. طرح كومة صورة القناة 2 من المكدس صورة القناة 1 إلى استبعاد لصناعة السيارات في مضان. قطعة يدويا ترسبات ميكروبيدات الفلورسنت واستخدام T2 * الصور للتأكيد.
  3. لنصنع او لنبتكرو3D الهندسة تشريحيا-الصحيحة، إجراء تسجيل جامدة من شرائح في كومة صورة تستند إلى هياكل المرجعية (الثقوب التي تم إنشاؤها بواسطة أنابيب جامدة). حساب وتخزين تطبيق الترجمة وتناوب كل صورة.
  4. تطبيق التحولات المخزنة على مداخن صورة والانقسامات. خطيا أقحم الإنقسامات من كلا الجانبين من الشرائح لإعادة بناء سمك شريحة الأصلي ولخلق نموذج 3D من البيانات.

6. تحليل

  1. إجراء قياسات 2D و / أو 3D المسافة بين المراكز من مواقع الحقن وIBZ لتقييم دقة الحقن. قياس المسافة على طول الحدود الشغاف من تجزئة LV. في الشكل 2C و2F، يشار مثالا للقياسات 2D و 3D بواسطة الخط الأحمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأنسجة التضمين

من خلال عملية التضمين، أنشئ هندسة نهاية الانبساطي الشبيهة. آغار الالتزام بنجاح إلى أنسجة القلب، مما يتيح للنسيج إلى أن شرائح في التزوي المطلوب مع سمك شريحة متساوية (الشكل 2A و 2C).

تقييم Scar- وموقع الحقن

لكل طريقة التصوير، أجريت احتشاء والتقييمات موقع الحقن بنجاح. في كل من التصوير مضان 2D والتصوير بالرنين المغناطيسي، وكانت مواقع ندبة وحقن بوضوح مميزة (الشكل 2C، 2D، و2E، على التوالي). صور من الصور النسيج وشركة إل جي-MRI الملون TTC-توفر عنصر تحكم لتقييم ندبة في مجال التصوير مضان (الشكل2A و 2C).

إعادة الإعمار 3D

توفر علامات إشارة إلى طريقة صحيحة وموثوق بها لتسجيل الصورة. صورة مرحلة ما بعد المعالجة يمكن إعادة بناء الهندسة 3D من القلب فيفو السابقين على أساس الانقسامات والصور الفلورسنت من القلب (الشكل 2F). هندسة 3D من الإنقسامات تسمح ل3D تقييم دقيق حقن دقة (الشكل 2F).

قياسات

في هذه الدراسة، تم المتوقع أن ترسبات الحقن وIBZ على الجدار الشغاف. بعد ذلك، تم قياس المسافات بين التوقعات على سطح الشغاف (الشكل 2C و2F). وعالية الدقة (0.1 X 0.1 ملم) وصور الفلورسنتيسمح قياسات دقيقة. في إعادة الإعمار 3D، وكان هذا القرار في ض الاتجاه نظرا لشريحة سمك 2.5 ملم.

الشكل 2
الشكل 2: نموذجي فيفو السابقين بيانات التصوير والإعمار 3D. الناتج الصور التي حصل عليها الطرائق المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول. تظهر جميع الصور على نفس شريحة عرضية من قلب المضمنة. (A) صورة لشريحة الملون TTC في أي ندبة مرئيا. (B) نظرة عامة تخطيطي من الهياكل التشريحية. (C) الإسفار صورة مع كل القنوات مجتمعة. وأظهرت القناة التي تغطي طيف الانبعاث حبة باللون الأحمر ويظهر سيطرة سلبية باللون الأخضر. وتشير دائرة حمراء في موقع الحقن. قياس المسافة من الحقن إلى IBZ يشار الطرافةح الخط الأحمر. (D) محور قصير إل جي-MRI. يظهر منطقة احتشاء كمنطقة بيضاء شديدة مكثفة. (E) T2 * -weighted MRI. ويمكن التعرف على الجزيئات SPIO داخل مادة حقن كما الفراغ إشارة المحلية التي أشار إليها دائرة حمراء. التصور (F) 3D من مواقع الحقن (الحمراء)، ندبا (أبيض)، وعضلة القلب (الأخضر)، ومجزأة في الصور الفلورسنت. يشير السهم في نفس المكان حقن كما هو الحال في C و E. في هذه الصورة، يشار إلى قياس المسافة ذاتها مع الخط الأحمر. LV = البطين الأيسر، RV = في البطين الايمن. يمثل شريط مقياس 10 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كامل القلب معالجة الأنسجة القلبية 3D وفقا لهذا البروتوكول يوفر طريقة منظم تمكن تحليل 3D من احتشاء، وIBZ، وحقن تنفيذ فيما يتعلق تشريح القلب. حجم ملء القلب يعتمد على التحليل المطلوب. في هذه الدراسة، لتقييم دقة الحقن، ونحن تهدف إلى ملء القلب تشبه هندسة نهاية الانبساط قدر الإمكان. لتطبيق هذا، يتم تثبيت قمة LV إلى أسفل الحاوية ويتم تعبئة LV مع أجار في حين فرضت الأوردة الرئوية. عندما يتم تعبئة LV، يشد الشريان الأورطي كذلك، منع آغار من المتدفقة من LV وتقليد هندسة نهاية الانبساط قدر الإمكان. باجتزاء قلب جزءا لا يتجزأ من تقدم مصلحة شريحة سمك موحد، وتتيح للشرائح ليكون في نفس التزوي كما هو الحال في خارج الجسم الحي التصوير. بعد تشريح، والمواد تضمين تمنع الأنسجة من التشوه الناجم عنطريقة تعاملها مع شرائح خلال الحصول على الصور. من الناحية المثالية، يجب أن يتم تنفيذ TTC تلطيخ في أقرب وقت ممكن بعد إزالة من الجسم، كما يعتمد على تلطيخ الانزيمات التفريق بين الأنسجة عملية الأيض نشطة و-inactive. في بروتوكول لدينا، ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب تنفيذها قبل تلطيخ TTC يمكن أن يحدث، بما في ذلك عملية التضمين، حيث يتم تبريد قلب جزءا لا يتجزأ من لترسيخ آغار. منذ لاحظنا تلطيخ واضح للأنسجة محتشية في جميع شرائح، ونحن نعتقد أن هذا التأثير كان محدودا.

معدات التصوير المستخدمة هنا يمكن الاستعاضة عن المعدات المختلفة التي توفر الوظيفة نفسها. عالية الدقة التصوير مضان على ماسح ليزر متغير وضع والخيار لتعيين كتل تصفية متعددة من أجل معالجة فعالة وبدقة الأنسجة ضرورية لتحليل مفصل. للحصول على صورة مرحلة ما بعد المعالجة، وحزم البرمجيات التي تسمح بحرية كاملة لPERFويلزم تحليل الصور مكتب إدارة السجلات. في تجربتنا، وكان يستخدم تحليل 3D لتقييم دقة الحقن، ولكن التحليل على الصور 2D هو ممكن أيضا.

لقد قمنا حتى الآن هذه الطريقة معالجة الأنسجة القلبية في 10 الخنازير، وكانت قادرة على العثور على 73٪ من مواقع حقن في ما مجموعه 118 الحقن تنفيذها. وربما السبب في اختلاف بين كمية الحقن المنجز وكمية من مواقع الحقن التي حددها الفرق بين شريحة سمك 5 ملم و1.5 ط ط ط عمق الاختراق من الماسح الضوئي مضان. نظريا، لا يتم قياس 2 ملم من الأنسجة في كل شريحة. سوف شرائح أرق حل هذه المشكلة.

محددات

وعلى الرغم من هندسة نهاية الانبساطي تشبه في بداية عملية التضمين، ظهرت بعض القلوب قد تعاقدت قليلا في أجار. منذ لاحظنا أي انحرافات كبيرة من حجم نهاية الانبساط، ونحن نعتقد أنكان هذا تأثير ضئيل ولم تؤثر على تقييم حقن الدقة. وباستخدام شرائح الأنسجة أرق تحسين دقة التقييم والسماح للمقارنة أكثر تفصيلا مع فيفو السابقين التصوير بالرنين المغناطيسي. وثمة خيار آخر يتمثل في استخدام وكلاء NIRF بدلا من ميكروبيدات الفلورسنت لتحسين عمق الاختراق وجزء الكشف ربما. وعلاوة على ذلك، ودرجة حرارة منخفضة للقلب جزءا لا يتجزأ من وتوقيت تلطيخ TTC قد يسبب نقص في الانزيمات اللازمة لهذا النوع من تلطيخ. ومع ذلك، فإن الصور من شرائح الملون ثبت أن تكون مراقبة جيدة لتقييم ندبة.

الآفاق المستقبلية

على الرغم من أن هذه الطريقة كان مصمما أصلا لتقييم دقة الحقن داخل عضلة القلب، يمكن أن الدراسات مع النهاية الأخرى أيضا الاستفادة من هذه الطريقة (على سبيل المثال، حجم احتشاء، وتقييم التشكل، أو غيرها من الأجهزة). بالإضافة إلى التصوير بالرنين المغناطيسي، وغيرها من طرائق التصوير 3D، مثل CT،PET، أو SPECT، ويمكن استخدامها على الأنسجة القلبية التالية منهجية تظاهر. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التكامل بين هذه الطرائق التصوير المختلفة يمكن ان زيادة الاستخدام الأمثل لل2D و 3D يحلل.

استنتاج

وفي الختام، لقد قدمنا ​​الرواية، موحدة، وطريقة استنساخه لأداء كامل القلب معالجة الأنسجة القلبية 3D. وقد ثبت أجار لتكون وسيلة مناسبة لتضمين كامل القلب، مما يتيح للنسيج إلى أن شرائح في التزوي المطلوب وعلى قدم المساواة مع سمك. وعلاوة على ذلك، أثبتت تسجيل صورة عمليا لإعادة الإعمار 3D التصوير عضلة القلب، مما يتيح تقييم 3D في قرار مكانية عالية، والتي يمكن استخدامها لوتهدف الدراسة النوعية والكمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر مارليين جانسن، جويس فيسر، ومارتن فان Nieuwburg على المساعدة التي قدموها مع التجارب على الحيوانات. ونحن نعترف كثيرا مارتن Froeling وأنك واسينك على المساعدة التي قدموها مع التصوير بالرنين المغناطيسي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline Braun
Agarose Roche Diagnostics Scientific grade multipurpose agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410  GE Healthcare
Embedding container Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene Microspheres Invitrogen F8834 red, 10 µm
Gadolinium Gadovist 1.0 mmol/mL
dS 32 channel head coil Philips Or similar
Matlab Mathworks To insure compatability 2015a or newer
Meat slicer Berkel
Myostar injection catheter Biosense Webster
Super paramagnetic iron oxide particles Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chloride Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0 Ethicon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nowbar, A. N., Howard, J. P., Ja Finegold,, Asaria, P., Francis, D. P. 2014 global geographic analysis of mortality from ischaemic heart disease by country, age and income: statistics from World Health Organisation and United Nations. Int J Cardiol. 174, (2), 293-298 (2014).
  2. Kannel, W. B., Belanger, A. J. Epidemiology of heart failure. Am Heart J. 121, (3), 951-957 (1991).
  3. Ibáñez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van De Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65, (14), 1454-1471 (2015).
  4. Bartunek, J., Vanderheyden, M., Hill, J., Terzic, A. Cells as biologics for cardiac repair in ischaemic heart failure. Heart. 96, (10), 792-800 (2010).
  5. Orlic, D., Kajstura, J., et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410, (6829), 701-705 (2001).
  6. Nguyen, P. K., Lan, F., Wang, Y., Wu, J. C. Imaging: Guiding the Clinical Translation of Cardiac Stem Cell Therapy. Circ Res. 109, (8), 962-979 (2011).
  7. Psaltis, P. J., Worthley, S. G. Endoventricular electromechanical mapping-the diagnostic and therapeutic utility of the NOGA XP Cardiac Navigation System. J Cardiovasc Transl Res. 2, (1), 48-62 (2009).
  8. Tomkowiak, M. T., Klein, A. J., et al. Targeted transendocardial therapeutic delivery guided by MRI-x-ray image fusion. Catheter Cardiovasc Interv. 78, (3), 468-478 (2011).
  9. Dauwe, D. F., Nuyens, D., et al. Three-dimensional rotational angiography fused with multimodal imaging modalities for targeted endomyocardial injections in the ischaemic heart. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 15, (8), 900-907 (2014).
  10. van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. Multimodality infarct identification for optimal image-guided intramyocardial cell injections. Neth Heart J. 22, (11), 493-500 (2014).
  11. van Slochteren, F. J., van Es, R., et al. Three dimensional fusion of electromechanical mapping and magnetic resonance imaging for real-time navigation of intramyocardial cell injections in a porcine model of chronic myocardial infarction. Int J Cardiovasc Imaging. 32, (5), 833-843 (2016).
  12. Pape, aC. H., Bakker, M. H., et al. An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart. J Vis Exp. (100), (2015).
  13. Bastings, M. M. C., Koudstaal, S., et al. A fast pH-switchable and self-healing supramolecular hydrogel carrier for guided, local catheter injection in the infarcted myocardium. Adv Healthc Mater. 3, (1), 70-78 (2014).
  14. Koudstaal, S., Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J. Vis. Exp. (86), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics