10,395 Views
•
07:39 min
•
July 19, 2019
DOI:
Transcript
Automatically generated
השתלת התימוס היא שיטה חשובה לחקירת תפקוד תאי האפיתל של התימוס והתבגרות תאי T ב- vivo. פרוטוקול פשוט ויעיל זה יכול לשמש כדי לבודד ולתרבת עכבר 18.5 התימוס להשתלה לאחר מכן לתוך כמוסה כליות. ניתן לשנות את הפרוטוקול להשתלת התימוס 18.5 להשתלה תימית בשלבים התפתחותיים אחרים או לרקמות אחרות בגודל דומה.
כמו כן, הליך זה הוא פשוט מאוד. הפרטים עבור חלק חותמות המקרה יש לסקור בזהירות בעת ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה. הליך זה מכיל מניפולציות מפורטות שניתן להמחיש טוב יותר באמצעות פריט חזותי.
לאחר ההקרבה, יש לנגב את העכבר העוברי 18.5 בהריון עם 70% אתנול ולהשתמש בכלים מעוקרים אוטוקלאבים כדי לבצע חתך בצורת V על הבטן משלפוחית השתן עד לכל קרן של הרחם. השתמש במספריים כדי לחתוך את mesometrium ואת אזורי צוואר הרחם והנרתיק לקצור את הרחם לתוך צלחת פטרי המכיל PBS קר על קרח. חותכים את קיר הרחם האחורי מקרן רחם אחת לאחרת כדי לחשוף את העוברים בתוך העוטף לדציבואה ולהשתמש פינצטה בסדר לקלף בחזרה את הרקמות המשיעיות.
חותכים את חבל הטבור כדי לשחרר את העוברים להעברה לצלחת פטרי חדשה על קרח. כדי לקצור את התימוס הראשון, יש לנגב עובר אחד ב-70% אלכוהול ולהעביר את העובר לצלחת פטרי חדשה. לאחר עריפת הראש, לתקן את העובר בצלחת בתמונת supine ולהשתמש מספריים סטריליים לחתוך את קיר החזה לצד השני אופקית לאורך החלק הקדמי של בית שימוש.
חותכים את הסרעפת כדי לפתוח את החזה. התימוס צריך להיות גלוי כשתי אונות לבנות הממוקמות מול קנה הנשימה וצמוד ללב. מכניסים בזהירות מעצורי קצה מכופפים מאחורי התימוס ומושך בעדינות כדי לקצור את הרקמה.
בדוק את שלמות התימוס כדי לאשר שהוא מכיל שתי אונות משותפות. לאחר מכן לשטוף את התימוס עם PBS לפני השימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי לקצץ את רקמות החיבור וכלי הדם. כאשר כל thymi נאספו, להעביר כל רקמה נקייה לתוך בארות בודדות של צלחת 24 גם המכיל 500 microliters של תרבות בינונית לגם.
ולהוסיף 2’deoxygranosine לריכוז סופי של 1.25 מילימולר לגם. ואז למקם את thymi מבודד ב החממה תרבות התא במשך שמונה ימים. ביום האחרון של התרבות, להשתמש במספריים לחתוך מחט וריד הקרקפת על החלק צינור עירוי בזווית של 45 מעלות ולאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל חיים נמען עירום.
מניחים את העכבר על שולחן הניתוחים בתצב יד ימין ולהשתמש 0.5% povidone יוד ספוגית כדי לנגב את העור באזור הניתוחי פעמיים מבפנים אל החלק החיצוני של הגוף. השתמש באזמל כדי להפוך חתך עור חמישה עד תשעה מילימטר במקביל לעמוד השדרה באזור הכליות השמאלי לחתוך דרך הרקמה התת עורית והשריר כדי לפתוח את חלל הבטן. באמצעות זוג פינצטה ביד אחת, להרים את השריר ואת רקמת השומן מקצה החתך בצד עמוד השדרה של הכליה החשופה ולהשתמש ביד השנייה כדי לסחוט בעדינות את הכליה.
כדי לשמור על קפסולת הכליות לחה במהלך הניתוח, להרטיב את פני השטח של הכליה עם מלוחים ולהשתמש במחט הקרקפת כדי לגרד בעדינות את קפסולת הכליות בצד הימני התחתון על 1/2 כדי 2/3 רוחב הכליה. מחליקים את צינור העירוי לתוך ניק הקפסולה ומנתקים בעדינות את קפסולת הכליות מהכליה לאורך הצד הארוך של הכליה כשלושה עד ארבעה מילימטרים לתוך כמוסת הכליה. ואז לסגת צינור עירוי.
כדי להשתיל את התימוס בחלל התת-שרירי שנוצר, לשטוף פעמיים תימוס תרבות אחת מלוחים טריים ולחבר את צינור עירוי קצוץ למזרק. לאט לאט שאפו את התימוס המוכן לתוך צינור העירוי המתוקן. ומכניסים בעדינות את צינור העירוי לתוך קפסולת הכליה עד שהוא מגיע לקוטב המעולה.
כדי להעביר את התימוס לתוך כמוסת הכליה, לסגת הצינור לאט תוך כדי מדכא בעדינות את הבוכנה. באמצעות מנורת אלכוהול, מעט לחמם את מחט הקרקפת ולאחר אישור כי התימוס כולו נמצא בתוך החלל subcapsular, להשתמש במחט מחוממת כדי לצרוב את ניק. מחזירים את הכליה הנצרבת לחלל הבטן וסגרו את הלידונום והשרירים בתפרים.
באמצעות תפר מזרן אנכי מופרע שונה, לסגור את חתך העור עם לפחות שלושה קשרים ולהשתמש ספוגית יוד povidone כדי לחטא את החתך. לאחר מכן לספק זריקה תת עורית של אנטיביוטיקה משככי כאבים ולמקום את העכבר תחת מנורת אינפרא אדום עם ניטור עד החלמה מלאה. כאן, יום עוברי מבודד 18.5 התימוס המכיל שתי אונות שלמות ניתן לראות.
מיד לאחר ההשתלה, ניתן לדמיין את התימוס מתחת לקפסולת הכליה בקצה הכליה המטופלת. לאחר שמונה שבועות של צמיחה בתוך החיה מקבל עכבר עירום, התימוס נשאר מתחת לקפסולה, אבל גדל חזק בגודל. תאי T מיוצרים הן התימוס המושתל והן הדם ההיקפי של מקבלי עכבר עירום.
אבל כצפוי, לא מתגלים תאי T בציוד ההיקפי של חיות עירום שאינן מושתלות. יתר על כן, בניסוי מייצג זה, לא זוהה גן LacZ בתאי T ההיקפיים שנקטפו מהדם ההיקפי של מקבלי עכבר עירום שהושתלו באונות התימוס המכילות את אלל LacZ, מה שמצביע על כך שתאי T היקפיים נוצרו מבעלי החיים המקבלים. היו עדינים כשהם מחליקים את הצינור לתוך קפסולת כליות.
הימנע לשבור את הקפסולה. ותוודא שיש לך מספיק מקום למשלוח התימוס. ניתן לנתח אוכלוסיות תאי T תימיים או היקפיים באמצעות ציטומטר זרימה.
איפה, תגובות חיסוניות ברקמות ההיקפיות של המטופל ניתן לנתח על ידי I2D ואת הניתוח ההיסטוכימי החיסון.
Summary
Automatically generated
אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 '-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.
Read Article
Cite this Article
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).
Copy