כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

בתגובה מסתגלת היא חיונית להישרדות חיידקים. כדי לזהות ולהגיב לשינויים סביבתיים, חיידקים להשתמש במערכת גירוי תגובה המכונית איתות דו רכיבים. 1,2 במערכת דו רכיבים טיפוסית, קינאז היסטידין מזהה גירוי מאותו מקור, autophosphorylates שאריות היסטידין המשומר שלה, ואז מעביר פוספט שאריות aspartate משומרות על תחום המקלט של חלבון רגולטור תגובה. 3 אירוע זה מעורר שינוי בפעילות של הרגולטור בתגובה, אשר מגרה השפעה במורד הזרם. 4,5 לכן, חיידקים מסוגלים לחוש להסתגל לשינויים בסביבה המקומית. כמה מערכות אזעקה דו רכיבים לסטות ארכיטיפ זה. במקרים מסוימים, התחום החושי של קינאז היסטידין הוא חלבון עצמאי, אשר ישירות מזהה את הקלט החושי ומשנת פעילות קינאז באמצעות אינטראקציה בין חלבונים. 6 - 8 עם זאת, הקרןתהליך amental ואת התפקיד כולל של המערכת נשאר זהה. איתות דו מרכיבים היא מערכת גירוי-תגובה בכל מקום כי הוא חיוני להישרדות חיידקים, קינאזות היסטידין לשחק תפקיד קריטי התמרה של האות. 9

למרות חשיבותו של קינאזות היסטידין לביולוגיה בקטריאלי, הם נשארים גרועים מאופיינים. זאת בשל חוסר היציבות הטבוע phosphohistidine, וחוסר שיטה מעשית למדידת autophosphorylation. Phosphohistidine הוא יותר יציב מאשר phosphoserine, phosphothreonine, ו phosphotyrosine. 10 לפיכך, טכניקות שאינן בשימוש נפוץ לנתח שירו / Thr / קינאזות Tyr אינן ישימות עבור קינאזות היסטידין. 11 מבחני חוץ גופית ללמוד קינאזות היסטידין כבר מוגבלת בעיקר autoradiography SDS-PAGE. 12,13 בשיטה זו, -ATP [32 P γ-] הוא מודגרות עם קינאז, ו זרחון של קינאז מנותח על ידי polג'ל אלקטרופורזה yacrylamide (עמוד) ואחריו autoradiography של הג'ל. שיטה זו יכולה לשמש כדי לפקח autophosphorylation קינאז, וכן phosphotransfer מן קינאז לווסת תגובה. עם זאת, בשיטה זו יש חסרונות בולטים. מבחנים מבוססי עמוד הם תפוקה נמוכה זמן רב. מגבלות אלו הן לא תורמים לאפיון חלבון ולוודא פרמטרים הקינטית שלו. שיטה חלופית ללימוד קינאזות היסטידין שפורסם לאחרונה מנצל נוגדנים phosphohistidine לזהות autophosphorylation. 14 אמנם שיטה זו יש את היתרון של הבחנה בין 1-phosphohistidine ו -3-phosphohistidine, תלויים במכשור לצורך האיתור, שיטה זו עשויה שלא להציע טווח דינמי גדול או גבול עליון גבוה לגילוי. לפיכך, יש צורך assay מהיר, פחות מייגע, ורגיש יותר, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד חלבונים חשובים אלה.

כאן אנו מתארים ו דemonstrate assay מחייב nitrocellulose פותחו בקפידה, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת autophosphorylation של קינאזות היסטידין חיידקי מטוהרים במבחנה. assay זה תפוקה גבוהה יותר ונדרש זמן רב פחות מבוסס מבחני עמוד. השיטה גם מנצלת קרינת צ'רנקוב כימות phosphohistidine, המציעה גבול עליון גבוה של איתור טווח דינמי גדול. Assay יכול לשמש כדי לקבוע פרמטרים קינטיים קינאזות היסטידין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: פרוטוקול זה דורש הכשרה מתאימה השימוש וטיפול של חומרים רדיואקטיביים. השתמש בציוד מגן אישי הנדרש בעת ביצוע assay זה, כולל מיגון קרינת ביתא. פסולת רדיואקטיבית חייבת להיות מטופל בזהירות, כמו כמויות גדולות של פסולת נוצרות במהלך שלב הכביסה של הניסוי. ודא כי הפסולת מאוחסן במכל זקוף כמו דלי גדול או בקבוק כי לא יהיה דפק בקלות מעל או נשפך. לאחר הניסוי הוא סכם, ובזהירות להעביר את כל הפסולת הנוזלית כדי מסומנת כראוי מכולות פסולות רדיואקטיבית. טיפול בכל החומרים בזהירות, ולשמור מונה גייגר סמוך כדי לפקח על סביבת העבודה עבור זיהום.

הערה: פרוטוקול זה הוא גרסה מתוקנת של assay שדווח בעבר מהקבוצה שלנו. 15 יציבות Phosphohistidine ב H 3 PO 4 צריך להיבדק עבור כל קינאז היסטידין uncharacterized לפני השימוש בשיטה זו. Phosphohistidine stבמבחן יכולת תוארה בעבר. 15 כביקורת שלילית שאינו מכיל קינאז חייב להיכלל. הדבר נחוץ כדי להפחית את אות הרקע מכל מדגם, ולהבטיח כי [γ- 32 P] -ATP נשטף מספיק מן הקרום.

1. הכנת ריאגנטים וחומרים

  1. לטהר קינאזות היסטידין מתרבה חיידקים לפני שימוש assay זה.
    1. לטהר קינאז היסטידין (הגן מזהה 1,189,383) מ parahaemolyticus Vibrio (EB101, ATCC 17,802) לפיתוח assay זה. Clone קינאז לתוך וקטור ביטוי PET-23aHis-TEV באמצעות NdeI ואתרי הגבלה XhoI, ולבצע mutagenesis האתר מכוונת להניב מוטציה לבנות Vp1876 D499A.
    2. להפוך את הפלסמיד לתוך E. coli BL21 (DE3) pLysS, ולגדול תאי תקשורת TB על 37 מעלות צלזיוס. מוסף תרבויות עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו chloramphenicol (34 מיקרוגרם / מ"ל), ולגדול עם תסיסה(250 סל"ד) ל OD 600 של 0.6.
    3. להשרות ביטוי החלבון עם IPTG לריכוז סופי של 25 מיקרומטר, ולגדול תרבויות לילה ב 16 מעלות צלזיוס. קציר תאים על ידי צנטריפוגה (5,000 XG), lyse ידי sonication, צנטריפוגות כדי להסיר שאריות הסלולר (18,000 XG).
    4. לטהר את קינאז שלו מתויג באמצעות agarose Ni-נת"ע. אשר טוהר ידי SDS-PAGE. מטב טיהור עבור כל חלבון, ולאשר טוהר לפני השימוש assay זה.
  2. הכן את הפתרון לשטוף 25 מ"מ H 3 PO 4. כדי 1 ליטר של מים ללא יונים מזוקקים, להוסיף H 3 PO 4 לריכוז סופי של 25 מ"מ. ה- pH של פתרון זה הוא כ -2.0. מניחים 25 מ"מ H 3 PO 4 על הקרח.
  3. כן פתרון 13x מלאה של 325 מ"מ H 3 PO 4, לשמש כדי להרוות תגובה קינאז. ה- pH של פתרון זה הוא כ -1.5. מניחים 325 מ"מ H 3 PO 4 על הקרח.
    הערה: H 3 PO 4
  4. הכן פתרון המניות חיץ התגובה 4x המכיל 160 מ"מ טריס- HCl pH 8.0, 600 מ"מ KCl, 16 מ"מ MgCl 2, ו -40% גליצרול.
  5. לכמת ריכוז קינאז היסטידין בשיטות ריכוז חלבון נקבע (ברדפורד, UV-Vis, וכו '). 16,17 הכן פתרון קינאז היסטידין עם ריכוז שאורכו 4 פעמים את הריכוז הסופי הרצוי. כדי להשיג קליטה מתאימה, את ריכוז החלבון הסופי התגובה צריך להיות באופן אידיאלי לפחות 5 מיקרומטר.
  6. הכן radiolabeled 4x [γ- 32 P] פתרון -ATP עם ריכוז 4x המתאים של ATP ללא תווית ומסומן: יחס ללא תווית עבור הניסוי.
    הערה: כמות [γ- 32 P] -ATP שאמורים להיכלל בתמהיל זה תלוי עד כמה [^7; - 32 P] -ATP יהיה אפשר לאתרם בסופו של דבר עבור כל תגובה. השגנו קליט מתאים עם ריכוזים סופיים הנעים בין 0.1 - 5 μCi לכל תגובה. חשוב כי שכותרתו: יחס ATP ללא תווית להישמר קבוע לכל התגובות בניסוי נתון. דילולים סידוריים צריכות להתבצע כאשר ריכוזי ה- ATP מרובים הם רצויים, כמו זה גם לשמור על שכותרתו: מתמיד יחס ATP ללא תווית בכל הריכוזי. ריכוזי ATP סופיים בדרך כלל נעים בין 10 מיקרומטר לפחות 1 מ"מ, וכל ריכוז צריך להיות assayed בשלושה עותקים כדי לקבל נתונים הקינטית אמינים.
  7. 96 במנגנון כתם נקודה היטב
    1. חותכים חתיכת 8 ס"מ x 12 ס"מ של קרום nitrocellulose (0.2 מיקרומטר גודל הנקבוביות).
    2. nitrocellulose התפקיד במנגנון כתם נקודה, על מנת להבטיח כי הקרום מתאים כך במנגנון אטום, וכל הבארות מכוסות לחלוטין על ידי הקרום. אם מותקן בצורה נכונה, לא אמור להיות שום דליפת אוויר כאשר הוואקום הוא Applמטען.
    3. כדי לאסוף תסנין, לחבר את המנגנון כדי בקבוקון בצד זרוע משנית. מן הגבעול שסתום, להתחבר צינורות נאותים כך המנגנון ניתן להשתמש בנוחות בלי להטות את הבקבוק משני.
    4. חבר את הבקבוק בצד הזרוע משני למקור aspirator / ואקום.
    5. בדוק כי המנגנון אטום לחלוטין על ידי יישום ואקום למנגנון. אם המנגנון הוא מותקן בצורה נכונה, ואקום חזק יהיה נוכח בכל הבארות. כל חיבורי הצינורות ניתן עטוף Parafilm או בניילון כדי להבטיח חותם חזק.
    6. לחלופין, על מנת לבחון את הוואקום, pipet 100 μL של חיץ תגובה לתוך אחד טוב. הוואקום צריך להיות חזק מספיק כדי למשוך את כל הנוזל דרך הבאר על הממברנה.
    7. בטל ואקום עד שכל הדגימות מוכנות להיות הבחין על הממברנה.

תגובת 2. ייזום מרווה

  1. ערבוב של מרכיבי התגובה
    1. לפני initiation, להכין את כל ארבעת מרכיבי התגובה כפתרונות המניות 4x: חיץ התגובה (ראה סעיף 1.4), קינאז היסטידין (1.5), [γ- 32 P] -ATP (1.6), ו DDH 2 O.
    2. מערבבים כמויות שוות של חיץ התגובה, קינאז היסטידין, ו DDH 2 O. אפשר מרכיבי התגובה אלה לאזן בטמפרטורת החדר למשך זמן קצר (10 דקות).
      הערה: היקף התגובה הסופי הוא תלוי אם הניסוי הוא תלוי זמן, אנזים תלוי, או מצע תלוי. תגובות תלויות בזמן חייבות להיות גדולות יותר, כמו aliquots המרובה הלקוחים אותה התגובה רווה בנקודת הזמן הרצויה. היקף התגובה יהיה תלוי במספר נקודות זמן הרצוי. Assay הוא אופטימיזציה עבור כל נקודה על קרום nitrocellulose להכיל 30 μL של התגובה. לכן, אם 10 נקודות זמן הם רצויים, נפח התגובה חייב להיות לפחות 300 μL (נפח גבוה יותר כגון 330 μL יהיה עדיף במקרה של שגיאות pipetting).אנזים וניסויים תלוי מצע דורשים כמויות תגובה קטנות. היקף התגובה לניסויים אלה יכולים להיות קטנים כמו 30 μL, שכן זהו נפח סופי כי יהיה אפשר לאתרם על קרום nitrocellulose.
    3. כדי ליזום את התגובה, להוסיף נפח אחד [γ- 32 P] פתרון -ATP התגובה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. עקוב אחר זמן תגובה שחלף עם טיימר ולאפשר התגובה להמשיך במשך פרק הזמן הרצוי.
    4. כדי להרוות את התגובה, להוסיף 1/13 מנפח התגובה הכולל של קר כקרח 325 מ"מ H 3 PO 4 התגובה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. לחלופין, להוסיף aliquot של התגובה 325 מ"מ H 3 PO 4.
      הערה: הריכוז הסופי של H 3 PO 4 צריכה להיות 25 מ"מ כדי להרוות את התגובה מספיק. לדוגמה, להוסיף 2.5 μL 325 מ"מ H 3 PO 4 ל 30 תגובה μL, או להוסיף 30 μL התגובה ל -2.5 μL 325 מ"מ H 3 PO <sub> 4. ה- pH הסופי של התגובה הוא כ 4.0. ריכוז זה של H 3 PO 4 נבדק ואישר כדי להרוות את התגובה קינאז במאגר זה מבלי לפגוע באיכות phosphohistidine.
      1. לדוגמה, לערבב חיץ התגובה 7.5 μL 4x, 7.5 קינאז היסטידין μL 4x, ו -7.5 μL DDH 2 O. ליזום תגובה עם 7.5 μL [γ- 32 P] -ATP. להרוות את התגובה עם 2.5 μL 325 מ"מ H 3 PO 4.
    5. מיד למקום התגובות הרווה על הקרח עד שכל התגובות שהופסקו.
      הערה: כדי למקסם את היעילות, רצוי ליזום תגובה אחת כל 15 או 20 שניות עד שכל התגובות הם יזמו, ופעם זמן התגובה הרצוי עבר, להרוות אחד תגובה כל 15 או 20 שניות עד שכל הרווה. למי באמצעות assay בפעם הראשונה, מרווח יותר עשוי להיות יותר לניהול.

בחינה 3. of הרווה תגובות על Nitrocellulose

  1. התחל ואקום על 96-היטב במנגנון כתם נקודה
    1. מניח את המנגנון הכתם מראש התאסף נקודת 96-היטב (סעיף 1.7) לתוך מיכל משני. מיכל זה צריך להיות גדול מספיק בשביל המנגנון כדי להיות מפורקים בקלות, כמו מנגנון קרום יהיה רדיואקטיבי לאחר השימוש.
    2. החל ואקום במנגנון כתם נקודה 96-היטב.
    3. לאחר המנגנון הוא תחת ואקום, בזהירות pipet התגובה הרווה ישירות על גבי קרום nitrocellulose בכל טוב. חזור על פעולה עד כל התגובות נטענות על הממברנה. מאז קיבולת המחייב של ניטרוצלולוזה (75 - 110 מיקרוגרם / 2 ס"מ) הוא גדול מסכום של קינאז היסטידין כי הוא הבחין, ניתן להניח כי כמעט כל קינאז נקשר הממברנה כאשר נטען כהלכה.
      הערה: בהתאם המנגנון המשמש, יש להקפיד לא לנקב את nitrocellulose. שים לב שכל התגובה יצר קשר עם הnitrocellulose דואר. זה קל עבור חלק או את כל התגובה להיצמד לקירות של הבאר, ולא להגיע nitrocellulose.
    4. לשטוף את הבארות עם 100 μL של קר כקרח 25 מ"מ H 3 PO 4. זה יאפשר לכל נפח תגובה שעשויה נלכד בתוך הבאר להגיע הממברנה, הבטחת טעינה מלאה של כל התגובות. אפשר כל הנפח לזרום דרך הממברנה.
  2. פירוק מנגנון העברת קרום nitrocellulose
    1. בזהירות לפרק את המנגנון לפני שהפסיק את הוואקום. שים לב לכך הוא מנגנון קרום nitrocellulose הוא רדיואקטיביים בשלב זה. אל תסירו את כל רכיבי מנגנון מהמכל המשני בשלב זה.
    2. עם מלקחיים, בזהירות להעביר את קרום nitrocellulose מן המנגנון למיכל של כ 200 מ"ל 25 מ"מ קר כקרח H 3 PO 4. מניחים את המכסה על המיכל הזה, כמו לשטוף יהיה ראדיoactive. בשלב זה, את הוואקום ניתן לכבות.

4. Nitrocellulose עיבוד

  1. שטיפת nitrocellulose
    1. מניח את המכל עם קרום הכביסה על כיסא נדנדה. אפשר הממברנה לטלטל בעדינות במשך 20 דקות.
    2. לאחר 20 דקות, בזהירות למזוג את הפתרון לשטוף בשימוש לדלי גדול שישמש לאחסון פסולת זמני. הוסף 200 מ"ל של 25 קר כקרח מ"מ H 3 PO 4 קרום וחזור.
      הערה: לפחות שלוש 20 שטיפות דקות הדרושים להסרת רקע [γ- 32 P] אות -ATP מן הקרום. לאחר לשטוף השלישי, לבחון את הפתרון לשטוף המשמש קרינה עם מונה גייגר. המשך שטיפת הממברנה כמתואר לעיל עד אין אות שוהה הפתרון לשטוף.
  2. ייבוש nitrocellulose
    1. לאחר הממברנה נשטף מספיק, מאפשרים הממברנה לייבוש באוויר בקצרה. זה בדרך כלל לוקח 5 דקות או פחות.

5. חשיפת מסך זרחני החפץ

הערה: אזור זה הוא אופציונאלי. חשיפת הממברנה למסך זרחן הוא מועיל בכך שהוא מאפשר להדמיה של עוצמת קינאז רדיואקטיבי בכל נקודה על הממברנה. את העוצמה היחסית של כתמים אלה עומד ביחס ישר לכמות של קינאז היסטידין פוספורילציה בכל נקודה. עוצמת ניתן לכמת עם תוכנת עיבוד תמונה, ותוצאות אלה ניתן להשוות לזו הנוצרת ממדור 7. יתר על כן, שלב זה מאפשר בקרת איכות. חריגות לראות סריקה זו עשויות להסביר תוצאות חריגות המתקבלות ספירת נצנץ.

  1. הכנת מסך זרחני
    1. לפני חשיפת הממברנה למסך זרחן אחסון, לחשוף את מסך זרחן אור לבן דקות לפחות 5. הדבר מבטיח כי כל תמונה שנותרה שתוחזק על ידי המסך נמחקת.
    2. ודא שהמסך נקיויבש. במידת הצורך, נקו בעדינות את המסך עם פתרון ניקוי מסך זרחן אושרה על ידי היצרן המסך, ולנגב יבש.
  2. הכנת הממברנה Nitrocellulose
    1. בזהירות לעטוף את קרום nitrocellulose היבש באריזה אטומה פלסטיק דק כדי למנוע רטיבות שיורית מפגיעת מסך זרחן. ודא כי אין קמטים או בועות.
  3. חשיפה למסך זרחן
    1. מניחים את קרום nitrocellulose עטוף הקלטת מסך זרחן אחסון, הנח את הפנים כלפי מטה המסך על הממברנה, ולסגור את הקלטת. אל תפתחו את הקלטת או להזיז את הממברנה עד זה הזמן כדי לסרוק את המסך זרחן, כמו הסטה הממברנה במהלך החשיפה תגרום דימוי כפול או מרוח להיות בשבי.
    2. לחשוף לפחות 4 שעות, או כל עוד יצרן פוספור המסך עולה.
    3. לאחר החשיפה הושלמה, לסרוק את המסך פוספור ללכוד את התמונה עם סורק זרחן.

6. הכנת ממברנה Nitrocellulose לספירת נצנץ

  1. Ponceau S מכתים destaining
    1. בקצרה לטבול את קרום nitrocellulose בתמיסה מכתים S Ponceau (0.1% Ponceau S (w / v) 5% חומצה אצטית) עבור 1 - 2 דקות. להרטיב את הממברנה כולה עם הכתם לפני destaining.
    2. למזוג עודף Ponceau S מן הקרום.
    3. יש לשטוף את הממברנה עם DDH 2 O עד שרק כתמים מן קינאז היסטידין מגואלות. שים לב כי נוהל זה יעבוד רק אם כל הכתמים מכילים כמויות לגילוי של חלבון.
      הערה: שלב זה הוא הכרחי על מנת לאשר כי קינאז מאוגד nitrocellulose, וכי טעינת החלבון היא גם לאורך כל הכתמים. זה גם מאפשר קינאז הבחין להיות לגזור בקלות מן הקרום.
  2. חיתוך החוצה כתמים
    1. בעזרת מספריים, לגזור כל נקודה על קרום nitrocellulose. אין זה הכרחי כדי לחתוך בצורה מושלמת אלוןg קץ לכתם; אם הממברנה נשטף מספיק, רקע בשל גודל משתנה של כתמים לגזור יהיה זניח. חשוב רק כדי לחתוך את המקום כולו עבור כל תגובה.
    2. בעזרת מלקחיים, בזהירות להעביר כל נקודה לתוך צלוחיות נצנץ. אין קוקטייל הנצנץ הוא הכרחי כמו P 32 ניתן לזהות בקלות על ידי קרינת צ'רנקוב.
      הערה: לחלופין, במקום ניתן לגזור באמצעות מקדח פקק חדד. הסר כל נקודה מן nitrocellulose עם דקור הפקק, ולדחוף אותו לתוך בקבוקון נצנץ עם סיכה. באמצעות שיטה זו, הקרום לא צריך להיות נגע, מזעור חשיפה לקרינה נוסף.
  3. CPM / pmol של פתרון קביעת [γ- 32 P] -ATP
    1. ספוט כמה דילולים של [γ- 32 P] פתרון -ATP (סעיף 1.5) על 1 ס"מ x 1 ס"מ ריבועים של nitrocellulose. בקצרה אוויר יבש.
    2. בעזרת מלקחיים, להעביר כל ריבוע בזהירות לתוך נצנץבקבוקונים. אין קוקטייל נצנץ הוא הכרחי. דגימות אלה ישמשו כדי ליצור עקומת תקן לקביעת CPM / pmol של הפתרון ATP.

ספירת נצנץ 7.

  1. טען את כל בקבוקוני הנצנץ לתוך קלטות מונה נצנץ. קלטות טענו לתוך מונה נצנץ.
  2. לבצע תוכנית ספירת הנצנץ למדוד CPM עבור כל בקבוקון. נתונים אלה, יחד עם ה- CPM / pmol של תמהיל ATP רדיואקטיבי (מסעיף 6.3), שניתן להשתמש בהם כדי לחשב את כמות קינאז היסטידין פוספורילציה נוכחים בכל מקום, ולכן שיעור autophosphorylation. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סט נתוני נציג נוצר שמציע תמונה שצולמה עם תרמי פוספור (איור 1), Ponceau S כתם של קרום nitrocellulose (איור 2), ונתוני ספירת נצנץ (איור 3). איור 3 א מציג את קבועי הקינטית האנזים מגרש Lineweaver-בורק. תוצאות אלו התקבלו באמצעות קינאז היסטידין מטוהר מן parahaemolyticus Vibrio מיני גראם שלילי (גן מזהה 1,189,383). הפרוטוקול המשמש לטהר קינאז זה מתואר בסעיף 1.1. ריכוז קינאז הסופי התגובה היה 7.5 מיקרומטר. ריכוזי ATP הסופיים נעים בין 0 מיקרומטר 1.28 מ"מ. ה [γ- 32 P] פתרון -ATP היה ATP 171.97 CPM / pmol. נתונים אלה יכולים להיווצר ביום אחד באמצעות ההליך שתיארנו.

/55129/55129fig1.jpg "/>
איור 1: מכתים S Ponceau של קרום nitrocellulose. Ponceau כתם מראה קינאז חייב קרום nitrocellulose. הקרום היה מנוקד תגובות המכילות ריכוזים שונים של ATP, אך ריכוז קינאז מתמיד. אין חלבון מזוהה כתמי הבקרה לא-kinase (4 th ו -8 בשורת ה). הפתרון המכתים S Ponceau הורכב 0.1% Ponceau S (w / v) חומצה אצטית 5%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תוצאות Fluorography. תמונה סרוקה של פוספור מסך שנחשף אל קרום nitrocellulose. הקרום היה מנוקד תגובות המכיל conריכוז קינאז stant, וריכוזים שונים של ATP. ריכוז כל היה assayed בשלושה עותקים. בכל ריכוז, אין שליטת קינאז נכללה (4 th ו -8 בשורת ה) על מנת להוכיח כי radiolabeled ATP נמחק לחלוטין מן הקרום במהלך שלב הכביסה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: נתוני ספירת נצנץ. א) העלילה פעמיים גומלין של autophosphorylation של קינאז היסטידין. עקומת מצע-התלות נוצרה מתוך ספירת נצנץ. היווצרות Phosphohistidine חושבה באמצעות שיפוע איור 3B (CPM / pmol ATP), אשר נוצר גם עם SCספקטרומטריית intillation. B) עקומת תקן של CPM / pmol של ATP. השיפוע משמש כדי לחשב את הסכום של phosphohistidine (pmol) נוכח כל דגימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nitrocellulose מחייב assay שתיארנו יש יתרונות רבים על פני שיטות השתמשו בעבר כדי לאפיין קינאזות היסטידין. בהשוואת autoradiography SDS / עמוד מבוסס מסורתי, השיטה שלנו היא תפוקה גבוהה יותר ופחות זמן רב. קרום nitrocellulose הוא יותר קל לטפל מאשר ג'ל SDS, ואינו צריך להיות קבוע. Ponceau מכתים את nitrocellulose מאפשר כתמי החלבון להיות דמיינו. זה מספק דרך קלה לגזור כל נקודה עבור ספירת נצנץ, ולקבוע כי טעינת חלבון עקבית לאורך כל הכתמים. ספירת נצנץ של כל נקודה ונקודה מספקת תוצאות מדויקות כי ניתן להמיר בקלות למהירות תגובה באמצעות השיפוע עקום הסטנדרט שמוצג באיור 3 ב.

למרות חשיפת קרום nitrocellulose למסך זרחן אחסון מוסיף זמן במח"מ הכולל של הניסוי, שלב זה מציע תובנה להצלחת סופג. כלפערים כי הם הבחינו בנתוני ספירת נצנץ ניתן להסביר באופן פוטנציאלי על ידי תמונת זרחן משלימה. אם, למשל, הקרום לא נשטף מספיק, תמונת זרחן תגלה את המידע הזה. Fluorography של הקרום מומלץ לכל מי מתכנן להשתמש assay זה, כמו את התוצאות של שלב זה יכולה להיות חתיכה יקרה של מידע משלים.

יתרון משמעותי נוסף של assay זה הוא היכולת להפיק נתונים על ספירת נצנץ. חיתוך החוצה כל נקודה יחידה עבור ספירת נצנץ הוא עדיף על השימוש בתוכנה לעיבוד תמונות כדי לכמת עוצמת להקה, כפי בדרך כלל נעשה עבור מבחנים מבוססי עמוד. הגבול העליון והטווח דינמי לגילוי גבוה בהרבה עם ספירת נצנץ. יצירת עקומת סטנדרט לקביעת ATP CPM / pmol לעשות את זה קל לחשב את שיעור autophosphorylation מן הנתונים הגולמיים. באמצעות שיטה זו, אנו מסוגלים לזהות באופן מדויקpicomoles של המוצר פוספורילציה.

למרות היתרונות הרבים של שימוש בשיטה שלנו, זה לא בלי מגבלות. השיטה שלנו אינה מבחינה בין 1-phosphohistidine ו -3-phosphohistidine. למרות נוגדנים phosphohistidine ניתן להשתמש כדי להבחין בין מוצרים פוספורילציה אלה, השיטה שלנו עדיין יש את היתרון של ניצול קרינת צ'רנקוב לכמת זירחון. הקרינה צ'רנקוב מספק טווח דינמי גדול גבול עליון גבוה לגילוי. בהתאם לשיטה של ​​איתור, באמצעות נוגדנים לכמת היווצרות phosphohistidine סובל מאי גבול עליון פחות וטווח דינמי. השיטה שלנו היא מוגבלת גם בשימוש עם חלבונים מטוהרים, ולא יכול לשמש כדי לזהות קינאזות פוספורילציה in vivo. השיטה שלנו דורש המצע רדיואקטיבי, אשר יהיה בו כדי להרתיע מעבדות כי אינם מצוידים עבור רדיואקטיביות. בסופו של דבר, שיטה זו מתאימה בעיקר עבור מעבדות מצוידות כבר לטפלרדיואקטיביות, והם מעוניינים תפוקה גבוהה יותר ופחות זמן רב אלטרנטיבה בשימוש תדיר טכניקות SDS-PAGE ללמוד קינאזות היסטידין. אלה הלומדים שירו ​​/ Thr / קינאזות Tyr גם עשויים למצוא בשיטה זו כדי להועיל, למרות השפע היחסי של שיטות חלופיות לחקר חלבונים אלה.

אפיון של קינאזות היסטידין כבר חמקמק ארוך למרות התקדמות בשיטות לכמת סוגים אחרים של קינאזות. עם assay זה, אנו עשויים להתחיל לאפיין אלה חלבונים ביולוגיים רלוונטיים עדיין לא ידוע ולא מובנים. קידום זה מתודולוגיה לכימות autophosphorylation קינאז היסטידין בסופו של דבר ישפר את הבנתנו של שני מרכיבי איתות חיידקים. assay זה יהיה כלי רב ערך כפי שאנו לחקור את ההשפעה של גירויים מאותו מקור אינטראקציות חלבון-חלבון על פעילות קינאז היסטידין במסלולים דו רכיבי איתות שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך באמצעות סיוע בוגר תחומי תכנית צורך הלאומי (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics