תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

* These authors contributed equally
Developmental Biology
JoVE Journal
Developmental Biology
AccessviaTrial
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. J. Vis. Exp. (118), e54978, doi:10.3791/54978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

השלד הוא איבר מורכב, דינמי ומורכב מאוד כי יש מגוון של פונקציות הפורשות מן התנועה, הומאוסטזיס יון. מורכב העצם והסחוס, השלד מורכב של אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית אשר פועלות כדי לשמור על זה מבני, ביוכימיים מכאני שלמות 1. אחד התפקידים העיקריים של השלד הוא התפקיד בהתפתחות וצמיחה שלה. תהליכים אלה דורשים התזמור של אוכלוסיות תאיות רבות אשר מוסדרות באמצעות האנדוקרינית דוקי בקרה גנטית.

למעט עצם השכמה למשל עצמות שטוחות, הגולגולת ועצם החזה, השלד היונק נוצר באמצעות התהליך המכונה התאבנות endochondral. תהליך זה, מוסדר, הן מולקולרי מרחבית, מתחיל עם ההתעבות של תאי mesenchymal נגזרו בעיקר מן mesoderm 2. בהשפעה של SOX9 גורם שעתוק, תאי הדואר פנים של condensations להתמיין chondrocytes, להביע ומפריש מטריקס ספציפיים סחוס (ECM) רכיבים כגון קולגן סוג II ו- aggrecan. תאים בשולים של העיבוי, לבטא סוג אני קולגן ויוצר את perichondrium, המגדיר את העצם 3 הפוטנציאלי. מאוחר יותר, osteoprogenitors של perichondrium להתמיין אוסטאובלסטים, בבימויו של הביטוי של גורמי שעתוק, Runx2 ו osterix 4. זה מוביל דומיננטי של אוסטאובלסטים ושכבה זה שמם של קרום העצם המהווה צווארון גרמי mineralized סביב אמצע הקטע של העצם. חדירה של כלי דם של קרום העצם והפלישה של פיגום הסחוסים מתרחשת מביאה עימה, haematopoetically שמקורם בתאי resorbing עצם, osteoclasts, אשר נספגים שוב ומצע שרידי הכונדרוציטים והרבה מטריקס סחוסי 5. החללים נוצרו מאוישים ע"י osteoprogenitors והוליד את ההתאבנות העיקריתמרכז אשר בהדרגה תופס את הליבה של diaphysis ומתמזג עם periosteum. תאים אחרים להצמיח במח העצם. בסביבות הלידה, כלי דם osteoprogenitors לחדור מטריקס עשיר סחוס משני צדי (epiphysis) של diaphysis פיתוח כדי ליצור את מרכז התאבנות משנית. ממוקם בין epiphysis ו diaphysis בשני קצותיו של העצמות הארוכות היא להקה של סחוס - צלחת צמיחת epiphyseal - האחראית על תיאום גידול ליניארי של כל העצמות הארוכות 6.

Chondrocytes בתוך צלחת הצמיחה בתחילה להתרבות ובהמשך להתקדם דרך אזורים ברורים מורפולוגית, מתואמים על ידי ביטוי רציף של גורמי שעתוק וצמיחה. שיאו של רצף זה של אירועים הוא היציאה ממעגל התא היפרטרופיה של כונדרוציטים במרכז מבשר סחוס זה. chondrocytes Hypertrophic בתוקף להביע קולגן סוג X ו- מטלו מטריקס-13 (MMP13) והגדלת הנפח הניכרת שלהם בכיוון של צמיחה אורכת מספקים את התרומה הגדולה ביותר לצמיחת עצם ביונקי 7,8. יתר על כן, chondrocytes היפרטרופית mineralize ECM הסובבת אותם באמצעות שחרור של שלפוחית ​​מטריקס, מבנים מתוחם קרום מתמחה לייצור סידן פוספט אמורפי באמצעות הכללתם של phosphatases (רקמת הלא ספציפית phosphatase אלקליין (TNAP) ו PHOSPHO1) וחלבונים תקשור סידן (annexins ) 9-11. סחוס מסויד זה הוא פלש ידי כלי דם מהמח הבסיסי וכתוצאה מכך גיוס osteoclast ואת ספיגת מטריקס. זה ואחריו הגירה אוסטאובלסטים ויישור אל פני השטח של שרידי סחוס המסוידים שבו הם שכבו שכבה דמוית העצם שהוא mineralized במהירות. העצם הארוג של spongiosa העיקרי הוא ששופץ לעצם שבשבת של spongiosa משני 12. תוצאות היתוך epiphyseal בהפסקת התאבנות endochondral 13.

התאבנות Endochondral נמצאת תחת רגולציה הדוקה על ידי הורמונים האנדוקרינית paracrine רבים גורמי גדילה כדי למנוע התפתחות מופרעת ו / או צמיחת עצם אורך 14. הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התהליכים האלה לכן חובה במרדף שלנו של התקדמות קלינית כלפי רווחת אדם. מחקרים קודמים המצביעים על הדמיון והשוני בין צלחות הצמיחה בגילאים שונים, במקומות ומינים שיפרו במידה רבה את הבנתנו של מנגנונים פיזיולוגיים שמסביב הדינמיקה צלחת צמיחה 15,16. עם זאת, המחקר של כונדרוציטים מבודדים קשה, כמו הסרת chondrocytes מסביבתם יכולה להוביל dedifferentiation, מלווה אובדן הביטוי של סמני מפתח כגון Col2a1 17.

תרבות explant העכבר המסרק איבר, pioneered ידי פרופ 'אליזבת בורגר ועמיתיו בהולנד, הוא מודל פיסיולוגי לשעבר מאוד vivo ללימוד צמיחת התאבנות ועצמות endochondral כמו קצב הצמיחה של העצמות בתרבות לחקות כי ראה in vivo 18. באופן ייחודי, תרבות איבר כף הרגל מאפשרת בחינה של כונדרוציטים בשלבים שונים של chondrogenesis ושומרת תאי תאים ואינטראקציות תא-מטריצה, ולכן מתן תנאים קרובים למצב vivo ב מ תאים בתרבית 19-21. יתר על כן, מודל זה מאפשר לבדיקה ישירה של צמיחת עצם ליניארי אשר אינה אפשרית בתרבויות הכונדרוציטים עיקריות. זה גם מאפשר הפרדת גורמים מערכתיים ומקומיים ולכן מתיר הניתוח הפרטני של ההשפעות המקומיות על צלחת הצמיחה.

תרבות metatarsals מאפשרת לחקירת פרמטרים רבים. מדידות יומיות של אורך הכולל ושל אזורי mineralized שלניתן לבצע את היסודות עם מיקרוסקופ לעומת שלב סטנדרטי תוכנת ניתוח תמונה. היסטולוגית, כלאה באתר והכתים immunohistological עשויה להתבצע בקלות על סעיפי כף רגל, מה שמאפשר את הרזולוציה המרחבית של שני הגופים האלה תאיים ומולקולריים, יתרון גדול על פני שיטות תרבית תאים מסורתיות. הגישה immunohistochemical כולל איתור וכימות של 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) ספיגת ידי מתרבים chondrocytes 22. בנוסף, עיבוד נוסף של רקמות כף רגל ניתן לבצע כדי לאפשר ניתוח במורד זרם של ביטוי mRNA (RT-qPCR), חלבון וניתוח איתות תאי (מערבי סופג) או רכב שומנים (ספקטרומטריית מסה). רוב המחקרים שפורסמו עד כה להשתמש metatarsals עובריים בתרבית ולא metatarsals מחיות שלאחר הלידה. בעוד שני הדגמים ניתן אינפורמטיבי, חקר עצמות עובריות יש מספר יתרונות: הם גדלים מהר יותר והוא יכול להיות exploited ללמוד בייזום התקדמות של 23-25 תהליך מינרליזציה.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את לנתיחה הסבוכה של metatarsals העוברי מן הגפיים האחוריים של יום עוברי 15 (E15) עובר Murine. יתר על כן, את הצמיחה ואת מינרליזציה של metatarsals מובחנת מבחינה אנטומית מוצג.

Protocol

נהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים בוצעו בהתאם בעלי החיים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בעלי החיים היו מתוחזקים בהתאם משרד הפנים פרסמו קוד עיסוק עבור השיכון, הטיפול של בעלי החיים Bred, מסופק או משומש למטרות מדעיות.

הערה: ניסויים שבוצעו באמצעות עכברי-בר C57Bl / 6J מבוססים היטב ותיאר להלן. Metatarsals העוברי מן הזנים שונים עכבר יכול להיות מתורבת דומה במבחנה, אם כי שיעורי הצמיחה מינרליזציה שלהם עשויים להיות שונים לאלה מפורטים כאן.

תנאי Dissection 1. הכנת מכשירים

  1. בצע כל הכנת התקשורת, וניתוחי רקמות תרבות העבודה במנדף זרימה למינרית על מנת להבטיח את סטריליות של תקשורת יסודות עובריים.
  2. אפשר תקשורת בתרבות לנתיחה כדי לאזן במשך לפחות שעה 1 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני השימוש.
  3. לעקר לנתיחהמספריים, דומון # 5 דומון # 4 פינצטה לצד זוג מספריים מיקרו איכותי מאוד Vannas (ישר 8 ס"מ, 3 מ"מ להבים) על ידי מעוקר. לאחר מעוקר, לטבול את הציוד לנתיחה באתנול 70% לפני השימוש.

2. הכנת Dissection ותרבות מדיה

  1. כן בינוני לנתיחה
    1. לדלל α-מינימום מדיה Essential (ללא נוקלאוזידים αMEM) ב בופר פוספט (PBS) (1:13) ו resuspend אלבומין בסרום שור (BSA) ב- 2 מ"ג / מ 'l לפני מסנן עיקור באמצעות מזרק בקוטר 0.22 מיקרומטר, 33 מ"מ לְסַנֵן.
      הערה: בינוני Dissection יכול להתבצע, מסנן מעוקרים מאוחסנים aliquots ב -20 ° C ללא הגבלת זמן.
  2. כן בינוני תרבות
    1. metatarsals העוברי תרבות 300 μl של מדיום התרבות (בכל טוב של צלחת תרבות 24 גם). הכן את המדיום התרבות ידי הוספת 0.2% w / v BSA; 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​L-ASCOפוספט וחומצה rbic; 1 מ"מ β-glycerophosphate (βGP; אופציונלי - ראה סעיף תוצאות); 0.05 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין ו 1.25 מיקרוגרם Amphotericin B כדי αMEM ולסנן לעקר דרך פילטר מזרק בקוטר 0.22 מיקרומטר, 33 מ"מ.

3. Murine עובריים המסרק Dissection ותרבות

  1. לברור את העכבר בהריון, מחסה עוברים 15 יום בן, על ידי נקע בצוואר הרחם בהתאם להנחיות המשרד הביתי בבריטניה
  2. מניחים את פרקדן חיה ולחטא העור על ידי ריסוס עם אתנול 70%. מספריים לנתיחה באמצעות לעשות חתך גדול קו האמצע חודר הוא העור הצפק לחשוף את חלל הבטן.
  3. אתר שתי קרני הרחם של החיה באזור הגבי של חלל הגוף. הסר את קרן הרחם על ידי ראשית חלץ כל רחם מן mesometrium ידי חתכים זהירים עם מספריים לנתיחה ולבסוף חיתוך קרנות הרחם חינם בבסיסם. placדואר קרני הרחם לתוך מדיום לנתיחה.
  4. פרד בין העובר על ידי חיתוך בין אתרי השתלה לאורך קרן הרחם ולהסיר את העוברים מן הצ'קים האישיים שלהם באמצעות מלקחיים. עובר דילול על ידי עריפת ראש בהתאם להנחיות משרד ביתי בבריטניה
  5. לאחר חיטוי של העור על ידי ריסוס עם 70 אתנול%, השתמש Vannas מספריים מיקרו להסיר את הגפיים האחוריות מן העוברים על ידי חריטה סביב הירך הפרוקסימלי. הדבר מבטיח כמה שיותר הגפיים האחוריים ככל האפשר מוסר. מניח את הגפיים האחוריים לתוך צלחת פטרי השקועה במדיום לנתיחה לפני לנתיחת כף רגל.
  6. תחת מיקרוסקופ לנתח, מתחיל להסיר את העור שמסביב למרגלות העובריות, על ידי צובט ומושך אותו באמצעות # 5 פינצטה בעוד מחזיק את הגפיים האחוריים יציב באמצעות # 4 פינצטה. זו מבוצעת בצורה היעילה ביותר על ידי לתפוס את העור סביב הרמה של הטיביה מושך לכיוון הפלנגות. השימוש מספרי בשלב זה לחתוך אתמאוד דק העור אינו נדרש.
  7. בזהירות להחזיק את tarsals של כף הרגל העוברית עם פינצטה # 4 ולהסיר את metatarsals הראשון והחמישי ידי צובט המגודר ליד tarsals באמצעות # 5 פינצטה וזורקים.
  8. עם רגל שנערך באותה תנוחה, השתמש # 5 פינצטה לשבש את רקמות החיבור בין שלושת הפלנגות ו metatarsals הנותרים. הכנס את קצה פינצטה 5 # במפרק בין הפלנגות ו metatarsals להסיר את הפלנגות מן metatarsals.
  9. לבסוף, השתמש # 5 פינצטה לשבש את רקמות החיבור בין tarsals ו metatarsals. שוב הניח את קצה פינצטה 5 # במרחב המשותף בין tarsals ו metatarsals בעדינות לשחרר את metatarsals מן tarsals.
  10. בעדינות להרים את metatarsals בחינם עכשיו עם # 4 פינצטה מקום במדיום לנתיחה טרי.
    הערה: לנתיחה זהירות אמורה לספק 6 metatarsals מעובר אחד.
  11. כשכל metatarsals נדרש כבר גזור, carefully מקום metatarsals בנפרד לתוך 24 גם צלחות מחומם מראש המכיל 300 μl של התקשורת והתרבות. Metatarsals התרבות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5% לתקופה של עד 14 ימים.
    הערה: אין לשנות את התקשורת של תרבויות E15 לפחות עד יום 5 של תרבות שכן הדבר עלול לפגוע ביכולת מינרליזציה שלהם 26. הסיבות לכך אינן ברורות אך הצמיחה לינארית מינרליזציה מטריקס עלולה להיות תלויות גירוי על ידי גורמי גדילה שוחררו מן metatarsals.

ניתוח מניפולציה 4. של תרבויות כף הרגל

  1. ביום לנתיחה (יום 0) לבצע מדידות אורך ראשוניות באמצעות מיקרוסקופ עם תוכנת ניתוח מצלמה דיגיטלית מצ"ב תמונה. מדוד את האורך של אזור מינרליזציה המרכזי כאשר הוא מופיע אחרי כמה ימים של תרבות.
  2. מעת לעת, כנדרש, לבצע מדידות נוספות (בדרך כלל כל 2 nd יום) עד היום האחרון של תרבות ובנקודה מעצמות etatarsal מעובדות תלוי תוצאות הנדרשות (דנו בהקדמה).
  3. מוסף הבינוני של תרבויות איבר כף רגל עם גורמי אקסוגניים שונים כגון גורמי גדילה, הורמוני סוכנים תרופתיים מיום 0 תרבות 22,24. בכל המחקרים מסוג זה, לשלוט metatarsals המטופל נדרש.
    הערה: אם כי מומלץ כי ההעצמות המלאות הן גֶמֶד המקבילה מהרגל הנגדית, לא חלה שום הבדלים בצמיחה ליניארי או פוטנציאל מינרליזציה של nd התרבותי E15 2, 3 rd ו -4 metatarsals ה (ראו להלן, איור 2) .

Representative Results

מטרת השיטה הזו הייתה לבודד metatarsals העוברי ותרבות אותם לבדיקה של צמיחת עצם אורך מינרליזציה ECM. שימוש בפרוטוקול שלנו כפי שיתואר בהמשך, עצמות מסרקות עובריות נותחו בהצלחה, כמו מדמיינים ידי מיקרוסקופ אור. מדידות של עצמות כף הרגל, שנערך כמצוין באיור 1, הראו את יכולתם לגדול אורך האורך mineralize ECM שלהם (איורים 2 ו -3). מינרליזציה של המטריצה ​​הוא ציין לראשונה באמצע שנות diaphysis של גֶמֶד העצם הוא ציין בקלות על ידי מיקרוסקופ אור. אין מכתים נדרש למרות ספיג של calcein עשויה להציע להדמיה משופרת של מינרלים שהוקמו זה עתה.

מחקרים ניצול metatarsals עובריים עד כה 22,27,28 יש ניתחו את nd 2 גזור, 3 rd ו 4 ה (CENmetatarsals tral שלוש), בהנחה בצמיחה במבחנה מינרליזציה להיות דומה. בשנת vivo ההתפתחותי של metatarsals בעכברים, לעומת זאת, מגלה שהספרות יש 3 rd ו 4 th ראיות של מינרליזציה לפני כל metatarsals אחרים הפלנגות 29. הערכה של צמיחה ופוטנציאל מינרליזציה של בנפרד מבודדים תרבותי E15 2 nd, 3 rd ו -4 metatarsals ה עולה כי אין הבדלים משמעותיים במראה או היקף מינרליזציה לאחר 7 ימים של תרבות (איור 2). אין בדל הגידול האחוז מתחילת המחקר נמצא בתקופת התרבות. כמו הבדלים פוטנציאל מינרליזציה צוין הפרוטוקול הסטנדרטי של איגום 2 nd 3 rd ו 4 th metatarsals מופיע תקף למחקרים עתידיים.

באופן מסורתי, החוקרים הוסיפו βGP למדיהנהג metatarsals עוברי התרבות לקדם מינרליזציה ECM. עם זאת, במחקרים תרבית תאים, הוכח כי אם האנזים TNAP מתווסף התקשורת osteogenic המכיל βGP, בתצהיר מינרליים hydroxyapatite אקטופי עדיין מתרחשת גם בהיעדר של תאים 30. כדי לבחון את ההשפעות של מצעי אגוניסטים מינרליזציה שונים על יכולת מינרליזציה מסרקת, אנו מתורבתים metatarsals E15 בתקשורת תרבות המכילות מגוון של תוספי מזון, ותמונות ומדידות אורך נרשמו יומי. התוצאות הצביעו על כך עצמות המסרק E15 עדיין לגדול mineralize ECM שלהם בהעדר βGP. E15 כף הרגל עצמות בתרבית חומצה אסקורבית רק בחומרי הראו עליות דומות באורך מינרליזציה כמו metatarsals בתרבית בנוכחות βGP (איור 3).

הראינו גם כי lentivirus ניתן להשתמש כדי transfect DNA אקסוגני לתוך metata תרבותיrsals. כאן אנו transfected בהצלחה עצמות המסרק ביום 0 של תרבות (כלומר יום של דיסקציה) עם 2 x 10 6 חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חלקיקי הנגיף לכל כף הרגל. כדי לאפשר התמרה וירוס, polybrene נוספה בו זמנית לתרבויות ב 1: 500. תרבויות נותרו 7 ימים, ללא שינויים התקשורת כנדרש עבור מינרליזציה המסרק E15 להתרחש, בטרם מודגרות עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הכתם למשך 5 דקות ולאחר מכן דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ confocal ( איור 4). ההוכחה שלנו של ניסויי רעיון להראות התמרה יעילה בבירור. עם זאת יהיה זה נבון לבחון חלקים ברחבי מכלול של עצמות כף הרגל להעריך מניפולציה גן transfection ויעיל שלהם.

איור 1
איור 1: מתודולוגיה סטנדרטית המשמש למדידת tהוא אורך ו מינרליזציה אזור של עובריים metatarsals. (א) מדידות סה"כ אורך metatarsals E15 ביום 0 של התרבות (יום דיסקציה) נלקח דרך מרכז כף הרגל. מדידות (ב) אורך אורך הכולל של כף רגל לאחר שבעה ימים בתרבות. הערת העקמומיות הקלה כף הרגל. (ג) מדידת אורך אזור מינרליזציה לאחר שבעה ימים בתרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: צמיחה וקיבולת מינרליזציה של אנטומית ברורה E15 metatarsals הדמיה ומדידה של 2, 3 ו -4 metatarsals מן הגפיים האחוריים של עכברי E15 w.כפי שבוצע. (א) תמונות סידוריות של 2, 3 ו -4 metatarsals לאורך תקופת התרבות. (ב) עליה באחוזי אורך מהיום 0 בכל יום של תרבות. (ג) אורך מינרליים של 2, 3 ו -4 metatarsals פני תקופת התרבות מבוטא באחוזים של אורך כף הרגל המוחלט. הנתונים מיוצגים כממוצע ± תקן שגיאה של הממוצע (SEM), (n = 6). (ד) C57Bl / 6J אורכי כף הרגל בכל יום של תרבות. הנתונים מיוצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 6). בר שחור = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: צמיחת מינרליזציה קיבולת של wild-typeמתורבתות E15 metatarsals ב מדיה שונים לסרטן העצמות. (א) תמונות סידורי של metatarsals בתרבית חומצה אסקורבית בלבד, 1 מ"מ βGP, 3 מ"מ phosphocholine, סידן כלורי 1.5 מ"מ או 3 סידן כלורי מ"מ המכיל התקשורת. (ב) עליה באחוזי אורך מהיום 0 של metatarsals מתורבת עם תוספות שונות. (C) מינרליים אורך metatarsals בתרבית תקשורת שונה מבוטא באחוזים של אורך כף הרגל המוחלט. נתונים מיוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM), (n = 6). בר שחור = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: Transfection של E15 metatarsals עם וירוס ה- GFP Pמאמרים. (א) עצמות כף הרגל E15 היו transfected עם חלקיקי נגיף ה- GFP עבור הוכחה של מושג. עצמות (B) הוכתמו DAPI להדמיה DNA. (ג) תמונות Dual הצביעו transfection מוצלח של וירוס ה- GFP ברחבי מכלול של עצמות כף הרגל. ברים לבנים = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

תרבות metatarsals בעכברים העוברי מספקת מודל פיסיולוגי ביותר של צמיחת endochondral מינרליזציה. מחקרים מוקדמים אימתו כי metatarsals עכבר E15 לעבור דפוס רגיל של צמיחה והבחנת שלד. הסחוס (chondrocytes) ועצמות (אוסטאובלסטים ו osteoclasts) תאים ומטריצות collagenous שלהם הם נבדלים מאלו שנצפו vivo. עם זאת, ישנן מספר מגבלות מוכרות של דגם זה. המהירות של בידול osteoclast נפגעת כמו גם צמיחת עצם (אבל לא סחוס בידול). צמיחת עצם היא כ 50% לאט יותר מאשר לזה שנצפה vivo ועלולה להיות כתוצאה מליקויי גורמים מערכתיים המשפיעים על הייצור של גורמים מקומיים (למשל, IGF-1, BMPs, וכו ') 31. כמו כן, הוא מוכר היטב כי העצם רגיש לסביבה המכאנית שלה וזה גם המקרה עבור metatarsals התרבותי, אשר מגיב גhanges ב 32,33 העמסה מכנית. לכן, במצבים טעונים, כמתואר בפרוטוקול זה, מינרליזציה ספיגת מינרלים עלולים להיות בסכנה. עם זאת, מודל כף הרגל מציע את היכולת למדוד ישירות צמיחת עצם ליניארי הדבר שאינו אפשרי באמצעות 2D and 3D במערכות תרבות במבחנה.

סיפקנו תיאור מקיף של פרוטוקול מעורב לנתיחה והתרבות של metatarsals murine E15 ואכן, בפעם הראשונה, לאשר את תוקפו של איגום 2 nd, 3 rd ו 4 th metatarsals לניסויים.

Metatarsals מ E17 / E18 משמש בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים של צמיחת עצם בשל הפוטנציאל יוצא הדופן שלהם לגדול vivo לשעבר לתקופות זמן ארוכות (כלומר מעבר 14 ימים בתרבות). הם מודל ומבוסס לחקור את התפקידים של גורמי גדילה על צמיחת עצם אורך עוברית.בנוסף, לנתיחה וההתרבות של metatarsals לאחר הלידה היא מועסק בדרך כלל כדי להתוות את המנגנונים סביב צמיחת עצם לאחר לידה כפי שהיא מובנת כי צמיחת עצם לאחר לידה וצמיחת עצם עוברית מוסדרות באופן שונה 21. צמיחת העצם שנצפתה metatarsals לאחר הלידה התרבותי היא אולם פחות משמעותי מזו שנצפתה יסודות עובריים 25,34, הגבלת הפוטנציאל שלהם במחקרים לטווח ארוכים הדגשת ההשפעה מערכתית יותר על צמיחת עצם בשלב לאחר לידה זה. ואכן, 3 metatarsals לאחר הלידה יממה מעכברים הם בדרך כלל השלב האחרון, שניתן להשתמש בהם כדי להשיג 34 הצמיחה למדידה.

כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו הבידוד של עצמות כף רגל עובריות E15. העדר מינרלי hydroxyapaptite בעצמות כף רגל E15 אומר שהם מספקים מודל תחרות לחקור לא רק את המנגנונים סביב צמיחת עצם אורכת, אלא גם הייזוםשל מינרליזציה השלד. המטריצה mineralized של אזור הכונדרוציטים היפרטרופית מסוף מספק פיגום לפלישה אוסטאובלסטים להניח את עצם ספציפי מטריקס (דמוי עצם) המהווה מכן mineralized, וכפי מינרליזציה כגון הראשוני הזה הוא חיוני היווצרות העצם מוצלח ופונקציונלי 35. ואכן מספר הדיווחים האחרונים ניצול metatarsals E15 אשר היכולת הייחודית שלהם לחקירה של 28,36,37 תהליך מינרליזציה. בנוסף, חוקרים תארו את שימוש metatarsals E15 כמודל של אנגיוגנזה 38, המדגישים את הפוטנציאל של metatarsals העוברי כמודל מחוץ הגדרת צמיחת העצם / מינרליזציה.

הפרוטוקול אנו מתארים דורש ציוד מעבדה רגיל בלבד כולל ברדס זרימה למינרית, מיקרוסקופ לנתח לביצוע הנתיחה, ו CO 2 באינקובטור לתרבות של יסודות ניכרים. יתר על כן, מבוי סתום מאוד בסיסיture בינוני המכיל αMEM, BSA, אנטיביוטיקה, antimycotics וחומצה L-אסקורבית (שיתוף גורם בסינתזה של hydroxyproline ו hydroxylysine, שתי חומצות האמינו החיוניות לייצור קולגן 39) ימנע את השימוש של תוספי מוגדר, כגון סרה חיה . באופן מסורתי, חוקרים הוסיפו βGP למדיה נהג metatarsals התרבות העוברי אבל כפי שמתגלה בתוצאות שלנו, שימוש מקור פוספט נוסף אינו נדרש עבור מינרליזציה מוצלח במערכת התרבות הזאת. זהו ממצא חשוב המרדף שלנו להבנת המנגנונים שבבסיס מינרליזציה ECM.

Metatarsals בעבר נדבקו adenoviruses ובתוכה טופסי דומיננטי שלילי של Smad2 לחקור את התפקיד של הפיכת β גורם הגדילה בוויסות התפתחות העצם ארוך 40. כאן אנו חושפים גם את transfection המוצלח של עצמות כף רגל E15 wild-type עם חלקיקי נגיף ה- GFP, המציין tכובע טכניקות lentiviral שאפשר לאמץ בקלות לתמרן ביטוי גנים בתרבויות כף הרגל. באופן דומה, מערכת התרבות איבר כף הרגל היא מודל מצוין בו כדי להשוות את הצמיחה של העצמות מעכברים שינו גנטי כדי להבין טוב יותר את תפקידו של גן מסוים בתהליך צמיחת עצם. המחקרים הקודמים שלנו נצלו את מערכת התרבות איבר כף רגל כדי לקבוע את התפקיד של מדכא של ציטוקינים איתות-2 (SOCS2) ב צמיחת עצם endochondral. שימוש עצמות המסרק מעכברים שחסר לו SOCS2, הראינו הורמון גדילה כי הוא מסוגל לדמות עצמאית הצמיחה האורך שלהם של אינסולין כמו גורם גדילה (IGF-1), שלא כמו עצמות כף הרגל wild-type אשר אינם מגיבים לטיפול בהורמון גדילה 34, 41. זה מדגיש את המידה שבה תרבויות כף רגל ניתן להשפיע כדי לבחון את ההשפעות של גנים שונים ו / או גורמים חיצוניים על צמיחת עצם endochondral.

לסיכום, יש לנו detaiהוביל שיטה להפקה והתרבות המוצלחת של עצמות כף רגל עובריות אשר ניתן מניפולציות ובדק באמצעות מגוון של ניתוחים. מודל vivo לשעבר זו שומר תאי תאים ואינטראקציות התא-מטריקס, וכן מכיל chondrocytes בשלבים שונים של chondrogenesis, ולכן מתן מודל פיסיולוגי יותר תאים בשכבה או תרבות 3D. תרבויות איבר כף הרגל ולכן מודל ייחודי לבדיקת המנגנונים המולקולריים האחראים התאבנות endochondral, והם חיוניים כדי לקדם את ההבנה שלנו של שני בפיזיולוגיה העצם והפתופיזיולוגיה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection scissors World Precision Instruments 14393 Autoclave sterilise before use
Dumont #5 tweezers World Precision Instruments 500342 Autoclave sterilise before use
Dumont #4 tweezers World Precision Instruments 500339 Autoclave sterilise before use
SuperFine Vannas scissors World Precision Instruments 501778
Absolute ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17 Dilute to 70% v/v in dH2O
α-MEM without nucleosides Thermo Fischer Scientific  22561021
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3059
Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter Merck Millipore SLGP033RS
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate Sigma Aldrich P0378 Add directly to the media prior to experimentation
L-ascorbic acid-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080 Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G9422 Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C
Gentamicin Thermo Fischer Scientific  15710049
Amphotericin B Thermo Fischer Scientific  15290018
Nunc cell-culture treated 24-well plates Thermo Fischer Scientific  142475
Polybrene Sigma Aldrich H9268
DAPI Thermo Fischer Scientific  D3571

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
  2. Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
  3. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
  4. Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
  5. de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
  6. Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. Elsevier Academic Press. (2005).
  7. Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
  8. Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
  9. Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
  10. Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
  11. Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
  12. Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. 22-32 (1978).
  13. Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
  14. Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
  15. Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
  16. Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
  17. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
  18. Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
  19. Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
  20. Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
  21. Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
  22. Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
  23. Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
  24. MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
  25. Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
  26. Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
  27. Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
  28. Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
  29. Kaufman, M. The atlas of mouse development. 3, Academic Press. (1992).
  30. Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
  31. Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
  32. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
  33. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
  34. Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
  35. Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
  36. Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
  37. Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
  38. Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
  39. Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
  40. Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
  41. Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics