השתלת עור בעובי מלא Murine

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

השתלת עור בעובי מלאת Murine היא מודל ומבוסס ללמוד דחייה בסביבת alloimmune. כאן, אנו מספקים הדרכה של כל שלב המעורב בביצוע BALB / ג - השתלת עור> C57BL / 6 בעובי מלא.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cheng, C. H., Lee, C. F., Fryer, M., Furtmüller, G. J., Oh, B., Powell, J. D., Brandacher, G. Murine Full-thickness Skin Transplantation. J. Vis. Exp. (119), e55105, doi:10.3791/55105 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

השתלת עור בעובי מלאת Murine היא מודל in vivo ומבוסס ללמוד alloimmune תגובת דחיית שתל. למרות היישום המוגבל שלה לבני אדם, השתלת עור בעכברים הועסקה נרחבת למחקר השתלה. הנוהל הוא קל ללמוד ולבצע, וזה אינו דורש טכניקות מייקרו עדינות ולא הכשרה מקיפה. יתר על כן, דחיית שתל במודל זה מתרחשת תגובה אימונולוגית מאוד לשחזור מנוטר בקלות על ידי בדיקה ישירה ומישוש. בנוסף, השתלת עור משני עם שתלים בהתאמה או צד שליש עור יכולה להתבצע על מודלי השתלה מורכבים יותר כמו שיטה חלופית ולא מסובכת להעריך סובלנות תורם ספציפי. הסיבוכים נמוכים והם בכלל מוגבלים יתר הרדמה או מצוקה נשימתית לאחר ההליך. לכישלון השתל, מצד שני, בדרך כלל מתרחשת כתוצאה הכנה לקויה של גרמיצוב ומאחור, שגוי במיטת השתל, או מיקום לא ראוי של התחבושת. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת עור בעובי מלא בעכברים ולתאר הצעדים החשובים דרושי הליך מוצלח.

Introduction

השתלת איברים היא טיפול הבחירה בחולים עם כשל איברים סופנית, ותוצאות השתפרו פלאים עם ההתקדמות ניתוחים ופרוטוקולים דיכוי חיסוני. עם זאת, דיכוי מערכת חיסוני לטווח ארוך קשור לתופעות לוואי משמעותיות, לבין ההתפתחות של אסטרטגיות חדשות המקדמות סובלנות נשארת מטרת מחקר השתלה המודרנית.

במודלים של בעלי חיים רבים פותחו למחקר בסיסי בהשתלות, כדי לחקור את המנגנונים של דחייה של השתל וכדי לבחון גישות דיכוי חיסוני למניעת דחיית שתל ו לקידום סובלנות לטווח ארוך 1-3. מודלי העכבר הפכו התווך של מחקר האימונולוגי בשל הזמינויות הבלעדיות מכריעות של נוגדני אבחון וטיפול ומוגדרים היטב זנים טהורים ו מהונדסים. השתלת עור היא הליך פשוט שאינו דורש מיומנויות microsurgical מיוחדות והוא יכולבקלות להיות במעקב אחרי הניתוח. יחדיו, השתלת עור העכבר כבר כלי יוצא דופן ללמוד היבטים רבים המעורבים בתגובה alloimmune, כולל משלוח אנטיגן, סחר התא, והרס רקמות במהלך דחיית שתל 4,5.

כאן, אנו מציגים את הצעד-אחר-צעד הליך השתלת עור בעובי מלא תוך שימוש במודל העכבר, אנו מתארים את הצעדים החשובים הכרחיים עבור engraftment מוצלח של העור המושתל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ושימוש (JHUACUC). הנהלים הספציפיים בוצעו תחת MO13M292 פרוטוקולי ACUC המאושרות MO13M370.

קציר עור תורם 1.

  1. להרדים את העכבר התורם עם isoflurane (מאדה אינדוקציה ב 4% אחזקה ל 1 - 2% דרך חרוט העכבר). השתמש רפלקס נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על עומק ההרדמה.
  2. באמצעות מכונת גילוח חשמלית, לגלח את הגב של החיה ולחטא אותו ביוד povidone 10% (למשל, בבטאדין).
  3. בעזרת מספרי סטריליות, כפפות, וטכניקה ספטית, עור בחזרה תורם קציר ממותן עד הצוואר, עם דיסקציה קהה ברמה של רקמת חיבור areolar.
  4. להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר קצירתשתל עור.
  5. תחת מיקרוסקופ, להפריד את רקמת חיבור, רקמת שומן, מִרפָּד carnosus מהעור בחזרה באמצעות מספרי tenotomy בסדר. Carnosus מִרפָּד הוא שריר דק, שקוף אחראי תנועות מתעוות עור.
  6. באמצעות טכניקה בכלים סטריליים, לגזור שתלי 15 מ"מ x 15 מ"מ מהעור בחזרה במשך 10 מ"מ 10 מ"מ x 15 מ"מ x המיטה שתל 15 מ"מ.
  7. אחסן את השתלים על gauzes ספוגה פוספט שנאגר המלוח סטרילית (PBS) בצלחת פטרי על קרח.
    הערה: 8 - 10 שתלים ניתן להשיג עכבר תורם אחד.

השתלת 2. נמען עור

  1. להרדים את העכבר הנמען עם isoflurane (מאדה אינדוקציה ב 4% אחזקה ל 1 - 2% דרך חרוט העכבר). השתמש רפלקס נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על עומק ההרדמה.
  2. נהל 0.02 מ"ג / ק"ג BW של עצירות להקלה על הכאב לאחר הניתוח.
  3. לגלח את הצד של החלק האחורי של החיה שבו wi שתלll להיות מוכנס ולחטא עם יוד povidone 10%.
  4. בעזרת מספריים, לחתוך 10 מ"מ x 10 מ"מ עד 15 מ"מ x 15 מ"מ מרובע של העור. גודל הפגם צריך להיות מעט גדול (10%) מאשר את השתל. גזור באופן שטחי ככל האפשר. תשמור על עצמך כדי לשמר את מִרפָּד carnosus וכלי. Carnosus מִרפָּד ניתן להבחין מן fascia הבסיסית על ידי הניידות שלה ואת כלי הדם שמופעלים שטחי אליו.
  5. מקם את השתל על מיטת השתל, הימנעות קפלים בשולים.
  6. מניח 8 תפרים על הפינות על האמצע של כל קצה. עבור כל תפר, להעביר את המחט דרך השתל ולאחר מכן דרך carnosus מִרפָּד של השתל למיטה מתחת לעור הנמען שמסביב.
  7. הסר את מסכת ההרדמה ולתת החיה להתאושש חלקית מן ההרדמה לפני החלת פלסטר.
  8. עוטף את עכבר נמען תחבושת דבקה עם גזה מקופלת על השתל. הפוך את התחבושת על ידי שילוב של שתי תחבושות, חיתוךהחלק הדבק של אחד והעמיד יחד שתי רפידות סופגות.
  9. צג את העכבר מקרוב במהלך שחזור כדי להבטיח את התחבושת אינה הגבלת טיול חזה ונושמת. הסר את התחבושת אם קצב הנשימה פוחת או החיה מתחילה להשתנק או נשימה שטחית.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. נהל Enrofloxacin 5 מ"ג / ק"ג לאחר ניתוח טיפול מונע זיהום.
  2. מניח את העכבר המושתל בתוך כלוב נקי מעל כרית חימום במיקרוגל עד שהוא מתאושש לחלוטין מן ההרדמה.
  3. שים את העכבר עבור שעה 1 לאחר ניתוח לפני החזרת אותו למוקד הדיור.
  4. שבעה ימים לאחר הניתוח, להרדים את העכבר כמו בשלב 2.1. הסר את התחבושת על ידי חיתוך רק דרך צד הגחון של התחבושת.
  5. להתבונן למשש את השתל למחרת סימנים של scabbing, התכווצות, או קשיות. אם הווה, את השתל אולי לא נחל vasculariza הנאהtion וצריך להיחשב כשל טכני.
  6. צג יום סימנים של דחייה. שקול שתלי דחה כאשר ≥90% של רקמת שתל הופך נמקי.
  7. להרדים את החיות דחו ולקצור אותם לניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המיקום של התחבושת על עכבר הנמען הוא צעד חשוב של ההליך. שתל עור ממוקם על גזע הנמען, בין הכתף, הירך ועמוד השדרה (איור 1). התחבושת הוא עשה עם גזה מקופלת ושילוב של שתי תחבושות דבקות פלסטיק. עכבר הנמען מושם עם השתל למטה על הגזה על המרכז את התחבושת. שימוש בשני מלקחי מייקרו מעוקלים, בקצה התחתון של התחבושת הוא המשך ראשון, ולאחר מכן את החלק העליון של התחבושת הוא עטוף על העכבר כדי בבטן.

במודלי התאמה מלאים, שתל עור בעובי מלא בדרך כלל נדחים 8 עד 12 ימים. במודלי התאמת קטין, תגובות דחייה הם איטיות, יותר משתנה, ואת המראה שתל עור מאופיין שינויים בולטים פחות, כגון התכווצות או אובדן השיער (איור 2). סוגי דחיית שתל חריףlly מתחיל עם נפיחות אודם של השתל. אירועים אלה ואחריו התייבשות השתל, הצטמקות, היווצרות גלד (תרשים 2B ו- C). בהתאם למידת חוסר התאמה MHC ופרוטוקול דיכוי חיסוני, דחייה יכולה להתרחש על ידי תהליך subacute, בסימן שינויים עדינים כגון נשירת שיער, פיגמנטציה, רכסים עורי, ונפח השתל. במקרים אלה, שתל דחה נראה מבריק, לבן, וחסר שיער, עם קצוות אחידים (איור 2F) 14.

ניצול מודל זה של השתלת עור, חקרנו גישה חדשנית מיקוד מטבוליזם תאי T כדי למנוע את דחיית השתל 15. עובדה ידועה היא כי מסלולי איתות מטבולית תפקיד קריטי להכתיב את התוצאות של תגובות תאי T 16. תאי T נאיביים להסתמך על זירחון חמצוני המיטוכונדריה לייצר את האנרגיה דרושה עבור מעקב חיסוני בסיסי. למרות זאת,באקטיבציה, תאי T מפעיל לתכנת מחדש מבחינה מטבולית הגליקוליזה האירובית ולהציג גלוטמין הגדילה מטבוליזם 16,17. באמצעות Balb / c כתורמות והן C57BL / 6 כמקבל, צפינו כי עיכוב הגליקוליזה זרחון חמצוני (2DG + מטפורמין) או גלוטמין מטבוליזם לבד (דון) ממושך הישרדות שתל עור, אבל חוסם שלושת המסלולים בעת ובעונה אחת הביאה שתל משמעותית-מוגברת הישרדות (איור 3 ג). יתר על כן, טיפול מטבולים משולש היה יעיל יותר ציקלוספורין קונבנציונלי או rapamycin (איור 3 א 'וב'). קבלה קבועה לא הושגה, ועל אסטרטגיות נוספות, כולל טיפול האזילה, מצור costimulation, או טיפולים מטבוליים חדשים, עשוי לקדם אינדוקציה טובה יותר של סובלנות להשתלה. עם זאת, המחקר סיפק שתי תובנות הרומן: השימוש מעכבי שאינו ספציפי למקד תאים חיסוניים סלקטיבית עם דרישות מטבוליות מוגברת, כמו גם את הדרישה t o לחסום את שלושת המסלולים המטבוליים זמנית להשיג דיכוי חיסוני חזקים יותר דחיית שתל.

מעכבי calcineurin ויעד יונקים של rapamycin (mTOR) inhibitors מהווים רוב בתרופות לדיכוי מערכת חיסון הקונבנציונליות המשמשות השתלה קלינית. שיעורי הישרדות שתל חציון Balb / c כדי C57BL / 6 השתלות עור שטופלו ציקלוספורין ו rapamycin היו 17 ו -16 ימים, בהתאמה. לשם השוואה, מקבלים שטופלו במעכבי מטבולית מעכבות הגליקוליזה תא T, זרחון חמצוני המיטוכונדריה, וחילוף חומרי גלוטמין היה הישרדות ממושכת: להישרדות שתל החציוני הייתה 29 ימים. יתר על כן, היסטולוגיה של שתלי עור מקבוצת הטיפול מהטבולים הציגה יישור רקמות שלם יותר ופחות חודר לתוך דלקתי לימפוציטית (איור 4).

105 / 55105fig1.jpg "/>
איור 1: כיסוי של השתל עם התחבושת. (א) שתל עור דגש על המטען הנכון. (ב) תחבושת עשתה עם גזה מקופלת ושתי תחבושות רצועות פלסטיק. (C) עכבר נמען מושם על הגזה. (DF) תחבושת כרוכה סביב העכבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מראה שתל עור במהלך חריפה דחייה כרונית. (א) Balb / c כדי C57BL / 6 (התאמה מלאה) השתלת עור בעובי מלא ללא עדות דחייה (יום 8). (ב) Balb / c כדי C57BL / 6 השתלת עור בעובי מלא עם דחיית שתל 50% (יום 13). (C) Balb / c כדי C57BL / 6 השתלת עור בעובי מלא עם דחיית שתל מלאה (יום 18). (ד) השתלת עור בעובי מלא syngeneic (יום 8). (E) syngeneic בעובי מלא השתלת עור (יום 30). (F) C57BL / 10 עד C57BL / 6 (חוסר התאמה קטין) השתלת עור בעובי מלא עם דחיית שתל כרונית (יום 100). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: Balb / c כדי C57BL / 6 Skin Graft הישרדות. (א) טיפול עם ציקלוספורין (25 מ"ג / ק"ג QD). (ב) טיפול עם rapamycin (3 מ"ג / ק"ג QD). (C) טיפול במעכבי מטבולית, 2-Deoxy-D- גלוקוז (2DG) 500מ"ג / ק"ג QD, מטפורמין 150 מ"ג / ק"ג QD, ו -6 Diazo-5-אוקסו-L-norleucine (דון) 1.6 מ"ג / ק"ג QOD. כל הטיפולים ניתנו מיום ההשתלה עד דחייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: Hematoxylin ו Eosin הכתם (מימין, X100; עזבו, X200) של העור שתלי עם תרפיה מטבולית בבית לאחר הניתוח יום 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאז השקתו ידי מךוואר, ראשון במחקרים בבני אדם ולאחר מכן בארנבות ועכברים, השתלת עור כבר מודל יסולא בפז לחקר תגובות חיסוניות אלוגנאית 6,7. בכתב היד הזה, אנו מציגים מודל של בקנה מידה גדול, הלא vascularized, השתלת עור בעובי מלא באמצעות העור הגב העליון והתחתון. שיטות חלופיות שונות, לרבות באמצעות עור הזנב או עור אוזן של העכבר כמקור רקמות השתל, דווחו עד היום 8,9. מודלים אלה מרחיבים את היתרון הברור של פשטות טכנית ולאפשר העברת נתונים גבוהים כרכים. המחסור היחסי של תאי אפידרמיס לנגרהנס ותאי דנדריטיים עורי שתלי עור זנב, לעומת זאת, מוביל לדחייה מאוחרת וכן קבלת שתל בהנחייתם של המארח, במיוחד במודלי התאמת קטין MHC 10,11. לכן, השתלת עור גזע בעובי מלאת נחשבת מודל חזק יותר ויותר מתאים ללמוד תאי T-מדיהטד חריף דחייה 12.

בנוסף, המודל שלנו מעסיק טכניקות פשוטות ואינו דורש מיומנויות microsurgical מתקדמות. זמן הפעולה הוא קצר (~ 10 דקות לכל עכבר מתחילת ההרדמה להשלמת ההליך), ואת התחלואה והתמותה לאחר הניתוח היא אפסיות. התמותה הפעילה הכולל (המוות תוך 24 שעות לאחר ניתוח בתוספת למוות לפני הסרת התחבושת) דווחה להיות 3.8% 13. רוב הסיבוכים נובעים יתר הרדמה או תחבושות-מגביל מדי, אשר ניתן למנוע בקלות על ידי מעקב צמוד של תפקודי נשימה במהלך בתקופה שלאחר הניתוח מיידית על ידי הסרה מהירה של תחבושת על הסימנים המוקדמים של מצוקה נשימתית 6,17.

הגורם הקריטי ביותר בתהליך של engraftment הוא וסקולריזציה של רקמת שתל ידי ingrowth כלי לארח את השתל 6. העור שנקטף דורשזה הכנה קפדנית, ואת דיסקציה של carnosus מִרפָּד היא שלב קריטי. אנחנו מעדיפים להסיר את carnosus מִרפָּד תחת מיקרוסקופ. מומלץ להתחיל את הנתיחה מאחד הקצוות ולקדם לאט על ידי לחיצה על השריר ומפריד בינה לבין העור עם הלהב של tenotomy מעוקל בזווית מעט. האתר של מיטת השתל צריך להיות רחוק המפרקים ועמוד השדרה. לפני ביצוע חתכים לתוך עכבר הנמען, כתף הירך צריך להתרגש לדמיין את קפלי העור המסייעים לסמן את רמת המפרקים. בעת הסרת העור הנמען, חשוב כדי למנוע נזק לכלי הדם שמופעלים שטחית אל carnosus מִרפָּד. אם דימום מתרחש, להחיל דחיסה מקומית ולהסיר דם וקרישים שעשויים להפריע engraftment. לבסוף, את התחבושת לא אמורה לגרום קשיי נשימה כי התאוששות מפגיעה, למרות שזה חייב להיות constrictive מספיק כדי למנוע תזוזה של השתל לרכב mutilation במהלך תהליך של רה-וסקולריזציה. רצועות פלסטיק פלסטרים הם חסידים וחזקים מספיק למטרה זו. אנו משלבים שתי תחבושות לעטוף את מותני העכבר לחלוטין ולאפשר ההכנסה של גזה מקופלת בין תחבושת השתל (איור 1). התחבושת תוסר על ידי חיתוך בצד הגחון של זה, וכל השאר הוא הוסר על ידי החיה, על מנת למנוע שיבוש השתל בעת שניסה להסיר את התחבושת באופן ידני.

לסיכום, השתלת עור בעובי מלאה היא מודל ומבוסס עם אזכור בשפע בספרות. הנוהל הוא קל לביצוע, זמן הפעולה הוא קצר, ואת הסיבוכים לאחר הניתוח מוגבלים. השלבים הקריטיים קשורים קציר עור תורם מוקפד ואת המיקום הנכון של תחבושת הנמען. מחקרים עתידיים המעורבים biomaterials המקדם אנגיוגנזה ותיקון רקמות עשויים לשפר את שיעור ההצלחה של ההליך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק R01AI077610.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight micro forceps Sigma F4017
Curved micro forceps Aesculap BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors Aesculap BC905R
Mayo dissecting scissors Sigma S3146
Micro needle holder Aesculap BM563R
Sterile gauze Covidien 441218
6-0 Nylon suture MWI 31849
Plastic Strips Band-Aid Johnson & Johnson Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish Fisherbrand FB0875712
PBS Quality Biological 119069131
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin Bayer Health Care 186599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. (2016).
  2. Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. (2016).
  3. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. e50753 (2014).
  4. Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
  5. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
  6. Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
  7. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
  8. Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. (2008).
  9. Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. e51724 (2014).
  10. Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
  11. Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
  12. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
  13. Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
  14. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
  15. Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
  16. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
  17. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics