Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Поступательное управления становится столь же важным шагом в регуляции транскрипции в экспрессии генов, особенно в периоды клеточного стресса 1. Координационный центр контроля перевода находится на лимитирующей стадии инициации , где первые этапы синтеза белка связаны с связывание эукариотических фактор инициации 4Е (eIF4E) к 7-methylguanosine (м 7 GTP) 5 'колпачка мРНК 2 , eIF4E является частью тримера комплекса имени eIF4F , который включает eIF4A, РНК - геликазу и eIF4G, белок строительные леса , необходимого для набора других факторов перевода и 40S рибосомы 3. В нормальных физиологических условиях, подавляющее большинство мРНК транслируются с помощью механизма кэп-зависимой, но в периоды клеточного стресса приблизительно 10% человеческих мРНК содержит 5 'НТО , которые могли бы позволить кэп-независимый перевод инициация 1,4. Cap-зависимый перевод был исторически синонимOUs с eIF4F, однако, стресс-специфические вариации eIF4F стали трендом тема 5-8.

Различные клеточные стрессы вызывают eIF4E активность, чтобы быть подавлено через мишень рапамицина у млекопитающих комплекса 1 (mTORC1). Эта киназа становится нарушение в условиях стресса, что приводит к увеличению активности одной из своих целей, то 4E-связывающий белок (4E-BP). Нефосфорилированный 4E-BP связывается с eIF4E и блокирует его способность взаимодействовать с eIF4G вызывает репрессию кэп-зависимой трансляции 9,10. Интересно отметить , что гомолог eIF4E по имени eIF4E2 (или 4EHP) имеет значительно более низкое сродство к 4E-BP 11, может быть , что позволяет ему уйти от стресса опосредованной репрессии. Действительно, первоначально характеризуется как репрессор перевода из - за отсутствия взаимодействия с eIF4G 12, eIF4E2 инициирует перевод сотен мРНК , которые содержат РНК - элементы ответа гипоксия в их 3 'UTR во время гипоксического стресса 6,13. Эта активация яы достигается за счет взаимодействия с eIF4G3, РНК связывающий белок мотив 4 и индуцируемого гипоксией фактор (HIF) 2Л составлять гипоксической eIF4F комплекс, или eIF4F H 6,13. В качестве репрессора при нормальных условиях, eIF4E2 связывается с GIGYF2 и ZNF598 14. Эти комплексы были, в частности, определены через Агарозном-сцепленных м 7 GTP аффинных смол. Этот классический метод 15 является стандартом в области перевода и является лучшим и наиболее часто используемый метод для выделения кэп-связывающих комплексов в выдвиньте вниз и в пробирке анализы связывания 16-19. По мере того как крышка-зависимого перевода машины появляется как гибкость и адаптируемость с интер изменяющие деталей 6-8,13, этот метод является мощным инструментом для быстрого выявления новых кэп-связывающих белков , участвующих в реакции на стресс. Кроме того, изменения в eIF4F может иметь далеко идущие последствия, как несколько эукариотических систем модели появляются использовать гомолог eIF4E2 для таких стрессовых реакцийкак A. thaliana 20, С. Pombe 21, Д. MELANOGASTER 22, и С. Элеганс 23.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том , что изменения в eIF4F не может быть строго ограничена стрессовым условиям, но участвовать в нормальной физиологии 24. Подача кислорода к тканям (на концах капилляра) или в тканях (измеряется с помощью микроэлектродов) колеблется от 2-6% в головном мозге 25, 3-12% в легких 26, 3,5-6% в кишечнике 27, 4% в печень 28, 7-12% в почке 29, 4% в мышцах 30, и 6-7% в костном мозге 31. Клетки и митохондрии содержат менее 1,3% кислорода 32. Эти значения гораздо ближе к гипоксии, чем окружающий воздух, где клетки обычно культивируют. Это говорит о том, что ранее считалось, как гипоксия специфические клеточные процессы, которые могут быть необходимы в физиологической обстановке. Интересно, что eIF4F и eIF4F H 24. Низкий уровень кислорода также приводит правильное развитие плода 33 и клетки обычно имеют более высокий уровень пролиферации, увеличенный срок службы, меньше повреждений ДНК и меньше ответов общего напряжения в physioxia 34. Поэтому eIF4F H, вероятно , является ключевым фактором в экспрессии генов , выбранных в физиологических условиях.

Здесь мы приводим протокол к культуре клеток в основных физиологических условиях кислорода или в динамическом диапазоне колеблющейся, который, вероятно более представительным микросреды ткани. Одно из преимуществ этого способа состоит в том, что клетки лизируют в пределах рабочей станции гипоксией. Не так часто, ясно, как переход от гипоксического культуры клеток к лизису клеток производится в других протоколах. Клетки часто сначала удаляют из небольшого гипоксией инкубаторе бытьпередний лизис, но это воздействие кислорода может влиять на биохимические пути , как клеточная реакция с кислородом происходит быстро (один или два мин) 35. Некоторые кэп-связывающие белки требуют взаимодействия с вторым основанием или может гидролизовать м 7 ГТФ, поэтому некоторые крышки interactors могут быть пропущены в процессе очистки. Агарозном связаны с аналогами ферментативно резистентных Колпачок может быть заменен в данном протоколе. Изучение активности и состава eIF4F H и других вариаций eIF4F с помощью метода , описанного здесь будет пролить свет на запутанные экспрессии генов механизмов , которые клетки используют в процессе физиологических условиях или стрессовых реакций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка к культуре клеток

  1. Покупка коммерчески доступные запасы человеческих клеток.
    Примечание: Этот протокол использует НСТ116 колоректальной карциномы и первичной почки проксимальных канальцев эпителиальные клетки человека (HRPTEC).
  2. Сделать 500 мл среды для культивирования НСТ116: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) / Высокий средний глюкозы, дополненной 7,5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S).
  3. Сделать 500 мл среды для культивирования HRPTEC: Эпителиальный среду клеток, дополненной 5% FBS, 1% добавки роста эпителиальных клеток, а 1% P / S.
  4. Приготовьте 500 мл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS): 140 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 15 мМ KH 2 PO 4. Регулировка рН до 7,4 и стерилизуют в автоклаве в течение 40 мин при температуре 121 ° С.

2. Начало культивирования клеток

  1. Тщательно аспирата среду от 80-90% сливающийся блюдо с не нарушая тон клетки.
  2. Аликвотные 3-5 мл 1x PBS на чашку для культивирования, аккуратно раскачивать каждую колбу, чтобы покрыть площадь поверхности тарелки, и тщательно аспирата 1X PBS. Повторите эти действия для второй промывки 1x PBS.
  3. Алиготе 3 мл 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в каждую чашку для культивирования и осторожно встряхните, чтобы равномерно слой клеток с помощью трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 мин.
  4. Передача обособленные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 4000 х г в течение 90 сек.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды DMEM.
  6. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Подсчитайте , сколько апирогенно и полистирольная 100 мм чашки для культивирования клеток необходимы для достижения начальной плотности посева около 2500-5000 клеток на см 2.
  7. Предварительно теплая полная среда для культивирования клеток сделаны с шагом 1.2 или 1.3, в водяной бане при 37 ° С в течение 30-45 мин.
  8. Дезактивацию средней бутылки и флакон клеток с 70% этанола. С этого момента всеоперации должны быть выполнены в асептических условиях.
  9. Алиготе 6 мл полной DMEM на столько 100 мм чашки для культивирования клеток, необходимых для использования весь объем замороженных клеток в пределах плотности высева упомянутого в пункте 2.6.
  10. Перенести объем клеточной суспензии, вычисленным на этапе 2.6 к каждому из мм культуральные чашки 100. Rock каждую пластину вручную, чтобы равномерно распределить клетки по поверхности пластины.
  11. Поместите отобранный 100 мм для культивирования клеток блюдо в инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Разрешить клетки инкубировать по меньшей мере, 24 ч до следующих шагов.

3. пересева

  1. Просмотреть каждую ячейку культуры блюдо под микроскопом, чтобы определить процент клеток сплошности (% клеток, покрывающих площадь тарелки). Возвращение клеток в инкубатор и предварительно теплой полной среде и 1х PBS. Перейдите к следующему шагу, если клетки 80-100% сплошности.
  2. Тщательно аспирата затрачиваемое среду не нарушаяклеток в каждой культуре блюдо.
  3. Аликвотные 3-5 мл 1x PBS на чашку для культивирования, аккуратно раскачивать каждую колбу, чтобы покрыть площадь поверхности тарелки, и тщательно аспирата 1X PBS. Повторите эти действия для второй промывки 1x PBS.
  4. Алиготе 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в каждую чашку для культивирования и осторожно встряхните, чтобы равномерно слой клеток с помощью трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 мин.
  5. Во время этой инкубации аликвоты 10 мл полной среды на столько чашки для культивирования, необходимых для получения плотности клеток 2500-5000 клеток на см 2.
  6. Когда клетки отделяются от пластины, быстро добавляют 3 мл 1x определенного ингибитора трипсина и осторожно взболтать блюдо в течение 1 мин, чтобы гарантировать, что все трипсин-ЭДТА был нейтрализован.
  7. Перенесите отдельные клетки в стерильный 15 мл центрифужную пробирку и отложите в сторону. Добавьте 3 мл 1x PBS в блюдо, чтобы собрать оставшиеся клетки, и передать, что к тому же 15 мл центрифужную пробирку.
  8. Гранул клетки центрифугированием 150 XGв течение 5 мин.
  9. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл полной среды.
  10. Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 150 мм культуральные чашки , содержащей 15 мл полной среды , чтобы получить плотность клеток 2500-5000 клеток на см 2. Используйте два 150 мм для каждого колпачка-связывающего анализа.
    Примечание: диффузии кислорода к клеткам через жидкие среды зависит от объема 36. Рекомендуется сохранить объем средств массовой информации в соответствии между экспериментами, используются ли прилипшие клетки или клетки в суспензии. Средства массовой информации могут быть предварительно кондиционером (инкубируют в рабочей станции, в течение 24 часов, как было описано в обсуждение), чтобы избежать этих изменчивости в процессе диффузии.
  11. Поместите посуду отобранный-культуры в термостате при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Разрешить клетки инкубировать по меньшей мере, через 24 часа, прежде чем перейти к следующему шагу.

4. Physioxic экспозиции

  1. Просмотреть клетки под микроскопом. Для BESРезультаты T, убедитесь, что клетки на 70-80% сплошности для воздействия на 24 ч, 50-60% сплошности для воздействия на 48 часов, а затем 40-50% сплошности для облучения в 72 ч.
  2. Поместите клетки в гипоксией рабочей станции в течение требуемого времени (24, 48, или 72 ч в зависимости от эксперимента).
  3. Установите рабочую станцию ​​к соответствующему physioxia.
    Примечание: Например, установка 3% O 2 будет сопровождаться 5% CO 2 и 92% N 2.
    Примечание: Если колебания кислорода в пределах динамического диапазона желательно более конкретные сроки, программирования расписания в прибор или вручную настроить параметры кислорода в нужных интервалах.
  4. Установите влажность до 60%. Атмосфера рабочая станция очень сухая, тем не менее, и средства массовой информации будут заметно испаряются во время длительных экспериментов (> 48 ч). Держите резерв средств массовой информации в клеточной культуре колбу в пределах рабочей станции (так что носитель уравновешивают с атмосферой рабочей станции) для пополнения средств массовой информации в культуре клеток дисГЭК.
    Примечание: Любое решение , которое будет взаимодействовать с клетками , предшествующих лизиса (например, PBS и трипсин-ЭДТА) должны быть предварительно кондиционируют в течение 24 часов перед использованием внутри рабочей станции гипоксией таким образом , чтобы содержание растворенного кислорода уравновешивается с атмосферным кислородом 36.
  5. Хранить клетки в пределах рабочей станции до лизиса.

5. Подготовка Буферы для Cap-анализе на связывание

  1. Приготовьте 1х Трис-солевом буфере (TBS).
    1. В 800 мл дН 2 O растворяют 8,76 г NaCl и 6,05 г Трис Base.
    2. Доведите раствор до конечного рН 7,4 с помощью 1 М HCl.
    3. Принесите конечный объем до 1 л с использованием дН 2 O.
  2. Готовят без денатурированного буфера для лизиса. Подготовка буфера для лизиса день колпачка-связывающего анализа. Сделайте дополнительный буфер для лизиса мыть пустые шарики агарозы и тому γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сцепленные бусинки (шаги 7.9 и 7.13).
    1. В 7 мл дН 2 O, добавляют 160 мкл 5 М NACл, 160 мкл 1 М Трис-HCl , рН 7,4, 40 мкл 200 мМ NaF, 40 мкл 1 М MgCl 2, и 40 мкл 1 мМ ортованадата натрия.
    2. Добавьте 40 мкл Igepal к раствору 7 мл. Обрежьте кончик пипетки, чтобы помочь восстановить Igepal как это чрезвычайно вязкая.
    3. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, или вихрь, раствор 7 мл, пока все Igepal не растворится.
    4. Повысить конечный объем раствора до 8 мл, и держать на льду.
  3. Подготовьте 4x додецилсульфат натрия (SDS) -page буфера выборок.
    1. В химическом стакане, смешайте 16 мл 1 М Трис-HCl, рН 6,8, 12,64 мл глицерина и 8 мл дитиотреитола (DTT).
    2. Добавить 3,2 г SDS и 0,16 г бромофенолового синего. Разрешить порошок полностью раствориться при перемешивании с помощью магнитной мешалки.
    3. Алиготе в 1,5 мл микропробирок и хранят при -20 ° С.

6. лизиса клеток

  1. Подготовить неденатурирующем буфер для лизиса и держать на льду день гое капсюль-анализа связывания.
  2. Предварительно теплой 1X PBS и трипсина в водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин.
  3. Алиготе 980 мкл буфера для лизиса в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для каждого колпачка-связывающего анализа выполняются.
  4. Добавляют 10 мкл 4- (2-аминоэтил) фторид-бензолсульфонил гидрохлорида и 10 мкл 100-кратного ингибиторов протеаз к 980 мкл буфера для лизиса. Держите на льду.
  5. Выбросить носитель из каждого 150 мм блюдо в мусорный контейнер внутри рабочей станции гипоксией.
  6. Промывают клетки с 3-4 мл подогретого 1x PBS и выбросить всю жидкость.
  7. Добавить 1 мл подогретого 0,05% трипсина-EDTA в каждую чашку и оставьте на 2 мин или пока клетки больше не привязаны к пластине.
  8. С помощью пипетки переносят клетки одной пластины на 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Повторите по мере необходимости так, чтобы каждая пластина клеток переносили в отдельную 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  9. Центрифуга 1,5 мл микроцентрифужных трубки при 6000 мкг в течение 90 сек тO осадка клеток.
  10. Аспирируйте трипсина с помощью пипетки, не нарушая гранул. Если осадок нарушен, повторно Центрифуга микроцентрифужных трубки 1,5 мл при 6000 мкг в течение 90 сек.
  11. Вымойте клетки с теплой 1x PBS, осторожно пипеткой 200 мкл PBS в трубу непосредственно над шариком. Повторно центрифуге, если осадок нарушен.
  12. Аспирируйте PBS, не нарушая гранул.
  13. Пипеток 500 мкл из 1 мл буфера для лизиса приготовленный раствор на первой сотовой гранулы. Ресуспендируют осадок полностью пипетированием вверх и вниз.
  14. Объединяют ресуспендировали клетки со вторым осадку клеток и ресуспендируют вторую таблетку с помощью пипетки вверх и вниз. Повторите этот процесс, пока все гранулы не были объединены и ресуспендировали для каждого образца.
  15. Смешайте лизата с оставшимися 500 мкл буфера для лизиса в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  16. Удалить образцы с рабочей станции гипоксией.
    Примечание: После добавления лизиса буфер,Л.Л. последующие шаги должны быть выполнены в окружающем воздухе в качестве рабочей станции гипоксия установлен на 37 ° С, и следующие шаги должны быть выполнены холодным (4 ° С или на льду).
  17. Лизировать клетки, используя легкое перемешивание путем вращения образцов при 4 ° С в течение 1,5-2 ч.
  18. Центрифуга лизированных клеток при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
  19. Передача лизата в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и выбросить осадок.
  20. Резервируют часть (5-10%) надосадочной жидкости для использования в качестве целого входного контроля клеточного лизата для будущего Вестерн-блот-анализа.

7. Cap-связывающим Анализ

  1. Для каждого образца, передать 50 мкл заготовки агарозном суспензии управления шарик и 50 мкл γ-аминофенил-м 7 ГТФ агарозы С10-сцепленного шарик суспензии для отделения 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Используйте ножницы, чтобы удалить кончик пипетки для облегчения сбора суспензии шарик.
  2. Гранул бусы бу центрифугирование суспензии при 500g в течение 30 сек.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют тщательно бусин в 500 мкл TBS.
  4. Повторите шаги 7.2 и 7.3. Гранул шарики при 500 мкг в течение 30 сек и удалить супернатант.
  5. Передача супернатант, содержащий лизата из стадии 6,19 в пробирку микроцентрифужных 1,5 мл раствора, содержащего пустые агарозном бисером.
    Примечание: Пустые агарозном шарики действуют в качестве стадии предварительной клирингового для удаления белков из лизата, которые неспецифически взаимодействовать с буртиком.
  6. Инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  7. Гранул пустые агарозном бисером центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек.
  8. Передача лизата в микроцентрифужных пробирку объемом 1,5 мл , содержащей γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусы.
  9. Промыть пустые агарозном бисером ресуспендирования бисером в 500 мкл буфера для лизиса, гранулирование шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек, и отбрасывая supernaTant. Повторите это четыре раза в общей сложности пять стирок.
  10. Ресуспендируют пустые агарозном бисером в 1x SDS-PAGE образца буфера, и кипение шариками в течение 90 сек при 95 ° С. Хранить при -20 ° С для последующего Вестерн-блоттинга, чтобы наблюдать, связывается ли представляющий интерес белок, неспецифически к буртика.
  11. Выдержите лизата с γ-аминофенил-м 7 ГТФ агарозы С10-сцепленных бусинок при осторожном перемешивании в течение 1 часа при 4 ° С для захвата кэп-связывающих белков.
  12. Гранул γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек. Удалите супернатант.
  13. Вымойте γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусинки, повторив шаг 7.9.
  14. Ресуспендируют бисером в 600 мкл буфера для лизиса.
  15. Добавить ГТФ до конечной концентрации 1 мМ.
  16. Инкубируйте γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусин + 1 мМ GTP при осторожном перемешивании в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Примечание: Этабудет разъединить белки , которые неспецифически взаимодействуют с 7 м GTP (то есть, также взаимодействуют с не денатурированного GTP).
  17. Гранул γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек.
  18. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и добавляют 200 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, и 10% глицерина). Хранить контрольный образец ГТФ при -20 ° С для последующего Вестерн - блот - анализа 37. Вымойте бисером, повторив шаг 7.9.
  19. Ресуспендируют бисером в 1x SDS-PAGE образца буфера (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерина), и кипение при температуре 95 ° С в течение 90 сек. Хранить м 7 ГТФ-связанной фракции при -20 ° С для последующего Вестерн - блот - анализа 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализ Cap-связывающая способность в ответ на кислородом eIF4E и eIF4E2 в качестве м 7 GTP сходству столбца

На рисунках 1 и 2 представляют собой вестерн - блоттинга типичных м 7 GTP аффинной очистки двух основных кэп-связывающих белков в ответ на колебания кислорода в двух клеточных линий человека: первичные почечные проксимальных канальцев эпителиальные клетки человека (HRPTEC) в F igure 1 и колоректальной карциномы ( НСТ116) на рисунке 2. Клетки поддерживают при указанном наличие кислорода в течение 24 ч, чтобы гарантировать, что содержание растворенного кислорода в жидкой среде, имеет уравновешенную воздуха внутри рабочей станции гипоксией. Входной полоса (IN) составляет 10% от всего клеточного лизата до 7 м ГТФ-сшитые агарозные гранулы добавляют для захвата кэп-связывающих белков. Этот вход полоса используется в качестве основы для измерения обогащенияцелевого белка в ГТФ пулдауна м 7. ГТФ полоса является Элюат из м 7 ГТФ бусинок , которые были элюат с помощью 1 мМ ГТФ. Этот шаг позволяет для обнаружения белков, которые также распознают не-метилированных ГТФ. Колпачок-связывающие белки eIF4E и eIF4E2 признать м 7 GTP конкретно, но их гомологов eIF4E3 (здесь не показано) также связывается с не-денатурированного ГТФ. Способность eIF4E и eIF4E2 связать 5 'мРНК структуру чашечка (м 7 GTP) может быть измерена путем сравнения интенсивности их полос в м 7 колонки ГТФ по отношению к интенсивности во входной полосе (всего имеется бассейн).

Это количественное определение может быть выполнено путем измерения интенсивности пикселей полос белка для трех биологических повторностях с программным обеспечением для анализа изображений, таких как ImageJ. Результаты выражали в виде относительных единиц средств плотности (РДУ) ± стандартная ошибка среднего значения. Сырые значения до нормализацииот обоих экспериментальных и контрольных образцов сравнивали с помощью Т-тест непарный двух Стьюдента. P <0,05 считалось статистически значимым. Этот представительный эксперимент показывает, что две клеточные линии имеют различные диапазоны кислорода для их eIF4E и eIF4E2 использования. На рисунке 1 показано , что в HRPTEC только eIF4E сильно связывается с м 7 ГТФ на 8% O 2 (рис 1А), что оба eIF4E и eIF4E2 значительно связаны с м 7 ГТФ с 3-5% O 2 (фиг.1В - C), и что только eIF4E2 прочно связывается с м 7 GTP на 1% O 2 (рис 1D). На рисунке 2 в НСТ116 клетках, кислород-зависимого использования этих кэп-связывающих белков отличается: только eIF4E значительно связывается с м 7 ГТФ при 12% O 2 (Фигура 2А), причем оба кэп-связывающие белки значительно связываются с м 7 ГТФ в 5-8% диапазоне O 2(Фигура 2В - С), и только eIF4E2 значительно связывается с м 7 GTP на 3% O 2 (рис 2D). Отсутствие вымывания из ГТФ колонны 7 м с ГТФ показывает , что eIF4E и eIF4E2 являются специфическими для 7 м GTP и не признают , не денатурат ГТФ. Гистограммы представляют количественную оценку трех биологических повторностях с использованием ImageJ. Наши результаты показывают , что два основных кэп-связывающих белков, eIF4E и eIF4E2, различаются по своей способности связывать мРНК м 7 GTP структуру крышки в кислородно-зависимым образом.

Основываясь на предыдущей литературе, что эти два белка инициировать перевод уникальных классов мРНК, этот сдвиг в кепке-связывающей активности может привести к различным протеомов сгенерированных адаптироваться к изменениям в наличии кислорода. Этот метод может быть использован для характеристики новых факторов инициации трансляции, которые взаимодействуют с 'мРНК колпачка 5(или с капитализацией-связывающими белками) через целевой Вестерн - блот подхода или широкого подхода , таких как масс - спектрометрического анализа с 7 м GTP элюата.

Рисунок 1
Рисунок 1: eIF4E и eIF4E2 деятельности перекрываются во physioxia в HRPTEC от 3-5% O 2. Анализы с использованием Захват м 7 GTP бусин в человеческой почечной проксимальных канальцев эпителиальной клетки (HRPTEC) лизаты воздействию (А) 8%, (б) 5%, (C) 3% или (D) 1% O 2 в течение 24 часов. GTP, ГТФ мытья для измерения специфичность в отношении м 7 ГТФ; м 7 GTP, белки , связанные с м 7 GTP шариков после GTP мытья. Представитель Вестерн-блоты показаны и данные по меньшей мере, в трех независимых экспериментах были количественно ImageJ и выражали в единицах относительной плотности (RDU) по сравнению с 10% вход (IN) цельных клеточных лизатов. * P <0,05 (непарный Стьюдента-тест Стьюдента) считалось существенным изменением при сравнении обогащения eIF4E или eIF4E2 в кепке связанной фракции (м 7 GTP) к IN. Данные, среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) из трех независимых экспериментов. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Timpano, С. и Uniacke клетки человека J. культивированные в физиологическом кислорода используют два кэп-связывающих белков для набора различных мРНК для перевода. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. eIF4E и деятельность eIF4E2 перекрываются во physioxia в НСТ116 от 5-8% O 2. Захват анализа с использованием м 7 GTP бусин в НСТ116 человеческой колоректальной карциномы лизатов , подвергающихся (A) 12%, (Б) 8%, (C) 5% или (D) 3% O 2 в течение 24 часов. GTP, ГТФ мытья для измерения специфичность в отношении м 7 ГТФ; м 7 GTP, белки , связанные с м 7 GTP шариков после GTP мытья. Представитель Вестерн-блоты показаны и данные по меньшей мере, в трех независимых экспериментах были количественно ImageJ и выражается в единицах относительной плотности (РДУ) по сравнению с 10% вход (IN) всей лизата клеток. * P <0,05 (непарный Стьюдента-тест Стьюдента) считалось существенным изменением при сравнении обогащения eIF4E или eIF4E2 в кепке связанной фракции (м 7 GTP) к IN. Данные, среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) из трех независимых экспериментов. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Timpано, С. и Uniacke клетки человека J. культивированные в физиологическом кислорода используют два кэп-связывающих белков для набора различных мРНК для перевода. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ кэп-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых физиологических условиях кислорода может быть предусмотрена возможность идентификации новых кислородных регулируемых факторов инициации трансляции. Сродство этих факторов для колпачка 5 'мРНК или других кэп-ассоциированных белков может быть измерена с помощью силы их ассоциации с м 7 GTP-сшитый агарозном бисером. Одно предостережение этого метода заключается в том, что он измеряет кэп-связывающий потенциал белков после лизиса, но она выполняется под неденатурирующих условиях, которые поддерживают белок-белковых взаимодействий и пост-трансляционные модификации (PTMs). Несколько белок-белковых взаимодействий опосредовать связывание семейства eIF4E с колпачком 5 '. 4E-BP связывает и репрессирует eIF4E, блокируя его взаимодействие с eIF4G и предотвращению вербовки в 43S предварительного инициирования комплексных 38. Комплекс eIF4E / 4E-BP остается связанным с "мРНК колпачка 5, блокируя любое посвящение от этой стенограммы, а можетиспользоваться в качестве маркера для eIF4E торможения в м 7 ГТФ аффинные колонки. С другой стороны , взаимодействие eIF4E с eIF4G на 7 м GTP колонн может быть маркером для активного инициации трансляции. PTMs еще один способ регулировать активность факторов инициации трансляции. Например, фосфорилирование eIF4E путем Mnk1 может увеличить сродство к мРНК 5 'крышки 39. Модификатор белок , кодируемый Интерферон стимулированного гена 15 (ISG15) является ПТМ , что увеличивает кэп-связывающую активность eIF4E2 в ответ на индукции интерферона через 40 возбудителя инфекции. Ген ISG15 содержит элемент ответа гипоксия в его промоутера предполагая, что эта система может регулировать eIF4E2 в низким содержанием кислорода. Очень мало известно о том, как PTMs может изменять активность кэп-связывающих белков во время физиологически соответствующих условий кислорода. Этот метод с последующим масс-спектрометрического анализа может выявить новые кислородные регулируемых и физиологически соответствующие PTMs-йна опосредовать активность факторов инициации трансляции.

Альтернативный метод захвата с 7 м GTP аналога крышки будет иммунопреципитации известную кэп-связывающий белок , такой как eIF4E или eIF4G и выполнить масс - спектрометрии для идентификации белков , связанных с . Ограничение этой стратегии заключается в том, что Сар-связывающие белки часто имеют альтернативные клеточные функции , такие как в пределах напряжений гранул 41 или в кепке независимый перевод 1,4. Поэтому, используя м 7 GTP колпачковые аналогов является лучшим, самым надежным способом изолировать кэп-связывающих белков, особенно при исследовании новых кэп-ассоциированных белков. Ограничение использования в м 7 ГТФ колпачок аналог , что некоторые кэп-связывающие белки , такие как поглотитель decapping фермент ПСД не только взаимодействовать с м 7 ГТФ мРНК колпачка, но и требуют вторую базу для связывания 42. Кроме того, decapping ферменты в целом, такие как комплекс Dcp1 / Dcp2, может гидрolyze м 7 GTP и эффективно уменьшить емкость смолы. Таким образом, некоторые крышки-связывающие белки могут быть потеряны в этом анализе. Для того, чтобы обойти эти подводные камни, аналоги ферментативно устойчивые мРНК крышки могут быть использованы. Два негидролизуемый колпачок аналоги, мононуклеотид м 7 GpCH2pp или динуклеотид м 7 GpCH2ppA было показано , что захват ПСД, Dcp1 и Dcp2 43. Эти аналоги мРНК клапана не доступны коммерчески, но они должны быть химически синтезированы заново. Другим ограничением этого протокола является то, что только капсюль-связывающие белки или белки, взаимодействующие с капитализацией-связывающих белков с помощью "Спекуляция" будут захвачены. В то время как шапка-зависимые инициации трансляции является основной формой инициации, шапка-независимые механизмы особенно распространены во условиях клеточного стресса 1. Тем не менее, в контексте этой техники и новых тенденций в области инициации трансляции 6-8,24, выявление новых факторов стресс-индуцированной , что раrticipate в кэп-зависимой инициации является перспективной областью исследований.

Другой фактор, чтобы рассмотреть в этом протоколе является кислород в средствах массовой информации. Культивированием клеток в жидкой среде, обеспечивает барьер между клетками и атмосферой. Было показано , что жидкие среды может потребоваться до 24 часов для уравновешивания с составом 36 атмосферного газа. Таким образом, клетки должны быть культивированы в течение 24 часов в желаемом наличие кислорода до лизиса, или средства массовой информации могут быть предварительно кондиционером, если требуются более короткие инкубацию. Предварительная подготовка включает в себя поддержание средств массовой информации в рабочей станции гипоксией в течение по крайней мере 24 часов в стерильной колбе для культивирования, который позволяет газообмен. Любое окисленный раствор введен в клетки внутри рабочей станции гипоксия может быстро изменить клеточные пути передачи сигналов, таких как крышка-зависимой инициации трансляции, которая в настоящее время рассматривается в данном протоколе. Из-за чувствительности кислорода зондирования путей в клетках, любое решение, которое будетвзаимодействуют с клетками, предшествующих лизиса, таких как PBS и трипсин-ЭДТА должен также быть предварительно выдержан в течение не менее 24 часов. Лизису и после лизиса мыть буферы должны быть использованы холодный и, следовательно, не были предварительно кондиции в C гипоксией рабочую станцию ​​37 °. В то время как некоторые кислородные-зависимые модификации белков может быть активным после лизиса, холодные буферы необходимы для минимизации ферментативной активности и "перетасовки" белок-белок или РНК-комплексов, которые могут привести к артефактам. Модификация этого протокола для увеличения жесткости может быть предварительным условием лизису и после лизиса мыть буферов в течение 24 ч, а затем инкубировать их на льду в течение рабочей станции перед использованием. Средства массовой информации и буферы не должны храниться в рабочей станции гипоксией в течение более трех дней, потому что эти решения будут концентрироваться в результате испарения воды. Для более долгосрочных исследований (> 3 дня), начальное количество клеток, посеянных должны быть тщательно продуманы. Как клетки делятся и площадь поверхности тарелки становится тесно,другие стрессы, такие как медиа-подкисления может влиять на активность кэп-связывающих белков. В последний день эксперимента клетки должны иметь слитности 80-90%.

Есть четыре важных шагов в рамках этого протокола: сохранение клеток в гипоксия рабочей станции до лизиса, количество клеток, используемых, мытье шарики, а также не-метилированных управления GTP. 1) Есть несколько методов для поддержания клеток в низким содержанием кислорода. Большинство из них включают в себя небольшие камеры, которые могут содержать только блюда клеточной культуры, но любые манипуляции или лизис клеток должны быть выполнены вне камер в атмосферном воздухе. Компоненты кислородного зондирования машины , такие как индуцируемого гипоксией факторы активируются или инактивируется в течение нескольких одного или двух минут 35. Таким образом, как уже упоминалось ранее, лизиса клеток в гипоксической рабочей станции имеет решающее значение для обеспечения активности капа-связывающих белков, который связан с соответствующей доступности кислорода. 2) Количество ячеекпредложил в этом протоколе (два 150 - мм чашках) достаточна для сильного м 7 GTP interactors такие как семейство eIF4E или членов eIF4F комплекса (eIF4A и eIF4G). Более клетки, по крайней мере , пять 150 мм блюда, может потребоваться для обнаружения белков с переходными взаимодействий или что только ассоциированной с 7 м GTP мРНК колпачком через eIF4F. 3) промывание бусинки после выдержки их в термостате с Клеточный лизат может быть выполнена в строгой и менее строгим образом. Протокол, представленные здесь, предлагает строгий вариант, где лизиса буфер используется для мытья бисером пять раз. Если белки с более слабыми взаимодействиями в довершение-связывающие белки представляют интерес, можно выполнить меньшее количество промывок и используют трис-забуференный солевой раствор вместо буфера для лизиса. 4) В то время как важно предварительно очистить клеточный лизат с неконъюгированная агарозы для удаления белков, которые не специфически взаимодействуют с борта, некоторые крышки-связывающие белки не могут различать между истинной структуры мРНК колпачком, метилированный GTP (м7 GTP), и не метилируется ГТФ. Одним из таких белков является eIF4E гомолог eIF4E3 44. Элюирование шарики с ГТФ вытеснят любой белок, который также признает, не денатурат ГТФ, который мог бы представлять интерес. Биологическая значимость белков , которые распознают как м 7 GTP и GTP до сих пор не выяснена. Это подчеркивается в нескольких публикациях , связанных с eIF4E3 (который является добросовестным капсюль-связывающий белок с законсервированного кэп-связывающий домен) по отношению к eIF4E и eIF4E2 белки, которые делают признают м 7 GTP из не-метилированных ГТФ.

Этот метод, как представлено, может быть выполнена в качестве целевого подхода к выявлению м 7 GTP interactors , представляющие интерес или как широкий подход, анализируя м 7 GTP элюата с помощью масс - спектрометрии. Некоторые другие методы могут следовать physioxic воздействия (протокол 4) для анализа кэп-связывающей активности, такие как внутриклеточного фракционирования, иммунофлюоресценции, совместно иммунопреципитации, вй анализ полисом. Поступательное управления становится равным вклад в экспрессии генов в транскрипции. Используя эту технику, чтобы исследовать активность и состав кэп-связывания комплексов будет пролить свет на инициации трансляции капсюль-зависимой регулируется в ответ на низкий уровень кислорода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351, (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14, (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266, (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433, (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564, (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273, (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32, (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23, (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129, (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21, (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282, (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1, (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273, (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29, (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121, (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25, (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43, (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57, (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92, (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87, (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571, (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99, (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321, (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15, (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26, (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14, (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18, (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21, (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14, (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18, (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271, (11), 2189-2203 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics