Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Medicine
 

Summary

Quantitativ Metalle in Gewebe durch Laserablation Kartierung - induktiv gekoppelter Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) ist eine empfindliche analytische Technik, die in neue Erkenntnisse liefern kann, wie Metalle in normaler Funktion und Krankheitsprozessen teilzunehmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Metalle in dünnen Schnitten von Mausgewebe neurologischen Bildgebung.

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Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., Knauer, B., Hutchinson, R. W., O'Connor, C., Fryer, F., Hennessey, T. P., Bush, A. I., Crouch, P. J., Doble, P. A. Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (119), e55042, doi:10.3791/55042 (2017).

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Abstract

Metalle sind ubiquitär im gesamten Organismus, mit ihrer biologischen Rolle diktiert durch beide ihre chemische Reaktivität und Fülle innerhalb eines bestimmten anatomischen Region gefunden. Im Gehirn haben Metalle eine hoch compartmentalized Verteilung in Abhängigkeit von der primären Funktion, die sie innerhalb des zentralen Nervensystems spielen. Abbilden der räumlichen Verteilung von Metallen ist vorgesehen einzigartigen Einblick in die biochemische Architektur des Gehirns, die eine direkte Korrelation zwischen neuroanatomischen Regionen und ihre bekannte Funktion im Hinblick auf metallabhängigen Prozessen. Darüber hinaus verfügen einige altersbedingte neurologische Erkrankungen Metall Homöostase gestört, was oft zu kleine Bereiche des Gehirns beschränkt ist, die sonst nur schwer zu analysieren. Hier beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur quantitativen Metalle in der Maus Bildgebung des Gehirns, Laser-Ablation unter Verwendung von - induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) und speziell für die BildverarbeitungSoftware. Die Konzentration auf Eisen, Kupfer und Zink, die im Gehirn drei der am häufigsten vorkommenden und krankheitsrelevanten Metalle sind, beschreiben wir die wesentlichen Schritte bei der Probenvorbereitung, Analyse, quantitative Messungen und Bildverarbeitung zur Herstellung von Karten der Metallverteilung innerhalb des niedrigen Mikrometer Auflösungsbereich. Diese Technik, die für jeden Abschnitt geschnittenen Gewebes der Lage ist, die hoch variable Verteilung der Metalle in einem Organ oder System zeigt, und kann verwendet werden, um die Veränderungen der Metall Homöostase und absolute Ebenen innerhalb feinen anatomischen Strukturen.

Introduction

Die einzigartige Redoxchemie von Metallen erleichtert eine Reihe von neurologischen Funktionen, einschließlich Signaltransduktion, Energieerzeugung und Neurotransmittersynthese. In einer Reihe von wichtigen neurodegenerativen Erkrankungen, dyshomeostasis dieser Metalle sind sowohl als potentielle neue Targets in Pathogenese der Erkrankung und identifiziert impliziert worden für die therapeutische Intervention 1. Um besser zu verstehen, wie Metalle unter Bedingungen beteiligt sind, wie Alzheimer und Parkinson-Krankheit (AD und PD bezeichnet), ist es zwingend notwendig, der Lage sein, zu messen, wie Metallverteilung und Ebenen innerhalb der Regionen ändern negativ beeinflusst durch den Krankheitsprozess. Diese Veränderungen sind oft Anzeichen für subtile Verschiebungen in den biochemischen Reaktionen , die zu den Prozessen verknüpft werden innig kann, die den Zelltod einleiten, wie unsere kürzlich vorgeschlagene Mechanismus der Eisen - und Dopamin - Neurotoxizität in PD 2.

Traditionell metal Ebenen innerhalb der definierten anatomischen Regionen wurde durch eine sorgfältige Exzision, Verdauung und Analyse erreicht 3 eine Reihe von analytischen Techniken. Aber ein solcher Ansatz verliert räumlichen Informationen, die entscheidend sein kann, wenn Krankheitszuständen untersucht beinhalten kleine, gut definierte Bereiche oder spezifischen Zelltypen. Eine Reihe von analytischen Methoden sind für Metalle in biologischen Systemen, von intakten Proben Gewebeschnitten und in zwei und drei Dimensionen unter Verwendung von Emissionsspektroskopie, Fluoreszenzsonden und Massenspektrometrie 4 visualisieren. Jede Technik hat Vorteile und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, Selektivität der chemischen Spezies, und die räumliche Auflösung, die erreicht werden kann. Für einen umfassenden Überblick über die Palette von Techniken zur Verfügung, siehe die Übersicht von Hare et al. 5.

Die Massenspektrometrie (MS) -basierte Methoden der empfindlichste dieser Techniken sind, Lage , die meisten biologisch relevanten Metalle in ihrer nativen Konzentration 6 zu messen. Laser-Ablation - induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) Bildgebung verwendet einen fokussierten UV-Laserstrahl in einer Größe von 1 bis> 100 & mgr; m im Durchmesser (oder Breite, wenn ein Viereck Strahlform verwendet wird), unter denen die Probe 7 bestanden. Quantitative Informationen können über die repräsentative Ablation von Standardreferenzmaterialien erreicht werden, die 8 mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Ansätzen hergestellt werden können, die jeweils mit unterschiedlichem Grad der technischen Schwierigkeiten und analytische Funktionalität. Die am häufigsten verwendete Ansatz verwendet Matrix-Matching, wo ein Standard mit einer vorherrschenden chemischen Zusammensetzung vergleichbar mit der von der Probe durch Spicken mit dem Ziel - Analyten hergestellt wird und für die Homogenität und absolute Metallkonzentration durch unabhängige analytische Mittel genau beurteilt 9, 10. Ablation der zubereiteten Standards können dann für die externe Kalibrierungszwecke verwendet werden, Konzentrationsdaten aus der erhaltenen Probenbildes ermöglicht pro Pixel extrahiert werden.

Die Bildauflösung wird sowohl durch die Strahlgröße und die Geschwindigkeit, mit der die Probe abgetastet wird, bestimmt. Die Standard - Quadrupol-Design ICP-MS (die mehr als 90% aller Systeme ICP-MS installiert Konto weltweit 11) ist eine sequentielle Massenanalysator ist , daß der Massendetektor Zyklen durch alle ausgewählten Masse-Ladungs - Verhältnis (m / z ) und nicht gleichzeitig Daten sammeln. Somit muß die Erfassungszeit für jeden Zyklus der Massen auf die Zeit für die Probe entnommen gleichsetzen eine Breite des Laserstrahls zu durchqueren ein Pixel repräsentativ für die gewünschte Auflösung zu gewährleisten 12 erfasst. Laserstrahlgrößenauswahl ist ein wichtiger Parameter, der auf beide erhebliche Auswirkungen hat Empfindlichkeit und Gesamtanalysezeit. Als physi Laserablationmatisch entfernt Material, das die Menge der Materie der ICP-MS von einem Argonträgergas transportiert wird, die von dem Massenanalysator folgt dem inversen quadratischen Gesetz physikalisch nachgewiesen werden kann. Beispielsweise die Verringerung der Laserstrahldurchmesser von 50 bis 25 & mgr; m führt zu einer Verringerung des abgetragenen Materials um einen Faktor von vier. Zusätzlich als Scanverfahren, erhöhen kleinere Strahldurchmesser die Gesamtzeit, einen ausgewählten Bereich abzutragen erforderlich. Daher ist experimentelles Design unerlässlich, um die notwendige räumliche Auflösung mit Empfindlichkeit Bedürfnisse und Zeitvorgaben zu balancieren.

Imaging von LA-ICP-MS wurde auf eine Reihe von Proben, Matrizen und Krankheitszuständen angewendet, einschließlich Tiermodellen für neurologische Erkrankungen 13, 14, Schädel - Hirn - Verletzung 15, die Verteilung von metallhaltigen Krebsmedikamente 16, toxicant Exposition in der Plazenta 17 und Metall distribution in Zähne als Biomarker der frühen Lebensnahrungsübergänge. 18 In diesem Protokoll beschreiben wir ein allgemeines Verfahren zum Abbilden Eisen, Kupfer und Zink in der WT Mausgehirn bei einer Auflösung von 30 & mgr; m, obwohl es leicht zu einer Reihe von Probentypen und experimentelle Ergebnisse angepasst werden kann, basierend auf den Bedürfnissen des Analytiker.

Protocol

Hier beschriebenen Verfahren wurden von der Howard Florey Tierethikkommission und sich an die National Health und Medical Research Council Standards der Tierpflege genehmigt.

1. Herstellung der Probe zur Analyse

Hinweis: Dieser Schritt hängt von der Probenmatrix in Abhängigkeit analysiert werden.

  1. Probenvorbereitung und Schneiden
    HINWEIS: Die Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und Kryokonservierung in 30% Saccharose in 0,1 M PBS in unterschiedlichen Mengen der Auslaugung von Metallen aus Gewebe führen. Siehe Hare et al 19 für spezifische Details. Stellen Sie sicher, alle Proben identisch Fixierung und Kryokonservierung Schritte durchlaufen.
    1. Transcardial perfuse die eingeschläfert Tier mit eiskaltem 0,1 M PBS, pH 7,4 (siehe den Abschnitt Methoden in Dodt et al. 20 für weitere Details) und das Gehirn zu entfernen.
    2. Legen Sie das Gehirn in 4% PFA O / N, das Gewebe zu reparieren.
    3. <li> Cryoprotect das Gehirn, indem es in 30% Sucrose in 0,1 M PBS für 24 h platziert und dann an die frische Saccharose 30% für weitere 24 Stunden ändern. 19
    4. Einfrieren des Gehirns in einem Kryostaten bei -20 ° C für mindestens 1 h.
    5. Montieren Sie das Gehirn auf einem Spannfutter ein geeignetes Befestigungsmedium.
    6. Abschnitt das Gehirn auf einem Kryostat ein metallfreies Wegwerfklinge (zB Polytetrafluorethylen [PTFE] -beschichteten Messer) und montieren Sie auf einem Standard - Mikroskop - Objektträger verwenden. Die optimale Dicke für den Abschnitt sollte etwa 30 um betragen.
  2. Bei der Verwendung von in Paraffin eingebetteten Proben, Abschnitt an der gewünschten Dicke, schweben die Band auf einem warmen Wasserbad und Montage auf Standard-Objektträger.
    HINWEIS: Precise Auswirkungen einer langfristigen Fixierung und Paraffineinbettung von biologischen Proben sind nicht bekannt. Wie in 1.1 beschrieben wird, müssen alle Proben identisch Probenvorbereitungsverfahren unterzogen wurden, wenn vergleichende Analyse bestimmt.
    1. Dewax paraffin eingebettete Proben durch den Schieber in 3 Änderungen Xylol getaucht, 1 Wechsel jeweils 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und mindestens 3 Änderungen in ISO 3696 oder gleichwertig gereinigtes Wasser (im Folgenden bezeichnet als ' Wasser ', siehe Hare et al 21 für eine detaillierte Methode)..
  3. Werden die Proben an der Luft trocknen für ca. 1 h in einer staubfreien Umgebung, wie ein Dia-Box mit den Mustern befindet, vertikal in Racks und den Deckel links halb offen.

2. Herstellung von Matrix-Standards angepaßt

HINWEIS: Das folgende ist eine zusammengefasste Protokoll zuvor 9 veröffentlicht. Bitte beachten Sie die Original-Papier für detaillierte Schritte zur Herstellung von Matrix abgestimmte Gewebe-Standards.

  1. Erhalten kommerzielle Lamm Gehirne (oder ähnlich) und spülen Sie in Wasser, die Beseitigung aller Blut und Bindegewebe.
  2. Mit einem Skalpell sezieren vorsichtig ca. 50 g kortikalen tissue und homogenisieren teilweise eine Hand Gewebe-Homogenisator mit einer Polycarbonat-Einweg-Sonde auf niedriger Stufe. Teilen Sie sich in 5 g-Proben, wobei die Zahl je nach Kalibrierungsbereich und Anzahl der Kalibrierungspunkte gewünscht.
  3. Bereiten Sie Lösungen von Metallen jeder Standard zur Spitze durch ein lösliches Salz jedes Analyten aufzulösen (zB FeSO 4 · H 2 O) in 1% Salpetersäure zu erzeugen , 0,1, 1 und 100 mg Metall mL -1 Aktien.
  4. Fügen Sie einen vorab berechneten Volumen der Stammlösung auf die 5 g aliquotierten Gewebe (zB 5 & mgr; l von 10 mg mL -1 für eine ungefähre Endkonzentration von 10 ug g -1 nasses Gewebe) eine Reihe von Stachelmetallwerte zu erreichen , in jeder Standard.
    1. In Abhängigkeit von der endgültigen Konzentration von jedem Standard gewünscht wird, verwenden eine Kombination von jedem Metall-Stammlösung, die minimale Menge an Lösungen, um sicherzustellen, werden dem Standard hinzugefügt. Addieren Sie eine abschließende Spitze von Wasser zu jedem Standard-equi, um sicherzustellen,wertigen Volumina hinzugefügt Flüssigkeit ist in jedem Standard vorhanden.
    2. Homogenisieren gespickt Standards auf Low-Power für etwa 30 s. Wenn sie nicht sofort verwendet werden, bei -20 ° C in verschlossenen Polypropylen-Röhrchen mit Parafilm versiegelt gefroren halten.
  5. Bestimmen Sie die genaue Konzentration und Homogenität jeder Standard eine der folgenden Verfahren:
    1. Mikrowellenaufschluss
      1. Platzieren 6 genau gewogen (etwa 50 mg) Aliquots einer Standard in einem Gefäß PTFE Verdau gewaschen und 4 ml konzentrierter (65%) Salpetersäure und 1 ml 30% Wasserstoffperoxid. Versiegeln und zu verdauen bei 500 W für 30 min.
      2. das Aufschlussgefäß, offen in einem Abzug Nach dem Abkühlen und quantitativ die verdaute Lösung einer Säure gewaschen wurden 50 ml-Röhrchen mit 10 ml-Anteile von Wasser übertragen. Bilden auf etwa 50 ml, und genau die Masse der fertigen Lösung wiegen.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1.1 - 2.5.1.2 für jeden Standard.
    2. Verwenden Sie das folgende Verfahren, wenn Mikrowellenaufschluss Ausrüstung nicht verfügbar ist:
      1. Legen Sie sechs genau gemessen (zwischen 25-200 mg) Aliquots von Standard-in mit Säure gewaschenen / metallfrei Polypropylenröhrchen und lyophilisieren O / N.
      2. Werden 40 & mgr; l konzentrierte Salpetersäure und Wärme, nicht begrenzten, auf einem Heizblock auf 70 ° C für 5 min, und fügen Sie dann 10 ul 30% Wasserstoffperoxid. Die Wärme für weitere 5 min und dann genau machen zu 1 ml Gesamtvolumen mit 950 & mgr; l von 1% Salpetersäure.
        Hinweis: Es ist ratsam, ein zertifiziertes Referenzmaterial mit der Methode der Wahl zu verdauen Verdauung Verfahren sind präzise zu gewährleisten.
  6. Bestimmen Sie die Metallkonzentration in jeder Abbaulösung durch Lösung Vernebelung ICP-MS ein Standard-Protokoll. Beurteilen Sie Einheitlichkeit aller Standard durch die relative Standardabweichung zu bestimmen (% RSD) zwischen jedem aliquoten. Stellen Sie sicher,% RSDs fallen alle innerhalb von 15%. Mit Hilfe der gemessenen Masse von each aliquoten, berechnen die genaue Metallkonzentration jedes homogenisierten Gewebe-Standard.
  7. Rückkehr in die homogenisierte Gewebe Standard Packung eine 5 x 5 mm Kunststoff - Einweg - Histologie Form und gefrieren in iso - Pentan in flüssigem Stickstoff abgekühlt. Entfernen Sie den gefrorenen Standardgewebeblock aus der Form und Abschnitt auf einem Kryostat mit der gleichen Dicke wie die Probe.
    Hinweis: Es ist ratsam, eine Reihe von Abschnitten mit unterschiedlichen Dicken für zukünftige Experimente vorzubereiten. Luftgetrocknet Standards kann unbegrenzt in einem luftdichten und staubfreien Behälter aufbewahrt werden.

3. Herstellung von LA-ICP-MS zur Analyse

  1. Ort Standards und der Probe in der Abtragungskammer, um sicherzustellen, dass sie innerhalb der Schärfentiefe der CCD-Kamera an die LA-Einheit angebracht sind. Falls die Abstimmung des Instruments erforderlich ist, gehören ein geeignetes Referenzmaterial (zB NIST 612 Spurenelemente in Glass). Finger ziehen Sie die beiden Schrauben an der Kammertür th abzudichtene Ablationskammer.
  2. In der ICP-MS - Software, wählen Sie öffnen das Argongas Ventil in der "Wartung" oder ähnlich , und stellen Sie den Trägergasstrom auf 1,2 l min -1 im entsprechenden Dialogfeld.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wird Argon als Trägergas verwendet. Mehrere Beispiele verwenden entweder Helium oder ein Gemisch aus Helium und Argon als Trägergas. Siehe Günther und Heinrich 22 für technische Details für die Verwendung von Helium und Argon - Gemische als Aerosol - Trägergase.
  3. In der LA-Software, klicken Sie auf die "Säuberung", um die Zelle mit Argongas für mindestens 30 Minuten zu spülen.
    HINWEIS: Spülzeit kann durch Klicken auf eine "Spülzeit" oder eine ähnliche Schaltfläche geändert werden. Wenn ein Ablationssystem mit einem zweibändige Ablation Zelle, periodisch die Bühne zu jeder Ecke bewegen und diagonal durchqueren, die Zelle so viel Rest sicherzustellen Luft aus der Zelle wie möglich entfernt wird. Dies kann durch die Auswahl der "Heimat Stufen" oder equiv erreicht werdenalent Funktion.
  4. Schalten Sie das ICP-MS von "Plasma auf" klicken und lassen für zwei Stunden zum Aufwärmen, bei dem die Schritte 3,5-4,4 durchgeführt werden kann. Geräteeinstellungen variieren zwischen Herstellern, obwohl ein Beispiel für geeignete LA-ICP-MS Betriebsbedingungen können in Hare et al. 10.
  5. Representative Ablation von Gewebe Standards
    1. Wählen Sie das Linienwerkzeug und zeichnen Sie eine einzige Zeile Ablation etwa 3 mm lang über die Gewebeoberfläche.
    2. Stellen Sie die Parameter wie folgt durch die Linie der Ablation in der Testliste der rechten Maustaste und das Ändern der folgenden: Strahldurchmesser (gegebenenfalls durch den Benutzer ausgewählt, ein 30 um im Quadrat Strahl wird hier verwendet), Scan-Geschwindigkeit (4-mal den Strahldurchmesser pro Sekunde; 120 & mgr; m s -1) und Energiefluss (0,3 -0,5 J cm -2 für Weichgewebe; optimieren bei Bedarf für härtere Matrizen). Bei 30 & mgr; m Gewebedicke der Laserstrahl durchdringen nicht die volle thickness dieses Gewebes, eine mögliche Verunreinigung aus dem Mikroskop Unterstützung zu beseitigen. Normalisieren zu Kohlenstoff 23 kann verwendet werden , um Veränderung in der Menge an Gewebe ablatiert zu korrigieren. Setzen Sie diese Parameter als Standard für jede nachfolgende Zeile durch die Auswahl der 'default' Radio-Button.
    3. Duplizieren Sie diese Zeile sechs Mal von der Anfangszeile der rechten Maustaste auswählen und die Auswahl "duplicate Scans". Stellen Sie sicher , Linien versetzt sind entweder in die x - oder y - Achse durch den Strahldurchmesser. Dies ergibt insgesamt sieben Zeilen pro Standard beabstandet entsprechend dem Strahldurchmesser.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 - 3.5.3 für jeden Standard, die Linie von gleicher Länge zu gewährleisten.
  6. Um den Ablationsbereich über die Probe ziehen, folgen einer der beiden folgenden Methoden:
    HINWEIS: Sicherstellen, dass die gleiche Scanparameter (Strahldurchmesser, Scangeschwindigkeit, Energiefluss) für die Probenleitungen verwendet.
    1. Wenn der LA-System ist ausgestattet mit einemWeitblickfeld, wählen Sie die Zeilenwerkzeug und eine Linie von der linken oberen Ecke der Probe lange genug ziehen die Probe an seiner breitesten Stelle zu decken die gleichen Laserparameter skizzierte in 3,5 verwendet wird. Duplizieren diese Abtastung wie in 3.5.3 mit Linien umrissen beabstandet entsprechend dem Strahldurchmesser so oft wie notwendig, eine vollständige Abdeckung der Probe zu gewährleisten.
    2. Wenn ein weites Feld Ansicht nicht verfügbar ist, bestimmen und die x- und y - Koordinaten aufzeichnen ( in der Regel auf dem Hauptbildschirm als "Bühnenposition 'abgebildet oder ähnlich) an den Ecken eines Rechtecks entspricht , um die gesamte Probe abdeckt. Verwenden Sie diese Koordinaten parallelen Linien der Ablation zu positionieren Bereich für den gesamten Probe, wie in 3.7.1 beschrieben.
    3. Zeichnen von Linien für den intermittierenden Scannen von Standards spätestens nach ~ 20 h Abtasten der Probe durch den Prozess in 3.5 beschrieben zu wiederholen. Abhängig von der Untersuchungsdauer der Probe dieses mehrfach erforderlich. Beenden Sie das Experiment mit einem zusätztionalen Scan der Standards.
      HINWEIS: Wenn die x- und y - Koordinaten zu bestimmen , während die Zelle gespült wird, Ausgangspositionen auswählen und die dazugehörige Kalibrierung der Achse wird der zuvor Besonderheiten während der Unterschied für die x- und y - Koordinaten erfasst ändern (dh die Länge der Linie) wird sein unberührt.

4. Einrichten der Datenerfassung Methoden zur ICP-MS

  1. Für die Standard-Linie der Ablation, teilen Sie die Länge der Leitung durch die Laserscangeschwindigkeit die Gesamtanalysezeit für eine einzelne Zeile zu bestimmen. Wiederholen Sie dies für die Probenleitung.
  2. In der ICP-MS-Software eine neue Methode (hier als "Partie" gezeigt) und stellen Sie sicher, dass "Zeitanalyse aufgelöst" oder gleichwertiger Art ausgewählt ist. Wählen die m / z-Werte erfaßt werden, und dann Einstellen der Integrationszeit für jedes m / z, so dass die Gesamtintegrationszeit für einen Zyklus von 0,25 s entspricht. Klicken Sie auf "Speichern Batch Wie 'und den Namen entsprechend (zB Std1).
    Hinweis: Da die Probe wird der Laserstrahl mit dem Vierfachen des Strahldurchmessers durchlaufen, das ein Datenpunkt stellt sicher für jede Masse 12 auf den Strahldurchmesser äquivalent aufgezeichnet wird. Zum Beispiel mit einem 100 & mgr; m Punktgröße, eine Scangeschwindigkeit von 400 & mgr; m s -1 mit einer Integrationszeit von 0,25 s Bilder mit echten Pixelgrößen produzieren wird. Integrationszeit kann eingestellt werden, die Empfindlichkeit zu verbessern; wenn Integrationszeit auf 0,33 s Scangeschwindigkeit erhöht sollte das Dreifache der Strahldurchmesser verlangsamt werden.
  3. Für Standards, die Analysezeit für jede Zeilen in das entsprechende Feld eingeben, plus weitere 15 s für die Laser-Warm-up und Auswaschzeiten zu berücksichtigen. Geben Sie einen Probelauf Liste (dh die Reihenfolge , in der Scans ausgeführt werden) mit der gleichen Anzahl von Akquisitionen ( in der Regel fortlaufend nummeriert, dh 001, 002, etc.) als die Gesamtzahl der Normzeilen.
  4. Für die Probe, Duplizieren Sie die Methode für die Standards, die von der aktuellen Methode oder Batch mit einem alternativen Dateinamen zu speichern, und stellen Sie die Gesamtaufnahmezeit (einschließlich der zusätzlichen 15 s) und die Gesamtzahl der Akquisitionen die Anzahl der Zeilen zu entsprechen, die die Probe abzutragen wird .
    HINWEIS: Da die meisten LA-ICP-MS-Systeme einen Trigger Einweg verwenden (LA löst ICP-MS), ist es wichtig, dass die ICP-MS-Software den Abzug aus dem LA vor der anschließenden Leitung der Ablation beginnt erwartet. Die ICP-MS Erfassungsfenster wird "Warten auf Start 'lesen.

5. Ausführen des Experiment

  1. Starten Sie die ICP-MS-Warteschlange durch die erste Methode oder Charge zu der Warteschlange hinzufügen und sicherstellen, dass die Software wartet den Trigger aus dem LA-System.
  2. In der Software-LA, aktivieren Sie die Laserstromversorgung durch "Emission", klicken Sie auf "Ausführen" und stellen Sie den Laser Aufwärmzeit auf 10 s und Auswaschung Zeit auf 20 s in die entsprechenden Felder klicken.
    Hinweis: Diese Überschreitung wirdsicherstellen, dass die ICP-MS bereit ist, neue Daten zu starten Erwerb, wenn der Laser jede nachfolgende Zeile der Ablation beginnt.
  3. Starten Sie den Laser-Sequenz von "Start" klicken. Bei Verwendung eines zweibändigen Zelle sicher, dass das Probengefäß in Position ist.

6. Berechnung der Quantifizierung Standards

HINWEIS: Es gibt mehrere Varianten für die Umwandlung von ICP-MS-Daten in Bilder. Dazu gehört die Verwendung von hausgemachten Software - Tools geschrieben in Open-Source - Sprachen 17, 24, 25, kommerzielle Makros 26 und Datenanalyse - Software. 7 Hier nutzen die neu entwickelte Software - Plugin (beschrieben in Paul et al. 27), auf der Basis eines speziellen LA-ICP-MS - Daten - Analyse - Suite 28.

  1. Übertragen Sie alle Batch - Ordner , um die Laufdaten , die (001.d, 002.d usw.) Auf einseparater Computer mit installierter der Analysesoftware. Extrahieren Sie die * .csv-Dateien für jede Zeile der Charge in einen separaten Ordner.
    HINWEIS: Verwenden eines Skripts automatisch übertragen * .csv-Dateien in einen neuen Ordner wird dringend empfohlen. Siehe beigefügte Python-Code für weitere Details. Dieses Skript wurde geschrieben, entweder eine Agilent 7700 oder 8800 Serie ICP-MS zu entsprechen, kann aber bearbeitet werden von anderen Herstellern die Ausgabedatei zu entsprechen.
  2. Öffnen Sie die Software-Plattform und folgen Sie den Registerkarten nacheinander zu importieren und die Standards zu analysieren, um quantitative Bilder zu erzeugen, wie unten beschrieben.
  3. Um die Daten aus dem ersten Standard-Batch zu importieren, wählen Sie "Agilent .csv 'für' Dateityp ',' gesamten Ordner" für "Import-Typ" und prüfen Sie, dass das "Datumsformat" ist identisch mit dem Computer-Format. Klicken Sie auf "Importieren", wählen Sie den Ordner, um die CSV-Dateien für den ersten Satz von Standards enthält, und bewegen Sie auf die Registerkarte "Basislinien".
  4. GrundlinieSubtraktion
    1. Verwenden Sie die 'Automatische Auswahl' Reiter (Befehl 2) aus dem Haupt Dropdown-Menü in der Werkzeugleiste, wählen Sie "Informationen von Import" und klicken Sie auf "Weiter".
    2. Klicken Sie auf "Alle auswählen" und wählen "Baseline_1" für die Integration.
    3. Um die ersten 10 s jeder Abtastzeile wählen (entsprechend dem Laser Aufwärmzeit), die Daten beschneiden , indem der zweite Wert "0" eingeben und "(Dauer der Linie - 10 s)" und klicken Sie auf "Hinzufügen Integrationen" (zB , für eine Abtastlinie s 35, Werte '0' und '25') eingeben.
  5. Um die Beispieldaten auszuwählen, verwenden Sie die "Automatische Auswahl" Tab wie in 6.4 beschrieben, aber wählen "Output_1", wie die Integration. Crop Daten vom Anfang und Ende jeder Standardlinie auszuschließen das Hintergrundsignal (zB für eine 35 s Scan - Linie, geben Sie die Werte '13' und '4').
  6. Um auszuschließen, Tropfen in dem Signal von Mög verursachtble Löcher in den Standards auf der Registerkarte 'Samples', klicken Sie auf 'Channels' auf links oben Diagrammbereich einen Kanal mit einem hohen Signal - Rausch - Verhältnis (zB C13 oder P31) auszuwählen. Notieren Sie scharfen Tropfen in dem Signal und wählen Sie einen CPS-Wert niedrig genug, dass innerhalb der Proben unterhalb der normalen Variante ist, aber hoch genug, um die scharfen Tropfen in dem Signal auszuwählen.
  7. Klicken Sie auf die Registerkarte "DRS" und wählen "Baseline_Subtract" für die "Aktuelle Datenreduktion Scheme". Wählen Sie den Kanal von 6,6 für "Index-Channel 'und der CPS-Wert für" Threshold zu verwenden, wenn niedrige Signale maskieren ". Legen Sie einen Wert von <0,5 s für 'Sekunden vor zu trimmen / nach Low-Signale "für die Verzögerung bei der Signalübertragung zu berücksichtigen, von dem Laser zu dem ICP-MS.
  8. Um eine ausreichende Maskierung der niedrigen Signalbereichen bestätigen, klicken Sie wieder auf die Registerkarte "Samples" und wählen Sie eine verarbeitete (z. B. Fe56_CPS) Kanal Spur. Wiederholen und verfeinern das CPS und & #39; Sekunden zu trimmen vor / nach dem Low-Signale "Werte wie in 6.7, falls erforderlich.
  9. Klicken Sie auf die "Ergebnisse" Registerkarte und wählen "Exportieren von Daten" aus dem Haupt Dropdown-Menü. Geben Sie einen Dateinamen , um eine Tabellendatendatei der Ergebnisse zu erzeugen (zB Std1 Berechnungen, Std2 ...).
  10. Öffnen der Datendatei in einem geeigneten Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen die CPS-Werte für jeden einzelnen Kanal zu quantifiziert werden. In ppm (g g -1) für jeden quantifizierbaren Element Verwenden Sie die vorgegebenen Metallkonzentrationen aus der Lösung Vernebelung ICP-MS den Umrechnungsfaktor von CPS - Werte zu berechnen.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 6,3-6,10 für alle Sätze von Standards in der Flucht.

7. Constructing Quantitative Bilder

  1. Schreiben 'Biolite ()' in der Eingabeaufforderung, um die Software zu öffnen.
  2. Importieren Sie die Beispieldaten durch "Bilder laden" klicken und dann den Ordner mit den CSV-Dateien for das Beispielbild.
  3. Hintergrundkorrektur
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte "Grundlinien" Hintergrundkorrektur für die Probe zu beantragen. Auf der Phosphor (P31) Bild aufgefordert, auf dem Bildschirm, wählen Sie Bereiche des Hintergrunds das Rechteck Ziehwerkzeug. Auswählen von so vielen Regionen wie möglich erzeugt ein Bild weite Karte von Signal / Plasma Drift auf eine angemessene Entschädigung von diesen Störfaktoren gewährleisten.
    2. Um das Hintergrundsignal mehr sichtbar ist, wählen Sie das Diagramm bearbeiten Werkzeug machen (oben auf dem angezeigten Bild links) und rechts klicken Sie auf das Bild. Wählen Sie "Ändern Bilddarstellung" und ändern Sie die erste Farbe bei Z = 'zu einem großen negativen Wert (zB -100.000). Gehen Sie mit "Fertig" klicken.
  4. Klicken Sie auf "Standards" Registerkarte eine Tabelle für CPS / ppm Korrekturfaktoren zu bringen. Eingeben von den Standards in Schritt 6,10 für jedes der Elemente berechneten Werte. Dieser Schritt wird dazu beitragen, für die Empfindlichkeitsdrift in der ICP-MS zu korrigieren. Klicken Sie auf 'Go! '
  5. Open 'Data Browser' aus dem 'Data' Registerkarte, die die Bilder für jedes Element und jeder Schritt hält.
  6. Um ein Bild für den Export abzuschließen, wählen Sie das gewünschte Bild in der 'StdCorrImages' Ordner mit der rechten Maustaste auf den Namen des Bildes (* _ppm) und klicken Sie auf 'NewImage'. Rechtsklicken Sie auf das Bild zu öffnen 'Bilddarstellung ändern "eine gewünschte Farbtabelle und Farbskala zu wählen. Fügen Sie eine Farbskala auf das Bild, um das Bild der rechten Maustaste und Auswahl von "Annotation Hinzufügen". Wählen Sie "Colorscale" von oben links im Dropdown-Menü und verwenden Sie die Registerkarten, um die gewünschte Farbskala zu ändern.
  7. Um ein Bild zu exportieren, stellen Sie sicher, dass das betreffende Bild ausgewählt und auf "Datei" die Registerkarte navigieren und klicken Sie auf "Grafik speichern ... '. Wählen Sie das gewünschte Format und speichern Sie das Bild. Alternativ kann das ausgewählte Bild übertragen werden, um die zum Kopieren und Einfügen-Tools.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 7.6 und 7.7 für alle Bilder von Interesse.
  9. Quantifying diskreten Regionen
    1. Um die ROI-Tools aktivieren, navigieren Sie zu "Analyse" Registerkarte "Pakete" und wählen Sie "Bildverarbeitung".
    2. Wählen Sie das gewünschte Bild und navigieren Sie zu der Registerkarte 'Bild' und klicken Sie auf 'ROI ...'. Klicken Sie auf "Start ROI Draw Poker" und verwenden Sie ein Zeichenwerkzeug einen Bereich von Interesse in der Probe auszuwählen. Zur Zeichnung fertig sind, klicken Sie auf "Fertig stellen ROI '.
    3. Um die Statistiken für den ausgewählten ROI erwerben, navigieren Sie zu Registerkarte 'Bild' und klicken Sie auf "Statistik ... '.
    4. Kopieren und die Ergebnisse in einer separaten Tabelle einfügen. Wiederholen ROI Auswahl (7.9.2) für alle Regionen und Elemente von Interesse.

Representative Results

Um die Möglichkeiten dieser LA-ICP-MS-Bildgebung Ansatz demonstrieren, ein einfaches Experiment, einen Abschnitt eines WT C57BL / 6-Maus Gehirn, halbierten im Corpus callosum und geschnitten in der koronalen Ebene verwendet wird, wird vorgestellt. Ein Workflow für die Analyse von Daten Biolite (Abbildung 1), wie zum Bereitstellen ein repräsentatives Bild von Metallverteilung im Abschnitt analysiert (Abbildung 2) auch in den Abschnitten 6 und 7 als gut beschrieben.

Wie gesehen werden kann, Metallverteilung im Gehirn der Maus ist variabel entsprechend anatomischen Region. Dies kann auf die variable Rollen Metalle zugeschrieben werden, und insbesondere die Proteine , an die sie gebunden sind, 27 in jeder Region des Gehirns spielen. Zum Beispiel neigt Eisen höheren Konzentrationen in der Mittelhirns zu haben und entlang des Gyrus dentatus, während Zink am häufigsten in der Cortical Bereiche. Carbon, die eine häufig verwendete interne Standard - 8 ist, ist homogen verteilt. Elementar Karten (Figur 2) kann besonders nützlich sein , wenn sie in Verbindung mit vorhandenen anatomischen und funktionellen Referenz Atlanten 29 verwendet, wobei Informationen über die Kolokalisation von Metallen kann die Expression spezifischer metallbindenden Proteinen Einblick in die Funktion von Metallen in einem Gehirn liefern kann Region oder Änderungen der Metallebenen im Einklang mit einer krankheitsbedingten Biomolekül identifiziert. Unter Verwendung der Vorgehensweise beschrieben, die für ein breiteres Spektrum von Analyten optimiert ist, hat die Empfindlichkeit für niedrige entgegen Überfluß Elemente wie Mangan, und Verfahren angepasst werden kann, in erster Linie auf dieses Analyten zu konzentrieren, indem auf Kosten der anderen gemessenen Massen Verweilzeiten erhöhen.

Der große Vorteil bei der Verwendung von Imaging-LA-ICP-MS beobachtet relativen Unterschiede in Metall concentration und Verteilung zwischen den Versuchsgruppen. Wir haben früher eine solche Technik zu demonstrieren erhöhten Eisen nach einem Neurotoxin Insult nachahmt PD 2, 10, und Veränderungen in cortical Eisenspiegel in menschlichen Alzheimer-Krankheit Gewebe 21 verwendet. Ein solches Protokoll, wie hier beschrieben werden, können auf andere Gewebetyp mit minimalen Änderungen an den aufgeführten Verfahren leicht angepasst werden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Workflow für die Bildverarbeitung. Workflow-komplementär zu den Abschnitten 6 und 7, der Darstellung Umwandlung von Roh-zeitaufgelöste Daten von der ICP-MS auf quantitative Bilder von Metallverteilung im Gehirn der Maus. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 2
Abbildung 2: Typische Elementverteilung von Biometalle innerhalb eines Mäusegehirns. Repräsentative Element Karten eines 30 um dicken koronalen Abschnitt einer einzelnen Maus Gehirnhemisphäre analysiert mit LA-ICP-MS. Bilder für Kohlenstoff-13 (C13), Magnesium-24 (MG24) und Phosphor-31 (S31) angezeigt in Gold-Farbskalen (Zählungen pro Sekunde; CPS) (obere Reihe). Quantitative Bilder (untere Reihe) für Mangan-55 (MN55), Kupfer-63 (Cu63), Eisen-56 (Fe56) und Zink-66 (Zn66) angezeigt mit entsprechenden BlueHot Farbskalen (ug g -1). Gesamtanalysezeit für das Gehirn Schnitt betrug etwa 5 h. Maßstabsbalken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Bildgebungs Metalle in neurologischem Gewebe ist nur ein Beispiel dafür, wie dieses Protokoll nützliche Informationen über die Verteilung und die Mengen an Metallen in jeder biologischen Matrix zur Verfügung stellen kann. Obwohl Herstellung von Standardreferenzmaterialien beschwerlich sein kann, es ist ein Experiment, das einmal durchgeführt werden kann und für die spätere Verwendung archiviert.

LA-ICP-MS hat bestimmte Vorteile gegenüber alternativen Methoden, wie Synchrotron-Röntgenfluoreszenzmikroskopie, hauptsächlich in Bezug auf Zugänglichkeit und Sensitivität. Es gibt jedoch gewisse Nachteile , die berücksichtigt werden sollten , wenn ein Experiment vorbereitet LA-ICP-MS, und als solche ist sie oft eine nützliche ergänzende Technik zur chemischen Bildgebung , die alternative Metallanalysetechniken umfasst, sowie vergleichende histochemistry 5.

Die Angleichung an den bekannten anatomischen Merkmalen des Mäusegehirns können nützliche Informationen über die mögliche funktionelle relati bietenterschaft zwischen Metallebenen und die räumliche Verteilung. Bisher haben wir die Allen - Gehirn - Atlas Online - Ressource verwendet wird , 29, ist ein Open-Access - Repository beider anatomischen und Genexpressionsdaten in der C57BL / 6 - Maus Gehirn räumliche Korrelation der beiden Metall-abhängige Enzym - Expression 14 und Neuroanatomie 27 zu prüfen, 30. Andere Mittel, wie die Gehirn von Nagetieren Workbench 31 sind auch mit der Registrierung und Ausrichtung von Metallbildern zur Unterstützung in oft kleinen anatomischen Regionen in der korrekten Identifizierung der Metallverteilung zu unterstützen.

Anwendungen dieser Technik sind bei der Beurteilung , wie Metallebenen und Verteilung Wechsel an der mikroskaligen in ganz normale Lebensereignisse (zB Alterung) und bei Krankheitszuständen nützlich; sowie die Untersuchung der Wirkungen der beiden metallhaltigen Verbindungen und Medikamente entwickelt me ​​Zieltal Stoffwechsel. Die aktuellen Hauptbeschränkungen von LA-ICP-MS als Technik-Bildgebung für die Metalldistribution sind Durchsatz und Empfindlichkeit räumlich zu beurteilen. Es gibt einen Kompromiss zwischen der Geschwindigkeit der Analyse und die räumliche Auflösung 5, 12, mit einer höheren Auflösung Bilder längere Analysezeiten erfordern. Die Technik ist gut geeignet, um biologische Elemente bei höheren Konzentrationen, aber Elemente wie Mangan, Kobalt und Selen aufgrund ihrer geringen Abundanz in normalem Gewebe beschränkt sind und / oder Einschränkungen in ihrer Detektion durch herkömmliche ICP-MS. Neue Fortschritte in ICP-MS - Technologie, wie die Einführung von Triple-Quadrupol - Massenanalysatoren, 33 zur gezielten Erfassung schwierig Analyten, wie Selen 32 bei höheren Empfindlichkeiten ermöglichen. Als technologieorientiertes Verfahren, Fortschritte in der Laser- und Massenspektrometrie-Design wird dieses Bildgebungstechnik sehen sich weiter entwickeln, zu erhöhendie Geschwindigkeit der Analyse und der Empfindlichkeit 34.

Acknowledgments

DJH und PAD werden von einem Australian Research Council Linkage Project (LP120200081) mit Agilent Technologies und ESI GmbH Der Beitrag von BK unterstützt von der Ruhr University Research School PLUS, finanziert durch Deutschland Exzellenzinitiative [DFG GSC 98/3] unterstützt wurde. DJH wurde von der Ramaciotti Stiftung teilweise unterstützt. KK wird von der Sigrid Juselius Foundation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soda glass microscope slides n/a n/a Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades C.L. Stuckey DT315R50 Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 16005 Any supplier suitable
Sucrose n/a n/a Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate-buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P5368 Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene Sigma-Aldrich 247624 Any supplier suitable
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Any supplier suitable
Lamb brain n/a n/a Available from most local butchers
Metal salts n/a n/a Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser Omni Inc THP115 Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes Omni Inc TH115-PCRH
Microwave digestion unit n/a n/a Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes TechnoPlas P4010 Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid Merk Millipore 100441 Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 95321 Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds Ted Pella 27181
Isopentane Sigma-Aldrich 76871
Liquid nitrogen n/a n/a Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system ESI Ltd n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS Agilent Technologies n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite Iolite Software n/a Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel Microsoft n/a
IGOR Pro Wave Metrics n/a Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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