Murino Transplante de pele de espessura total

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

transplante de pele de espessura total murino é um modelo bem estabelecido para estudar a rejeição em um ambiente alloimmune. Aqui, nós fornecemos um tutorial de cada etapa envolvida na realização de um / c BALB -> C57BL / 6 transplante de pele de espessura total.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cheng, C. H., Lee, C. F., Fryer, M., Furtmüller, G. J., Oh, B., Powell, J. D., Brandacher, G. Murine Full-thickness Skin Transplantation. J. Vis. Exp. (119), e55105, doi:10.3791/55105 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

O transplante de pele de espessura total de murino é um modelo bem estabelecido para o estudo in vivo de resposta aloimune e rejeição de enxerto. Apesar da sua aplicação limitada a seres humanos, o transplante de pele em ratinhos tem sido amplamente utilizada para a pesquisa em transplantes. O procedimento é fácil de aprender e executar, e não requer técnicas de microcirurgia delicada, nem treinamento extensivo. Além disso, a rejeição do enxerto neste modelo ocorre em uma reacção imunológica muito reprodutível e é facilmente monitorizado por inspecção e palpação directa. Além disso, o transplante de pele secundário combinados com enxertos de pele de doadores ou de terceiros pode ser realizada em modelos de transplante mais complexos como um método alternativo e simples para avaliar a tolerância específica do dador. As complicações são baixos e são, em geral, limitado a uma overdose de anestesia ou angústia respiratória após o procedimento. falha do enxerto, por outro lado, ocorre geralmente como um resultado da má preparação da Grpopa, posicionamento incorreto no leito do enxerto, ou posicionamento inadequado de o curativo. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o transplante de pele de espessura total em ratos e descrever os passos importantes necessários para o sucesso do procedimento.

Introduction

O transplante de órgãos é o tratamento de escolha para pacientes com casos de insuficiência terminal de órgãos, e os resultados têm melhorado notavelmente com os avanços em procedimentos cirúrgicos e protocolos de imunossupressão. No entanto, a imunossupressão a longo prazo está associada a efeitos colaterais significativos, e o desenvolvimento de novas estratégias que promovem a tolerância continua a ser o objectivo da investigação moderna transplante.

Numerosos modelos animais têm sido desenvolvidos para a pesquisa básica em transplante, para estudar os mecanismos da rejeição do enxerto e para testar se aproxima de imunossupressão para a prevenção da rejeição de enxertos e para promover a tolerância a longo prazo 1-3. mouse modelos tornaram-se o esteio da pesquisa imunológica devido à disponibilidade exclusiva e vasta de anticorpos diagnósticos e terapêuticos e estirpes puras e transgênicas bem definidas. transplante de pele é um procedimento simples que não requer habilidades especiais de microcirurgia e podeser facilmente monitorizado no pós-operatório. Tomados em conjunto, o transplante de pele de ratinho tem sido uma ferramenta excepcional para estudar muitos aspectos envolvidos na resposta aloimune, incluindo a entrega de antigénio, o tráfico de células, e a destruição do tecido durante a rejeição de enxerto de 4,5.

Aqui, mostramos o procedimento passo-a-passo para o transplante de pele de espessura total utilizando o modelo de rato, e descrevemos as etapas importantes necessárias para um enxerto bem-sucedida da pele transplantada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M292 protocolos ACUC aprovado e MO13M370.

1. Donor Colheita da pele

  1. Anestesiar o rato doador com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia.
  2. Usando uma máquina de barbear, a barba do dorso do animal e desinfecção com 10% de iodo de povidona (por exemplo, Betadine).
  3. Com uma tesoura estéril, luvas e técnica asséptica, colheita doador de pele de volta a partir do quadril para o pescoço, com dissecção romba ao nível do tecido conjuntivo areolar.
  4. Eutanásia do animal por deslocamento cervical após a colheita daenxerto de pele.
  5. Sob um microscópio, separar o tecido conjuntivo, tecido adiposo, e panículo carnoso da pele do dorso utilizando tesouras finas Tenotomia. O panículo carnoso é um músculo fino e transparente responsáveis ​​por movimentos espasmos pele.
  6. Utilizando uma técnica estéril instrumentos, cortar enxertos de 15 mm x 15 mm a partir da pele de volta para uma de 10 mm x 10 mm para a cama enxerto de 15 mm x 15 mm.
  7. Armazenar os enxertos em gazes impregnadas com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) numa placa de petri em gelo.
    NOTA: 8 - 10 enxertos pode ser obtido a partir de um rato dador.

Transplante de pele 2. Destinatário

  1. Anestesiar o mouse destinatário com isoflurano (vaporizador de indução a 4%, manutenção a 1 - 2% através do cone mouse). Use o dedo retirada pitada reflexo para monitorizar a profundidade de anestesia.
  2. Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para o alívio da dor pós-operatória.
  3. Raspar o lado das costas do animal, onde o wi enxertoll ser inserido e desinfectar com 10% de iodopovidona.
  4. Com uma tesoura, corte de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm quadrado de pele. O tamanho de defeito deve ser ligeiramente maior (10%) do que o enxerto. Corte o mais superficialmente possível. Tome cuidado para preservar o panículo carnoso e vasos. O panículo carnoso pode ser distinguida da fáscia subjacente por sua mobilidade e os vasos sanguíneos superficiais que executam a ele.
  5. Posicionar o enxerto no leito de enxerto, evitando dobras ao longo das bordas.
  6. Coloque 8 suturas nos cantos e no meio de cada borda. Para cada fio de sutura, a agulha passar através do enxerto e, em seguida, através do panículo carnoso do enxerto de leito inferior a pele circundante destinatário.
  7. Retire a máscara de anestésico e deixar o animal recuperar parcialmente da anestesia antes de aplicar a bandagem adesiva.
  8. Enrole o mouse destinatário em uma bandagem adesiva com gaze dobrada sobre o enxerto. Faça o curativo pela combinação de duas ataduras, cortandoa parte adesiva de um e colocando as duas almofadas absorventes em conjunto.
  9. Monitorar o mouse de perto durante a recuperação para garantir que o curativo não está restringindo tórax excursão e respirar. Remover o curativo, se a taxa respiratória diminui ou o animal começa a ofegar ou respiração superficial.

3. Cuidados Pós-Operatórios

  1. Administrar enrofloxacina 5 mg / kg após a cirurgia para a profilaxia da infecção.
  2. Posicione o mouse transplantado em uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento no forno até que se recupere totalmente da anestesia.
  3. Observe o mouse por 1 hora de pós-operatório antes de retornar para a instalação de habitação.
  4. Sete dias após a cirurgia, anestesiar o rato como no Passo 2.1. Remover o curativo, cortando apenas através do lado ventral do curativo.
  5. Observar e palpar o enxerto no dia seguinte para sinais de formação de crostas, contração ou dureza. Se estiver presente, o enxerto pode não ter alcançado vasculariza adequadação e deve ser considerada uma falha técnica.
  6. Monitorizar diariamente quanto a sinais de rejeição. Considere enxertos rejeitada quando ≥90% do tecido do enxerto torna-se necrótica.
  7. Eutanásia dos animais rejeitados e colhê-las para análise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A colocação do curativo sobre o mouse destinatário é um passo importante do processo. O enxerto de pele é posicionada no tronco recipiente, entre o ombro, anca e espinha (Figura 1). A ligadura é feita com gaze dobrada e a combinação de duas ataduras adesivas de plástico. O rato receptor é colocado com o enxerto para baixo sobre a gaze sobre o centro da ligadura. Usando dois micro pinças curvas, a extremidade inferior da ligadura é primeiro removido, e em seguida, a parte superior da faixa é enrolado sobre o rato para o abdómen.

Em modelos de desadaptação completas, de espessura total enxertos de pele são geralmente rejeitada em 8 a 12 dias. Em modelos de incompatibilidade de menores, respostas de rejeição são mais lentos, mais variável, e o aparecimento de enxerto de pele é caracterizada por mudanças menos distintas, tais como contração ou perda de cabelo (Figura 2). aguda do enxerto rejeição gêneroslly começa com edema e eritema do enxerto. Estes eventos são seguidos por dessecação do enxerto, o encolhimento e formação de crosta (Figura 2B e C). Dependendo do grau de MHC de incompatibilidade e o protocolo de imunossupressão, a rejeição pode ocorrer por um processo subaguda, marcada por alterações subtis tais como perda de cabelo, pigmentação, sulcos dérmicos, e volume do enxerto. Nestes casos, um enxerto rejeitado aparece brilhante, branco e calvo, com bordas irregulares (Figura 2F) 14.

Utilizando este modelo de transplante de pele, foi investigada uma abordagem nova segmentação metabolismo das células T para evitar a rejeição do enxerto 15. É bem conhecido que as vias de sinalização metabólicas desempenham papéis críticos na ditar os resultados de respostas de células T 16. células T naive contar com a fosforilação oxidativa mitocondrial para gerar a energia necessária para a vigilância imunológica básica. Contudo,após a activação, as células T efectoras metabolicamente reprogramar a glicólise aeróbica e exibem metabolismo aumentado de glutamina 16,17. Usando Balb / c como doadores e C57BL / 6 como destinatários, observou-se que a inibição da glicólise e fosforilação oxidativa metabolismo (2DG + metformina) ou glutamina sozinho (DON) prolongou a sobrevivência do enxerto de pele, mas bloqueando as três vias simultaneamente resultou em significativamente-aumento do enxerto sobrevivência (Figura 3C). Além disso, a terapêutica tripla metabólica foi mais eficaz do que a ciclosporina ou rapamicina convencional (Figura 3A e B). aceitação permanente não foi alcançada, e novas estratégias, incluindo a terapia de depleção, o bloqueio co-estimulação, ou terapias metabólicas mais recentes, podem promover uma melhor indução de tolerância de transplante. No entanto, o estudo forneceu duas novas perspectivas: a utilização de inibidores não-específicos para alvejar células imunitárias selectivos, com aumento das exigências metabólicas, bem como o requisito de t o bloquear os três vias metabólicas, simultaneamente, obter imunossupressão mais robusto na rejeição do enxerto.

Os inibidores de calcineurina e alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) inibidores constituem a maior parte da terapia imunossupressora convencional utilizado em transplantes clínicos. as taxas de sobrevivência de enxerto medianos de Balb / c para C57BL / 6 transplantes de pele tratados com ciclosporina e rapamicina foram 17 e 16 dias, respectivamente. Em comparação, os animais recebedores tratados com inibidores metabólicos, que inibem a glicólise das células T, a fosforilação oxidativa mitocondrial, e metabolismo de glutamina tinha prolongada sobrevivência: a sobrevivência do enxerto mediano foi de 29 dias. Além disso, a histologia dos enxertos de pele a partir do grupo de terapia metabólica exibiram alinhamento mais tecido intacto e menos infiltração inflamatória linfocítica (Figura 4).

105 / 55105fig1.jpg "/>
Figura 1: Cobertura do enxerto com o curativo. Enxerto (A) Pele colocado no tronco direita. (B) Ligadura feita com uma gaze dobrada e duas tiras de plástico ligaduras. Rato (C) Destinatário colocado sobre a gaze. (DF) atadura envolvida em torno do mouse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Skin Graft aparição durante aguda e rejeição crónica. (A) Balb / c para C57BL / 6 (incompatibilidade completa) transplante de pele de espessura total, sem evidência de rejeição (dia 8). (B) Balb / c para C57BL / 6 transplante de pele de espessura total com 50% de rejeição do enxerto (dia 13). (C) Balb / c com 6 transplante de pele C57BL / de espessura total com a rejeição do enxerto completo (dia 18). (D) o transplante de pele de espessura total Singênico (dia 8). Transplante de (E) Singênico de espessura total da pele (dia 30). (F) C57BL / 10 a C57BL / 6 (incompatibilidade menor) transplante de pele de espessura total com a rejeição crônica do enxerto (dia 100). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Balb / c para ratinhos C57BL / 6 de sobrevivência do enxerto de pele. (A) O tratamento com ciclosporina (25 mg / kg QD). (B) tratamento com rapamicina (3 mg / kg QD). (C) O tratamento com inibidores metabólicos, 2-desoxi-D-glucose (2DG) 500mg / kg QD, metformina 150 mg / kg QD, e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) 1,6 mg / kg QOD. Todos os tratamentos foram administrados a partir do dia do transplante até à rejeição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: hematoxilina e eosina (à direita, X100; à esquerda, X200) da Pele Os enxertos com terapia metabólica no pós-operatório Dia 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Desde a sua introdução por Medawar, primeiro em estudos humanos e, em seguida, em coelhos e ratinhos, o transplante de pele tem sido um modelo de valor inestimável para o estudo das respostas imunitárias alogénicas 6,7. Neste artigo, apresentamos um modelo de grande escala, o transplante de pele não-vascularizado de espessura total com a pele para trás superior e inferior. Vários métodos alternativos, incluindo o uso da pele da cauda ou da pele da orelha de rato como fonte de tecido do enxerto, foram relatados até agora 8,9. Esses modelos têm a vantagem distinta de facilidade técnica e permitir a transferência de alto volume. A deficiência relativa das células de Langerhans epidérmicas e células dendríticas dérmicas em enxertos de pele da cauda, no entanto, conduz à rejeição retardada, bem como a aceitação do enxerto facilitada pelo hospedeiro, em particular em modelos menores de desadaptação do MHC 10,11. Portanto, o enxerto de pele tronco de espessura total é considerado um modelo mais robusto e mais adequado para estudar células T mediated rejeição aguda 12.

Além disso, o nosso modelo emprega técnicas simples e não necessita de técnicas de microcirurgia avançada. O tempo de funcionamento é curto (~ 10 min por mouse a partir do início da anestesia para a realização do procedimento) e da morbidade e da mortalidade pós-operatória é insignificante. A mortalidade global (morte dentro de 24 horas após a cirurgia mais morte antes da remoção da ligadura) foi relatada como sendo 3.8% 13. A maioria das complicações surgem de overdose de anestesia ou ataduras excessivamente restritivas, o que pode ser facilmente prevenida pela cuidadosa monitorização da função respiratória durante o período pós-operatório imediato e pela rápida remoção do curativo nos primeiros sinais de dificuldade respiratória 6,17.

O fator mais crítico no processo de enxerto é a revascularização do tecido do enxerto pelo crescimento interno dos vasos do hospedeiro ao enxerto 6. A pele recolhida requeremé uma preparação cuidadosa e a dissecção do panículo carnoso é um passo crítico. Nós preferimos para remover os panículo carnoso sob um microscópio. Recomenda-se para iniciar a dissecção de uma das extremidades e para avançar lentamente, empurrando o músculo e separando-a da pele com a lâmina de uma curva em ângulo ligeiramente Tenotomia. O local do leito de enxerto deve ser medida a partir de articulações e da coluna vertebral. Antes de fazer incisões no rato receptor, o ombro e quadril deve ser movido para visualizar as dobras da pele que ajudam a delimitar o nível das articulações. Ao remover a pele destinatário, é importante para evitar danificar os vasos sanguíneos que funcionam superficial ao panículo carnoso. Se ocorrer sangramento, aplicar a compressão local e remover o sangue e coágulos que podem interferir com o enxerto. Finalmente, o curativo não deve causar dificuldades respiratórias que a recuperação compromisso, embora deva ser suficientemente constritiva para evitar o deslocamento do enxerto e auto-mutilação durante o processo de revascularização. Tiras de plástico Band-Aids são aderentes e forte o suficiente para esta finalidade. Nós combinamos duas ataduras para envolver completamente a cintura do mouse, para permitir a colocação de uma gaze dobrada entre o curativo e o enxerto (Figura 1). A ligadura é removida por corte do lado ventral do mesmo, e o restante é removido pelo animal, a fim de evitar a ruptura do enxerto durante a tentativa de remover a ligadura manualmente.

Em resumo, o transplante de pele de espessura total é um modelo bem estabelecido com referências abundantes na literatura. O procedimento é fácil de executar, o tempo de funcionamento é curto, e as complicações pós-operatórias são limitadas. As etapas críticas estão relacionadas com a colheita da pele do doador meticuloso e o posicionamento correto da bandagem destinatário. Futuros estudos envolvendo biomateriais que promovem a angiogênese e reparação de tecidos pode melhorar ainda mais a taxa de sucesso do procedimento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI077610.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight micro forceps Sigma F4017
Curved micro forceps Aesculap BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors Aesculap BC905R
Mayo dissecting scissors Sigma S3146
Micro needle holder Aesculap BM563R
Sterile gauze Covidien 441218
6-0 Nylon suture MWI 31849
Plastic Strips Band-Aid Johnson & Johnson Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish Fisherbrand FB0875712
PBS Quality Biological 119069131
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin Bayer Health Care 186599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. (2016).
  2. Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. (2016).
  3. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. e50753 (2014).
  4. Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
  5. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
  6. Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
  7. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
  8. Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. (2008).
  9. Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. e51724 (2014).
  10. Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
  11. Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
  12. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
  13. Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
  14. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
  15. Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
  16. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
  17. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics