Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l'identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Una delle principali sfide della sanità nel 21 ° secolo, sono le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD). Tau è una proteina associata ai microtubuli che stimola microtubuli (MT) formazione. Tau è ugualmente coinvolto in diverse malattie neurodegenerative, le cosiddette tauopatie, di cui il più noto è AD. In questi disturbi, Tau auto-aggregati in filamenti elicoidali appaiati (PHFS) e si trova modifica per molti residui di modificazioni post-(PTM), come la fosforilazione 1. La fosforilazione della proteina tau è implicata nella regolazione sia della sua funzione fisiologica di stabilizzazione MT e la perdita patologica di funzione che caratterizza i neuroni AD.

Inoltre, la proteina Tau, se integrato in PHFS nei neuroni malati, è invariabilmente hyperphosphorylated 2. A differenza di Tau normale che contiene 2-3 gruppi fosfato, il Tau iperfosforilata in PHFS contiene 5-9 Phosphate gruppi 3. Iperfosforilazione di Tau corrisponde sia ad un aumento della stechiometria in alcuni siti e fosforilazione di altri siti che sono chiamati siti patologici di fosforilazione. Tuttavia, esiste sovrapposizione tra AD e modelli normali adulti di fosforilazione, nonostante le differenze quantitative nel livello 4. Come specifica eventi di fosforilazione funzione di influenza e la disfunzione di Tau rimane in gran parte sconosciuta. Il nostro obiettivo è di decifrare regolamento Tau dal PTM a livello molecolare.

Per approfondire la comprensione degli aspetti molecolari di Tau, dobbiamo affrontare sfide tecniche. In primo luogo, è una proteina Tau intrinsecamente disordinati (IDP) quando isolato in soluzione. Tali proteine ​​mancano ben definita struttura tridimensionale in condizioni fisiologiche e richiedono particolari metodi biofisici per studiare la funzione (s) e le proprietà strutturali. Tau è un paradigma per la crescente classe degli sfollati, che spesso si trovano associatopatologie quali le malattie neurodegenerative, aumentando così l'interesse per comprendere i parametri molecolari sottostanti le loro funzioni. In secondo luogo, la caratterizzazione di Tau fosforilazione è una sfida analitica, con 80 potenziali siti di fosforilazione lungo la sequenza più lunga 441 amminoacidi Tau isoforma. Un certo numero di anticorpi sono stati sviluppati contro epitopi fosforilate di Tau e sono utilizzati per il rilevamento di proteina tau nei neuroni o tessuto cerebrale. eventi di fosforilazione possono avvenire su almeno 20 siti presi di mira da chinasi prolina-diretto, la maggior parte dei quali in prossimità nella regione ricca di prolina. La qualitativo (quali siti?) E quantitativa (cosa stechiometria?) Caratterizzazione è difficile anche dalle più recenti tecniche di MS 5.

spettroscopia NMR può essere usato per studiare le proteine ​​disordinate che sono altamente sistemi dinamici costituiti da gruppi di conformeri. spettroscopia NMR ad alta risoluzione è stato appliEd a indagare sia la struttura e la funzione della proteina Tau. Inoltre, la complessità del profilo fosforilazione di Tau ha portato allo sviluppo di strumenti molecolari e nuovi metodi analitici utilizzando NMR per l'identificazione dei siti di fosforilazione 6 - 8. NMR come metodo analitico consente l'identificazione dei siti di fosforilazione Tau in modo globale, visualizzazione di tutte le modifiche single-site in un singolo esperimento, e la quantificazione del grado di incorporazione di fosfato. Questo punto è essenziale in quanto, anche se gli studi di fosforilazione di Tau abbondano nella letteratura, la maggior parte di loro sono stati eseguiti con anticorpi, lasciando un ampio margine di incertezza sul profilo completo di fosforilazione e quindi il vero impatto di singoli eventi di fosforilazione. chinasi ricombinanti tra PKA, glicogeno-sintasi chinasi 3β (Gsk3β), ciclina-dipendente chinasi 2 / ciclina A (CDK2 / CYCA), ciclina-dipendente chinasi 5 (CDK5) / p25 attoproteine ​​ivator, extracellulare segnale-regolate chinasi 2 (ERK2) e microtubuli-affinità di regolazione chinasi (MARK), che mostrano l'attività fosforilazione verso Tau, possono essere preparati in una forma attiva. Inoltre, Tau mutanti che permettono per la generazione di specifiche isoforme della proteina Tau con i modelli di fosforilazione ben caratterizzati sono utilizzati per decifrare il codice di fosforilazione di Tau. Spettroscopia NMR viene quindi utilizzato per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati 6 - 8. Anche se in vitro fosforilazione di Tau è più impegnativo di pseudo-fosforilazione come per mutazione di selezionati Ser / Thr in residui di acido glutammico (Glu), questo approccio ha i suoi meriti. Infatti, né i impatto né di interazione parametri strutturali di fosforilazione possono sempre essere imitato da acidi glutammico. Un esempio è il motivo turno osservato intorno fosfoserina 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), che non è riprodotto con Glu mutazioni 9.

in fosforilazione vitro da ricombinante ERK2 chinasi è presentato. ERK2 viene attivata dalla fosforilazione da mitogeni activated protein chinasi / ERK chinasi (MEK) 10 - 12. Oltre alla preparazione di modificato, proteina Tau isotopicamente marcati, la strategia NMR utilizzato per l'identificazione del PTM è descritto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produzione di 15 N, 13 C-Tau (figura 1)

  1. Trasforma pET15b-Tau ricombinante T7 plasmide di espressione 13,14 in BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellule batteriche 15.
    NOTA: la codifica cDNA per la più lunga (441 residui di aminoacidi) Tau isoforma viene clonato tra NcoI e XhoI siti di restrizione del plasmide pET15b.
    1. Mescolare delicatamente 50 ml di BL21 competente cellule (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonie per mg di DNA plasmidico, con 100 ng di DNA plasmidico in un tubo di plastica da 1,5 ml.
      NOTA: Codone-utilizzo ottimizzato ceppi batterici per l'espressione di cDNA eucariotica non sono essenziali per la produzione di Tau umana.
    2. Posizionare la miscela di cellule in ghiaccio per 30 min e poi shock termico per 10 sec a 42 ° C. Posizionare il tubo di nuovo in ghiaccio per 5 minuti e aggiungere 1 ml di temperatura ambiente LB (Luria-Bertani) di media. Incubare la sospensione batterica a 37 ° C per 30 min sotto blandaagitazione.
  2. Distribuire utilizzando un ciclo inoculo 100 ml di sospensione cellulare in modo uniforme su una piastra di agar di terreno LB contenente 100 ug / ml di ampicillina.
  3. Incubare la piastra di selezione per 15 ore a 37 ° C.
  4. Mantenere la piastra di selezione a 4 ° C fino procedere alla fase coltura, per un massimo di 2 settimane circa.
    NOTA: uno stock di glicerolo di coltura batterica (50% glicerolo), conservati a -80 ° C, può essere preparato per avviare la coltura in una fase successiva.
  5. Aggiungere 1 ml di 1 M MgSO 4, 1 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml 100x MEM vitamina complemento, 1 ml di 100 mg / ml di ampicillina a 1 L di sali M9 autoclave (6 g di Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 , 0,5 g NaCl).
    NOTA: Un precipitato bianco formerà dopo l'aggiunta della soluzione di CaCl 2 ai sali M9 che dissipa rapidamente.
  6. Solubilizzare 300 mg di 15 N, media 13 C-completo, 1 g di 15NH 4 Cl e 2 g di 13 C 6-glucosio in 10 ml di terreno M9. Filtro-sterilizzare la soluzione isotopica utilizzando un filtro da 0,2 micron, direttamente nel terreno M9.
  7. Sospendere utilizzando un inoculo ciclo una colonia di pET15b-Tau trasformato batteri dalla piastra di selezione in 20 ml di terreno LB addizionato con 100 ug / ml di ampicillina.
  8. Incubare il mezzo inoculato a 37 ° C per circa 6 ore.
  9. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD 600) in 1 ml di una diluizione di dieci volte della coltura batterica in una cuvetta spettrometro di plastica.
    NOTA: torbidità della coltura batterica di OD 600 di 3,0-4,0 indica che la fase di crescita di saturazione viene raggiunta.
  10. Aggiungere 20 ml della cultura LB saturo a 1 L di terreno di coltura M9 addizionato con ampicillina (100 mg / ml concentrazione finale), in 2 pallone di coltura sconcertato L Erlenmeyer plastica.
  11. Porre il pallone cultura in un incubatore programmabile impostato a 10 °C e 50 rpm. Programmare l'incubatore per passare a 200 giri al minuto e 37 ° C nelle prime ore del mattino del giorno successivo.
  12. Misura OD 600 su 1 ml di coltura batterica in una cuvetta spettrometro di plastica. Aggiungere 400 ml di 1 M IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside) soluzione madre (mantenuta a -20 ° C) quando OD 600 raggiunge un valore di circa 1,0 per indurre l'espressione della proteina Tau ricombinante.
  13. Continuare l'incubazione a 37 ° C per ulteriori 3 ore. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 5.000 xg per 20 min.
  14. Congelare il pellet batterico a -20 ° C. Tenere congelato fino alla fase di purificazione, per un periodo prolungato, se necessario.

2. Purificazione di 15 N, 13 C-Tau (Figura 2)

  1. Autoclave scambio cationico (CEX) buffer di depurazione a 121 ° C sotto i 15 psi per 20 min. buffer Conservare a 4 ° C.
  2. Scongelare il pellet di cellule batteriche e risospendere accuratamente in 45 mldell'estrazione CEX Un buffer (50 mm Napi tampone pH 6,5, 1 mM EDTA) appena completato con 1x inibitori della proteasi cocktail (1 compressa) e DNasiI (2.000 unità).
  3. Frantumare le cellule batteriche utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione a 20.000 psi. 3-4 passaggi sono necessari. Centrifugare a 20.000 xg per 40 minuti per rimuovere il materiale insolubile.
  4. Riscaldare l'estratto cellula batterica per 15 min a 75 ° C utilizzando un bagno d'acqua.
    NOTA: un precipitato bianco si osserva dopo pochi minuti.
  5. Centrifugare a 15.000 xg per 20 min e mantenere il surnatante contenente la proteina Tau termostabile.
  6. Conservare a -20 ° C fino alla successiva fase di purificazione, se necessario.
  7. Eseguire un cromatografia a scambio cationico su una forte resina CEX imballato come una colonna 5 ml di base per mezzo di una proteina veloce cromatografia liquida sistema (FPLC) (Figura 3 A).
    1. portata impostata a 2,5 ml / min.
    2. Equilibrare la colonna in CEX Un buffer
    3. Caricare il heated- 60-70 mlestratto contenente Tau utilizzando una pompa di campionamento, oppure pompa A, a seconda del sistema. Raccogliere il flusso continuo di analisi per verificare che la proteina Tau è efficacemente vincolante alla resina (vedi 2.8).
    4. Lavare la resina con CEX Un buffer fino assorbanza a 280 nm è tornato al valore di base.
    5. Eluire Tau dalla colonna utilizzando un tre fasi NaCl gradiente ottenuto mediante aumento graduale di tampone CEX B (CEX Un buffer con 1 M NaCl). Programmare il FPLC come segue: primo passo del gradiente al 25% tampone CEX B in 10 volumi di colonna (CV) per raggiungere 250 mM NaCl, secondo passaggio al 50% tampone CEX B in 5 CV per raggiungere 500 mM NaCl, e terzo passo al 100% CEX B buffer in 2 CV per raggiungere 1 M NaCl. Raccogliere 1,5 ml frazioni durante le fasi di eluizione.
  8. Analizzare 10 ml di frazioni raccolte durante la fase di eluizione mediante SDS-PAGE (12% gel SDS-acrilammide) e Coomassie colorazione (Figura 3) 16. Controllare la fase di caricamento della colonna così da analyzing 10 ml di flusso continuo.
  9. Scegliere le frazioni contenenti Tau e piscina queste frazioni per il passo successivo.
  10. Effettuare uno scambio di buffer sulle frazioni Tau contenenti aggregati (Figura 3 B).
    1. Equilibrare una colonna dissalazione di 53 ml G25 letto riempito di resina (26 x 10 cm) in 50 mM di bicarbonato di ammonio (buffer volatile) utilizzando un sistema FPLC.
    2. Impostare la portata a 5 ml / min. Iniettare il campione Tau sulla colonna tramite un sistema di iniezione 5 ml. Raccogliere frazioni corrispondenti al picco di assorbimento a 280 nm.
    3. Ripetere l'iniezione 3-4 volte, a seconda del volume del pool iniziale CEX.
  11. Calcolare la quantità di proteina Tau purificata utilizzando l'area del picco sul cromatogramma a 280 nm (1 mg di Tau corrisponde a 140 mAU * ml).
    NOTA: Il coefficiente di estinzione di proteina Tau a 280 nm è 7,550 M -1 cm -1. Tau non contiene residui di Trp.
  12. Pool tutte le frazioni Tau.
  13. aliquot il campione in provette contenenti l'equivalente di 1 a 5 mg di Tau. Scegliere questi tubi in modo che il volume della soluzione è piccolo rispetto al volume del tubo (per esempio 5 ml di soluzione in un tubo da 50 ml).
  14. Perforare i tappi dei tubi utilizzando un ago. Congelare i campioni Tau a -80 ° C.
  15. campioni lyophilize Tau. proteina Tau liofilizzato può essere conservato a -20 ° C per lunghi periodi di tempo.

3. In Vitro fosforilazione di 15 N-Tau

  1. Disciogliere 5 mg di Tau liofilizzato in 500 microlitri tampone di fosforilazione (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. Aggiungere 2,5 mM ATP (25 ml di 100 mM soluzione madre conservati a -20 ° C), 1 mM DTT (1 ml di 1 M soluzione madre conservati a -20 ° C), 1 mM EGTA (2 ml di uno stock di 0,5 M soluzione), cocktail di inibitori della proteasi 1x (25 ml di uno stock 40x ottenuta sciogliendo 1 compressa nel buffer di 1 ml fosforilazione) e 181; M attivato His-ERK2 (250 microlitri di tampone di conservazione 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl e 10% glicerolo, conservato a -80 ° C) in un volume totale di campione 1 ml.
    NOTA: La attivato il suo-ERK2 può essere preparato in casa 5,8 da fosforilazione con la chinasi MEK.
  3. Incubare 3 ore a 37 ° C.
  4. Riscaldare il campione a 75 ° C per 15 minuti per inattivare ERK chinasi.
  5. Centrifugare a 20.000 xg per 15 min. Raccogliere e conservare il surnatante.
  6. Dissalare campione proteico in 50 mM di bicarbonato di ammonio usando una colonna di 3,45 ml G25 letto di resina imballato (1.3 x 2.6 cm), che è adatto per un campione 1 ml.
  7. Eseguire un 12% SDS-PAGE 16 con 2,5 ml di campione proteico per controllare sia la sua integrità e la fosforilazione efficiente (Figura 4).
  8. Lyophilize il campione Tau fosforilata. Conservare la polvere a -20 ° C.

4. Acquisizione di spettri NMR (Figura 5)

  1. Solubilizzare 4 mg di liofilizzato 15 N, 13 C-ERK fosforilata-Tau in 400 microlitri di buffer NMR (50 mm o 50 mm Napi deuterati Tris- D11 .CL, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA e 1 mM DTT).
  2. Aggiungere 5% D 2 O per bloccaggio settore dello spettrometro NMR e 1 mM TMSP (3- (trimetilsilil) sale sodico 4 propionico-2,2,3,3-d)) come riferimento il segnale NMR interna. Aggiungere 10 ml di una soluzione 40x magazzino di completo cocktail inibitore della proteasi.
  3. Trasferire il campione in un tubo NMR 5 millimetri usando una siringa elettronico con un lungo ago o pipetta Pasteur. Chiudere la provetta NMR utilizzando lo stantuffo. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra il pistone e il liquido da movimenti stantuffo.
  4. Posizionare il tubo NMR in uno spinner. Regolare la posizione verticale nel filatore con il calibro appropriato per la testa della sonda NMR utilizzato, in modo che la maggior parte della soluzione campione sarà all'interno della bobina NMR.
  5. Avviare il flusso d'aria: clicca ascensore in la finestra di sistema di controllo magnetico. posizionare accuratamente il filatore con il tubo nel flusso d'aria nella parte superiore del foro del magnete. Arrestare il flusso d'aria (clicca ascensore) e lasciare che il tubo di scendere in posizione all'interno della testa della sonda nel magnete.
  6. Impostare la temperatura a 25 ° C (298 K).
  7. Eseguire la sintonia semi-automatico e la corrispondenza della testa di misura per ottimizzare la trasmissione di potenza. Digitare atmm sulla riga di comando.
  8. Bloccare la frequenza spettrometro utilizzando il segnale D 2 O del campione registrato sul canale deuterio. Fare clic di blocco nella finestra di sistema di controllo magnetico.
  9. Avviare la procedura di spessoramento per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico nella posizione del campione. Tipo topshim gui sulla riga di comando per aprire la finestra di spessore. Fare clic su Start nella finestra di spessore. Controllare il valore variazione standard B0 residua per verificare che gli spessori sono ottimali (meno di 2 Hz è buono).
  10. Calibrare il parametro p1 (lunghezza di un protoneimpulsi a radiofrequenza in msec), che è necessaria per ottenere una rotazione di 90 ° di giri protoni. Obiettivo per l'impulso 360 ° usando uno spettro 1D di protoni dell'acqua (Figura 6).
  11. Regolare la frequenza di offset impostando il parametro o1 (in Hz) alla frequenza dell'acqua protoni nello spettro 1D (Figura 6).
  12. Inizia acquisizione di uno spettro protonico 1D (sequenza di impulsi con la sequenza watergate per la soppressione del segnale dell'acqua, per esempio zggpw5) per verificare segnali dal campione (Figura 7). Adattare il numero di scansioni alla concentrazione proteica relativa. Digitare ZG sulla riga di comando per avviare l'acquisizione.
  13. Impostare parametri aggiuntivi per l'acquisizione di un 2D [1 H, 15 N] spettro HSQC (impulso sequenza hsqcetfpf3gpsi, figure 8-9).
    1. Per un 15 N, 13 C etichettato campione, disaccoppiare 13 C durante l'evoluzione indiretta 15 N.
    2. 1 H (F2) e 15 N dimensioni (F1).
      NOTA: Adattare il numero di punti di dati di acquisizione al campo spettrometro di mantenere un numero simile di Hz per punto e di limitare i tempi di disaccoppiamento: utilizzare 3.072 punti a 900 MHz e 2048 punti a 600 MHz, nella dimensione 1 H.
    3. Ottimizzare i parametri aggiuntivi nelle sequenze di impulsi, corrispondente a ritardi, lunghezze di impulso, offset frequenze, livelli di potenza. Tipo ased sulla riga di comando per visualizzare tutti i parametri rilevanti per l'esperimento.
  14. Impostare i parametri per l'acquisizione di un 3D [1 H, 15 N, 13 C] spettro HNCACB (sequenza di impulsi hncacbgpwg3d, Figura 10A) a 600 MHz.
  15. Impostare i parametri per un 3D [1 H, 15 N, 15 N] esperimento HNCANNH (impulso sequenza hncannhgpwg3d) a 600 MHz. Impostare il numero di punti a 2048 in 1 H e 64e 128 punti in due 15 N dimensioni. Definire le larghezze spettrali come 14, 25, 25 parti per milione (ppm) centrato su 4.7, 119, 119 ppm nel 1 H, 15 N e 15 N dimensioni. Durata di acquisizione con 16 scansioni è di 1 giorno e 22 ore.

5. Individuazione di siti di fosforilazione

  1. spettri di processo utilizzando il software di acquisizione ed elaborazione NMR.
    1. Eseguire una trasformazione di Fourier dei dati (Figura 7). Tipo ft per uno spettro 1D, XFB per uno spettro 2D o ft3d per uno spettro 3D, sulla riga di comando.
    2. Fase e riferimento tutti gli spettri (Figura 7C) utilizzando le finestre interattive.
  2. Identificare risonanze di interesse nella HSQC 2D potenzialmente corrispondente alla fosforilate residui Ser e Thr (Figura 9, box rosso).
  3. Piani di estrazione (ad esempio 2D 1 H- 13 C spettri) dalo spettro C 3D 1 H- 15 N-13 utilizzando i 15 N spostamenti chimici di risonanze di interesse in 2D. Utilizzare il cursore di dimensione 2 (w2) per scegliere la frequenza 15 N corrispondente al piano (w1-w3) da visualizzare (Figura 10B).
  4. Raccogliere le frequenze di risonanza di 'CA' e 'CB' 13 C nuclei della 'i' e residui 'i-1' (debole insieme di segnali rispetto a quelli del residuo i) per ogni [1 H, 15 N] risonanza di interesse nello spettro HNCACB 3D cliccando sulla risonanza, nel menu della modalità puntatore trovare / aggiungere picco, aggiungere il valore di spostamento chimico in un file di elenco di picco.
    1. Identificare il tipo I residui, PSER o pThr, confrontando i cambiamenti chimici nella lista di picco a valori noti di CA e CB spostamenti chimici di PSER e pThr 17.
    2. Identificare la presenza di un residuo di Pro alla i + 1 posizione da una ulteriore caratteristica +2 ppm spostamento of il valore di spostamento CA chimica 18.
    3. Confrontare i valori di chemical shift delle risonanze CA e CB corrispondenti alla i-1 residuo una tabella di spostamenti chimici previsti per Tau residui amminoacidici 19 per identificare la natura del residuo in posizione i-1.
  5. Raccogliere le frequenze di risonanza di 15 N nuclei di la 'i' e 'I-1' residui per ciascuna [1 H, 15 N] risonanza di interesse nello spettro HNCANNH.
  6. Confrontare i valori di chemical shift 15 N all'assegnazione chemical shift della proteina Tau 20 - 23.
  7. Confronto dipeptidi identificati con la sequenza Tau per definire l'assegnazione specifica sequenza.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figura 3A mostra un grande picco di assorbimento a 280 nm osservati durante il gradiente di eluizione. Questo picco corrisponde alla proteina Tau purificata come visto sul gel di acrilammide sopra il cromatogramma. Figura 3B mostra un picco di assorbimento ben separati a 280 nm e picco di conducibilità, assicurando che dissalazione della proteina è efficiente. La figura 4 mostra proteina gel-shift osservato mediante analisi SDS-PAGE 16 caratteristico multiple fosforilazione proteica (confrontare corsie 2 e 3). La figura 6 mostra una serie di protone (1 H) spettri 1D all'aumentare lunghezze di impulso (in msec). Per impostare la lunghezza dell'impulso che ruoterà 1 H rotazione magnetizzazione di 90 °, un impulso corrispondente ad una rotazione di 360 ° viene usato in pratica, come è più facile per calibrare minimizzando il segnale. Il segnale di protoni dell'acqua è nullo quando la lunghezza dell'impulso 360 ° sia adeguatamente definito. Il valore corrispondente ad un 36076; rotazione viene quindi divisa per 4. p1 in questo esperimento è 10,5 msec. Regione allargata: La frequenza del segnale residuo viene usato per definire il parametro O1P (frequenza di offset per 1 H). Figura 7 A. mostra un decadimento gratuito di induzione (FID), visualizzato per garantire il rilevamento di un segnale NMR. Figura 7B. mostra una 1D spettro 1 H con una fase non corretta, visto da risonanze appaiono come picchi asimmetrici. La Figura 7C mostra una 1D spettro 1 H con un buon rapporto segnale rumore, indicando che i parametri di acquisizione di base sono stati correttamente fissati e un segnale dal campione di proteine possono essere rilevati. La figura 8 mostra 2D 1 H, 15 N HSQC spettri ricombinante 15 N-Tau a 900 MHz; Figura 8A con una buona sensibilità e risoluzione e la figura 8B. con rilevamento di proteolisi nel campione, come visto dalla comparsa di pe ulterioriAKS nello spettro (scatola blu). Figura 9 mostra 2D 1 H, 15 N HSQC spettri ricombinante 15 N-Tau Figura 9A a 600 MHz, con una buona sensibilità, ma meno risoluzione rispetto alla figura 8A. Figura 9B a 600 MHz, mostra l'aspetto di picchi aggiuntivi nello spettro corrispondente ai residui fosforilati (box rosso). Figura 9C a 900 MHz, mostra picchi nello spettro corrispondente ai residui fosforilati (riquadro rosso). La risoluzione è meglio in Figura 9B. Figura 10 A mostra proiezioni dello spettro NMR 3D utilizzato per valutare un esperimento riuscito. La figura 10B mostra un piano 1 H- 13 C estratta dallo spettro 1 H 15 N- 13 C 3D con buona intensità del segnale consente di rilevare segnali 13 C da entrambi i-1 i residui ie.


Figura 1: Schema delle principali fasi di produzione di proteine ricombinanti ed etichettatura isotopica. Passi da batteri trasformazione per la produzione di proteine ​​ricombinanti sono descritti come descritto al punto 1 del protocollo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Schema delle principali fasi di purificazione della proteina Tau ricombinante. A pochi passi da cellule batteriche lisi di purificazione della proteina ricombinante sono descritte come descritto nel paragrafo 2 del protocollo. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta figura.

Figura 3
Figura 3: passi cromatografia liquida di protocollo. (A) scambio cationico cromatografia frazionamento dell'estratto batterica riscaldata. L'assorbanza a 280 nm, 260 nm e la conducibilità corrispondono rispettivamente alle linee nere solide e tratteggiate e linea rossa tratteggiata. 12% SDS-PAGE analisi delle frazioni raccolte è mostrato sopra il cromatogramma. (B) Dissalazione della proteina Tau in un tampone adatto per liofilizzazione. La quantità di proteina tau purificata stimato dalla zona di picco (2.260 mAU * ml) è di 16 mg di Tau. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4 Figura 4: 12% SDS-PAGE analisi di Tau. Corsia 1, indicatore del peso molecolare; corsia 2, 10 mg di Tau; corsia 3, 10 mg di ERK-fosforilata Tau. Tau, come altri IDP, viene eseguito in modo anomalo su SDS-PAGE, con un peso molecolare apparente di circa 60 kDa invece dei previsti 46 kDa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Schema delle principali fasi di preparazione del campione NMR, acquisizione dati spettroscopia NMR e l'elaborazione dei dati. A pochi passi dalla NMR preparazione del campione per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati sono descritti come descritto nel paragrafo 4 del protocollo. Clicca qui per visualizzare un versio più granden di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Set-up del parametro p1 per l'acquisizione dati NMR. Questo parametro è diverso tra i campioni ed è principalmente dipende dalla concentrazione di sale. Viene mostrata una curva di nutazione 1 H standard per l'80% H 2 O in D 2 O. spettri singola scansione con un ritardo di 30 sec riciclo sono stati raccolti e disegnati orizzontalmente. L'impulso (p1) è stata variata da 1 msec a 55 msec a passi di 1 msec. In teoria, il segnale deve essere massima per un impulso a 90 ° e pari a zero per un impulso a 180 °. Tuttavia, in pratica, la radiazione smorzamento provoca problemi di asimmetria e distorsione di fase che rendono difficile determinare direttamente gli impulsi di 90 ° o 180 °. Il secondo punto zero corrisponde ad una durata dell'impulso 360 °. La regione ingrandita mostra un segnale residuo per 360 ° impulso che viene utilizzato per definire il parametro di frequenza O1P. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: l'elaborazione dei dati NMR. (A) il segnale di induzione libera decadimento nel dominio del tempo. 1D protone spettri (B) derivanti da Fourier trasformazione del FID dal pannello A nel dominio della frequenza, ma con la fase errata (PHC0 -206 °). (C) per fasi (PHC0 -113 °) e di riferimento (segnale TMSP a 0 ppm). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"/>
Figura 8: 2D 1 H, 15 N HSQC spettri ricombinante 15 N-Tau a 900 MHz. 3.072 e 416 punti di acquisizione dati sono stati registrati con larghezze spettrali di 14 e 25 ppm in 1 H (F2) e 15 N dimensioni (F1), rispettivamente. 16 scansioni sono state registrate per incremento F1, portando ad una durata dell'esperimento di 4 h 30 min. (A) buon campione Tau qualità (B) del campione Tau che mostra la degradazione come rivelato dalla comparsa di risonanze supplementari in una particolare regione dello spettro (ad alto campo 1 H, a basso campo 15 N), qui inscatolato in blu. Questo ultimo campione è stato preparato senza inibitori della proteasi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9: 2D 1 H, 15 N HSQC spettri di ricombinante 15 N-Tau. (A) non fosforilata Tau, 600 MHz di spettro (B) fosforilata Tau, 600 MHz di spettro e (C) fosforilata spettro Tau, 900 MHz. Ulteriori risonanze in una particolare regione dello spettro, qui inscatolati in rosso, si osservano in spettri Tau fosforilata. Queste risonanze, che corrispondono al protone ammide (1 H- 15 N) correlazioni di residui PSER e PTHR, sono facilmente visualizzati nella regione circa 8,5 a 9.5 ppm per 1 H e 117 a 125 ppm per 15 N, all'esterno della massa del 1 H, 15 N correlazioni dello spettro Tau fosforilata. (A e B) corrispondono a spettri acquisiti a 600 MHz, 2.048 e 256 punti dati a larghezze spettrali di 14 e 25 ppm sono stati registrati nel 1 H (F2) e 15 N dimensioni (F1), rispettivamente.32 scansioni sono stati utilizzati, e la durata totale dell'acquisizione è stato 2 ore 44 min e (C) a 900 MHz, sono stati registrati 3.072 e 416 punti dati a larghezze spettrali di 14 e 25 ppm in 1 H (F2) e 15 N ( F1) dimensioni rispettivamente. 48 scansioni sono stati utilizzati, e la durata totale dell'acquisizione è stato 6 ore 37 min. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10
Figura 10: 3D 1 H, 15 N, 13 C NMR, proiezioni e piani 2D estratti. 2.048, 72, e 256 punti dati sono stati registrati nel 1 H (F3), 15 N (F2), e 13 C (F1) le dimensioni, rispettivamente. Larghezze spettrali sono 14, 25, e 61 ppm, centrata su 4,7, 119, e 41 ppm in 1 H,15 N e 13 dimensioni C, rispettivamente. Durata dell'acquisizione utilizzando 16 scansioni è di 4 giorni e 6 ore. Rappresentazione (A) Cube corrispondente alla Fourier trasforma 3D set di dati di uno spettro HNCACB di ERK-fosforilata tau ottenuto a 600 MHz. Il 2D 1 H, 15 N e 1 H, 13 C aerei sono ottenuti dalla proiezione dei dati 3D lungo il 13 C e 15 N dimensioni, rispettivamente. l'elaborazione dei dati e la rappresentazione è stata fatta utilizzando l'acquisizione NMR e software di elaborazione. (B) 2D 1 H, 13 C aereo estratta del 3D 1 H, 15 N, 13 C NMR set di dati ad un passaggio 15 N chimica di 121,8 ppm. Un zoom (a destra) centrato sul 1 H chemical shift di 9,38 ppm mostra le 13 CA e CB 13 risonanze di entrambi i residui (pThr153) e i-1 (Ala152). La risonanza 13 CB è alias a causa della larghezza delle sfinestra pectral. Rappresentazione grafica e di picco di prelievo sono state eseguite utilizzando il software di analisi NMR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abbiamo usato la spettroscopia NMR per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati. L'espressione ricombinante e purificazione qui descritta per la proteina Tau umano full-length possono allo stesso modo essere utilizzati per produrre mutanti Tau o Tau domini. Isotopicamente proteina arricchito è necessaria per la spettroscopia NMR, rendendo necessario l'espressione ricombinante. Identificazione dei siti di fosforilazione richiede l'assegnazione di risonanza e un 15 N, 13 C proteina doppiamente marcato. Dato il costo di isotopi, buona resa è necessaria nella fase di espressione ricombinante. Il glucosio è il fattore limitante per la crescita batterica nel mezzo M9 quindi la quantità di 13 C 6-glucosio può essere aumentata a 4 g per litro di mezzo di crescita per migliorare la resa. L'aggiunta di completi medie e MEM vitamine non sono obbligatori, ma contribuire a stimolare la crescita e migliorare la resa. Dato l'alto costo del supporto etichettato completa, il prodotto viene utilizzato solo come mezzo di crescita supplement. La crescita batterica è lento in media M9. In generale, colture batteriche che utilizzano supporti M9 integrato con il 3% di tempo completa portata media di induzione dopo circa 4 ore di incubazione. Un OD 600 di 1,6-1,8 viene solitamente ottenuta alla fine della cultura. Rendimento atteso della proteina tau ricombinante è di circa 15 mg per litro di coltura batterica. L'uso di un incubatore programmabili consente di programmare convenientemente produzione di proteine, raccolta di pellet batterico e controllo analitico della produzione di proteine ​​durante lavorativi ore diurne.

concentrazione del campione è importante per ottenere uno spettro di buona qualità. Un tipico esempio Tau sufficiente per uno spettro 2D conterrebbe 1 mg in 200 microlitri (cioè 100 mM) proteina Tau. Per uno spettro 3D, sono necessari almeno 200 mM in 300 microlitri, a condizione che una sonda criogenica viene utilizzato. L'accesso a uno spettrometro ad alto campo, come ad esempio lo strumento 900 MHz utilizzato in questo studio fornirà una migliore rapporto segnale-rumoree ridurre i vincoli sulla concentrazione del campione (Figura 8). Dato che Tau è una grande proteina disordinato, la sua spettri NMR sono caratterizzati da una notevole sovrapposizione del segnale, e uno spettrometro NMR ad alto campo sarà anche la scelta migliore in termini di risoluzione (Figura 8). Tuttavia, le risonanze corrispondenti ai siti di fosforilazione sono in una regione distinta dello spettro e sono facili da rilevare anche con uno spettrometro a 600 MHz (Confronto figure 9 B 9C). Inoltre, per sua natura disordinata, la proteina Tau è sensibile alla proteolisi (figure 8B).

Si consiglia la sterilizzazione di buffer per limitare il degrado Tau. L'aggiunta di inibitori della proteasi al campione NMR aiuta a proteggere contro Tau degradazione durante periodi di acquisizione dati che possono durare da ore a giorni, a seconda della sequenza di impulsi. PH basso (cioè pH inferiore a 7.0) è richiesta a AVOID troppo veloce scambio tra protoni proteici e protoni dell'acqua, il che porta a segnalare allargamento. pH del campione deve essere ben controllato per garantire la riproducibilità degli spettri. Infatti, poiché i valori pKa di PSER e pThr sono vicini al pH ottimale per spettroscopia NMR, spostamenti chimici di residui fosforilati sono molto sensibili alle variazioni di pH. Regolazione del pH del campione NMR può essere fatta direttamente utilizzando un pHmetro con un elettrodo pH micro, atto a piccoli volumi. Tau è una proteina solubile e non aggrega in condizioni standard. Aggiunta di polianioni, quali eparina solfato, e incubazione a 37 ° C può avviare aggregazione in campioni Tau. In questo caso, data la natura solida degli aggregati, la maggior parte delle risonanze nella corrispondente spettro NMR ampliano là rilevamento. Anche i campioni Tau fosforilata non lo fanno aggregato nelle condizioni descritte qui per l'acquisizione dei dati NMR.

Rispetto all'analisi anticorpo, NMR fornisce una ovista verall di PTM. La spettrometria di massa può anche essere utilizzato per identificare il modello fosforilazione di un campione proteico. etichettatura isotopica non è necessario per questa tecnica, e le quantità di campione necessari sono molto più piccoli. Tuttavia, la caratterizzazione di una proteina con più fosforilazioni, come Tau, rimane difficile. fosforilazioni adiacenti produrranno peptidi isobariche nelle strategie bottom-up di identificazione. Identificazione completa quindi bisogno MS / MS sequenziamento dei peptidi ottenuti mediante proteolisi del campione. Un vantaggio di NMR consiste nella natura quantitativa intrinseca della tecnica. L'intensità di un segnale NMR può essere collegato alla quantità del gruppo chimico presente in un sito specifico. Possiamo quindi definire la percentuale di modificazione chimica in ogni sito. I progressi più recenti nelle applicazioni di MS hanno tuttavia dimostrato che l'analisi MS di Tau fosforilazione multipla è fattibile 24, anche in maniera quantitativa, dopo una corretta normalizzazione 25.

Qui, abbiamo presentato Tau fosforilazione da ERK2 attivato, ma la metodologia può essere utilizzata per la fosforilazione con altre chinasi oltre 6,7,26 - 28. Esperimenti cinetici possono essere eseguite, che può aiutare a definire la specificità chinasi verso una proteina substrato 28 - 31. Studi fosforilazione non sono limitati a chinasi ricombinante, e l'attività chinasica di estratti cellulari o tissutali possono essere analizzati 6,32,28. Uno sviluppo interessante è l'uso di NMR in cellule di studiare in situ modifiche 33,34. Al contrario, NMR è anche ben adattato per affrontare fosfatasi specificità, come dimostra lo studio della defosforilazione di Tau fosforilata dal PP2A fosfatasi 35. spettroscopia NMR può essere applicato alla caratterizzazione di inibitori della chinasi confrontando il profilo di fosforilazione della proteina substrato in uno spettro 2D in presenza dell'ingegno composto inibitoreh spettro emesso da un esperimento di controllo 6.

L'interesse utilizzando la spettroscopia NMR, rispetto alle tecniche di MS più sensibili, risiede nella vasta gamma di applicazioni che sfruttano il protocollo qui descritto, piuttosto che sulla sua capacità analitica solo. Si è dimostrato fondamentale per identificare i siti di fosforilazione di essere in grado di collegare fosforilazioni specifici con modifiche strutturali o funzionali che sono stati principalmente studiati mediante NMR. Spettroscopia NMR di campioni Tau fosforilati permette di esplorare l'impatto strutturale della fosforilazione su entrambe le strutture secondarie locali transitorie e sulla riorganizzazione globale del complesso dinamico modificato Tau 36,37. Aspetti funzionali comprendono la regolazione sia interazione di Tau con partner proteici 7,38,39 e di aggregazione da Tau fosforilazione 8. Il campione Tau fosforilata caratterizzato mediante NMR può essere ulteriormente utilizzato per decifrare le interazioni fosfo-dipendente, perEsempio con 14-3-3 40, e l'interazione proteina-proteina ingegnerizzata inibitori 41,42. NMR permette di definire sito di interazione (s) a livello residuo, della dipendenza di questa interazione sulla fosforilazione. Inoltre, la spettroscopia NMR di fosforilata Tau è una metodologia chiave per caratterizzare il cis prolina: isomerasi Pin1 trans, un importante enzima fosfo-dipendente coinvolto nella regolazione Tau 43-45. Inoltre, l'analisi fosforilazione mediante NMR può essere applicato non solo agli sfollati ma anche alle proteine globulari 46. Infine, altri tipi di Tau PTM, come acetylations 22,40,41 possono essere studiati mediante NMR. I protocolli descritti qui hanno dimostrato fondamentale per capire meglio la regolazione funzionale e strutturale di Tau in condizioni fisiologiche e patologiche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267, (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268, (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16, (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128, (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23, (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291, (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133, (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249, (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343, (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56, (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15, (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5, (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132, (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5, (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5, (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7, (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7, (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18, (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88, (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285, (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54, (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54, (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137, (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8, (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192, (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80, (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23, (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412, (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3, (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29, (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48, (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54, (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43, (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7, (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274, (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16, (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53, (18), 3020-3032 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats