Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Biochemistry

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Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

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Abstract

Introduction

Adaptive Reaktion ist von entscheidender Bedeutung für die bakterielle Überlebenszeit. Um Umweltveränderungen zu erfassen und zu reagieren, können Bakterien, die eine Stimulus-Antwort-System als Zweikomponenten-Signalisierung bekannt. 1,2 In einem typischen Zweikomponentensystem wird die Histidinkinase detektiert einen kognaten Stimulus, autophosphoryliert seinen konservierten Histidinrest, überträgt dann Phosphat zu einem konservierten Aspartatrest auf dem Empfänger - Domäne eines Response - Regulator - Protein. 3 Dieses Ereignis löst eine Veränderung in der Aktivität des Antwortregulator, der ein stromabwärtiges Effekt anregt. 4,5 Daher Bakterien können zu Veränderungen in der lokalen Umgebung zu erfassen und anzupassen. Einige Zwei-Komponenten-Signalanlagen weichen von diesem Urbild. In einigen Fällen ist die sensorische Domäne der Histidinkinase eine Stand-alone-Protein, das direkt die Sinnes erkennt und modifiziert Kinase-Aktivität durch eine Protein-Protein-Interaktion. 6 - 8 jedoch der Fondsamental Verfahren und allgemeine Rolle des Systems bleibt gleich. Zweikomponenten-Signalisierung ist ein allgegenwärtiges Stimulus-Antwort-System, das essentiell für das Überleben bakterieller ist und Histidin-Kinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Transduktion des Signals. 9

Trotz der Bedeutung von Histidin-Kinasen bakterielle biology, bleiben sie schlecht charakterisiert. Dies ist aufgrund der inhärenten Instabilität von Phosphohistidin, und das Fehlen eines praktischen Verfahrens zur Messung Autophosphorylierung. Phosphohistidin ist labiler als Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin. 10 So Techniken , die häufig verwendet werden , Ser / Thr / Tyr - Kinasen sind nicht anwendbar für Histidinkinasen zu analysieren. 11 In - vitro - Assays Histidin - Kinasen zu untersuchen wurden weitgehend auf SDS-PAGE - Autoradiographie beschränkt. 12,13 In diesem Verfahren [γ- 32 P] -ATP ist mit der Kinase inkubiert, und die Phosphorylierung der Kinase wird durch pol analysiertyacrylamide Gelelektrophorese (PAGE), gefolgt von Autoradiographie des Gels. Dieses Verfahren kann verwendet werden kinase Autophosphorylierung zu überwachen sowie Phosphotransfer aus der Kinase zu einem Antwortregulator. Jedoch hat dieses Verfahren bemerkenswerte Mängel. PAGE-basierten Assays sind niedrigen Durchsatz und zeitraubend. Solche Einschränkungen sind nicht förderlich für ein Protein zu charakterisieren, und seine kinetischen Parameter ermitteln. Eine alternative Methode Histidinkinasen für die Untersuchung, die vor kurzem nutzt Phosphohistidindomäne Antikörper veröffentlicht wurde Autophosphorylierung zu erkennen. 14 Während dieses Verfahren den Vorteil des Unterscheidens zwischen 1-und 3-Phosphohistidin Phosphohistidin hat, abhängig von der Instrumentierung zur Detektion verwendet, ist diese Methode nicht einen großen Dynamikbereich und hohe obere Nachweisgrenze anbieten. Somit besteht ein Bedarf für eine schnellere, weniger arbeitsaufwendig und empfindlicher Assay, der verwendet werden kann, diese wichtigen Proteine ​​zu untersuchen.

Hier beschreiben wir und demonstrate eine sorgfältig entwickelte Nitrocellulose - Bindungsassay, der verwendet werden kann , die Autophosphorylierung des gereinigten bakteriellen Histidin - Kinasen in vitro zu quantifizieren. Dieser Assay ist ein höherer Durchsatz und weniger zeitraubend als PAGE-basierten Assays. Das Verfahren verwendet auch Cherenkov-Strahlung für Phosphohistidin Quantifizierung, die eine hohe obere Grenze der Detektion und einen großen Dynamikbereich bietet. Der Assay kann verwendet werden, um die kinetischen Parameter für Histidin-Kinasen bestimmen.

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Protocol

Vorsicht: Dieses Protokoll erfordert eine entsprechende Ausbildung in der Verwendung und Umgang mit radioaktiven Stoffen. Bitte verwenden Sie die erforderliche persönliche Schutzausrüstung bei der Durchführung dieses Tests, einschließlich der Beta-Strahlung Abschirmung. Radioaktive Abfälle müssen sorgfältig behandelt werden, da große Mengen an Abfall während der Waschphase des Experiments erzeugt werden. Stellen Sie sicher, dass die Abfälle in einem aufrechten Behälter wie einem großen Eimer oder Flasche aufbewahrt wird, die nicht leicht umkippen wird oder verschüttet. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, übertragen sorgfältig alle flüssigen Abfall radioaktive Abfallbehälter in geeigneter Weise zu kennzeichnen. Behandeln Sie alle Materialien mit Sorgfalt und halten in der Nähe einen Geigerzähler auf den Arbeitsbereich für die Verschmutzung zu überwachen.

Hinweis: Dieses Protokoll ist eine überarbeitete Version eines zuvor berichteten Assay aus unserer Gruppe. 15 Phosphohistidin Stabilität in H 3 PO 4 sollte vor der Verwendung dieses Verfahrens für jede uncharacterized Histidinkinase getestet werden. Die Phosphohistidindomäne stFähigkeitstest wurde zuvor beschrieben. 15 Eine negative Kontrolle , die nicht - Kinase enthält muss enthalten sein. Dies ist notwendig, um das Hintergrundsignal von jeder Probe zu subtrahieren, und sicherzustellen , dass [γ- 32 P] -ATP ausreichend von der Membran gewaschen wird.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Materialien

  1. Reinige Histidinkinasen aus Bakterienkultur vor diesen Test zu verwenden.
    1. Reinige eine Histidinkinase (Gen ID 1.189.383) von Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) für die Entwicklung dieses Assays. Klonen Sie die Kinase in den Expressionsvektor pET-23aHis-TEV mit NdeI und XhoI-Restriktionsstellen und führen zielgerichtete Mutagenese das mutierte Konstrukt Vp1876 D499A zu ergeben.
    2. Transformation des Plasmids in E. coli BL21 (DE3) pLysS, und wachsen in Zellen TB Medium bei 37 ° C. Supplement Kulturen mit Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (34 ug / ml), und wachsen unter Rühren(250 rpm) auf eine OD 600 von 0,6.
    3. Induzieren Proteinexpression mit IPTG bis zu einer Endkonzentration von 25 uM und wachsen Kulturen über Nacht bei 16 ° C. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g), lyse durch Beschallung und Zentrifuge zu entfernen, Zelltrümmer (18.000 xg).
    4. Reinige den His-Tag-Kinase-Ni-NTA-Agarose verwendet wird. Bestätigen die Reinheit durch SDS-PAGE. Optimieren Reinigung für jedes Protein und bestätigen Reinheit vor diesen Test zu verwenden.
  2. Bereiten Sie die 25 mM H 3 PO 4 Waschlösung. Auf 1 l entionisiertes Wasser destilliert, addieren H 3 PO 4 zu einer Endkonzentration von 25 mM. Der pH-Wert dieser Lösung beträgt etwa 2,0. Legen Sie 25 mM H 3 PO 4 auf dem Eis.
  3. Bereiten Sie eine 13x Stammlösung von 325 mM H 3 PO 4, verwendet werden Kinase - Reaktion abzuschrecken. Der pH-Wert dieser Lösung beträgt etwa 1,5. Platzieren 325 mM H 3 PO 4 auf dem Eis.
    HINWEIS: H 3 PO 4
  4. Bereiten Sie eine 4 - fach Reaktionspuffer Stammlösung , die 160 mM Tris-HCl pH 8,0, 600 mM KCl, 16 mM MgCl 2 und 40% Glycerin.
  5. Quantifizierung Histidinkinase Konzentration von etablierten Proteinkonzentration Verfahren (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Vorbereiten einer Histidinkinase Lösung mit einer Konzentration , die 4 - fache der gewünschten Endkonzentration. Um eine angemessene Signal zu erhalten sollte die endgültige Proteinkonzentration in der Reaktionsidealerweise mindestens 5 & mgr; M sein.
  6. Bereiten Sie eine 4x radiomarkierte [γ- 32 P] -ATP Lösung mit dem entsprechenden 4 - fach - Konzentration von unmarkiertem ATP und beschriftet: unmarkierten Verhältnis für das Experiment.
    HINWEIS: Die Menge von [γ- 32 P] -ATP , die in dieser Mischung enthalten sein sollte , ist davon abhängig , wie viel [^7; - 32 P] -ATP wird letztlich für jede Reaktion beobachtet werden. Wir haben angemessene Signal erhalten mit Endkonzentrationen im Bereich zwischen 0,1 bis 5 & mgr; Ci pro Reaktion. Es ist wichtig, daß das markierte: unmarkiertem ATP-Verhältnis für alle Reaktionen in einem gegebenen Experiment konstant gehalten werden. Reihenverdünnungen sollte gemacht werden, wenn mehrere Konzentrationen ATP gewünscht werden, wie dies auch das markierte halten: unbenannt ATP-Verhältnis konstant in allen Konzentrationen. Endgültige ATP-Konzentrationen liegen typischerweise im Bereich von 10 um bis mindestens 1 mM, und jede Konzentration sollte in dreifacher Ausführung untersucht werden, um zuverlässige kinetische Daten zu erhalten.
  7. 96- und Dot-Blot-Vorrichtung
    1. Cut eine 8 cm x 12 cm Stück Nitrocellulosemembran (0,2 & mgr; m Porengröße).
    2. Position Nitrocellulose in einem Dot-Blot-Vorrichtung, so dass die Membran passt, so dass die Vorrichtung abgedichtet ist, und alle Vertiefungen werden vollständig von der Membran bedeckt. Wenn es richtig zusammengebaut haben, sollte kein Luftverlust, wenn das Vakuum Appl istied.
    3. So sammeln Filtrat, schließen Sie das Gerät an einen sekundären Seitearm Kolben. Von dem Ventilschaft, schließen ausreichende Schlauch, so daß die Vorrichtung bequem ohne Kippen der Sekundärkolben verwendet werden kann.
    4. Schließen Sie den sekundären Seitearm Kolben Absauger / Vakuumquelle.
    5. Prüfen Sie, daß das Gerät vollständig durch Anlegen eines Vakuums an die Vorrichtung abgedichtet ist. Wenn die Vorrichtung korrekt montiert wird, wird ein starkes Vakuum in allen Vertiefungen vorhanden sein. Alle Schlauchverbindungen können in Parafilm umwickelt werden oder Saran Wrap eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
    6. das Vakuum, zu testen Pipette 100 ul Reaktionspuffer in einem gut Optional. Das Vakuum sollte stark genug sein, um die gesamte Flüssigkeit durch die gut und auf die Membran zu ziehen.
    7. Schalten Sie Vakuum, bis alle Proben bereit sind, auf der Membran entdeckt werden.

2. Reaktion Initiation und Abschreckungs

  1. Das Mischen von Reaktionskomponenten
    1. Vor initiation, bereiten alle vier Reaktionskomponenten als 4x - Stammlösungen: Reaktionspuffer, Histidin - Kinase (1,5), [γ- 32 P] -ATP (1,6) und ddH 2 O (siehe Abschnitt 1.4)
    2. Mischungs gleichen Volumina von Reaktionspuffer, Histidinkinase und ddH 2 O. erlauben diese Reaktionskomponenten bei Raumtemperatur für eine kurze Zeit (10 min) zu äquilibrieren.
      HINWEIS: Das endgültige Reaktionsvolumen in Abhängigkeit davon ist, ob das Experiment ist zeitabhängig, enzymabhängige oder substratabhängig. Zeitabhängige Reaktionen muss größer sein, als mehrere Aliquots aus der gleichen Reaktion entnommen und an der gewünschten Zeitpunkt abgeschreckt. Das Reaktionsvolumen wird von der Anzahl von Zeitpunkten abhängen, erwünscht. Der Test wird für jeden Punkt auf der Nitrocellulosemembran optimierte 30 & mgr; l der Reaktion enthält. Somit werden, wenn 10 Zeitpunkten gewünscht, kann das Reaktionsvolumen mindestens 300 & mgr; l sein muß (ein höheres Volumen, wie beispielsweise 330 & mgr; l würde im Falle von Pipettierfehler bevorzugt sein).Enzym und Substrat abhängige Experimente erfordern kleinere Reaktionsvolumina. Das Reaktionsvolumen für diese Experimente als 30 & mgr; L klein sein, da dies das Endvolumen, das auf der Nitrocellulosemembran getüpfelt wird.
    3. Um die Reaktion zu initiieren, fügen Sie ein Volumen von [γ- 32 P] -ATP Lösung für die Reaktion und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Spur verstrichene Reaktionszeit mit einem Zeitgeber und damit die Reaktion für die gewünschte Zeit fortschreiten.
    4. Um abzuschrecken , die Reaktion, fügen 1/13 des gesamten Reaktionsvolumen von eiskaltem 325 mM H 3 PO 4 zur Reaktion und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Alternativ kann ein Aliquot der Reaktion auf 325 mM H 3 PO 4 hinzuzufügen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration an H 3 PO 4 sollte 25 mm betragen, ausreichend um die Reaktion abzuschrecken. Fügen Sie zum Beispiel 2,5 & mgr; l 325 mM H 3 PO 4 bis 30 & mgr; l - Reaktion, oder fügen Sie 30 ul Reaktion auf 2,5 & mgr; l 325 mM H 3 PO <sub> 4. Der endgültige pH-Wert der Reaktion beträgt etwa 4,0. Diese Konzentration von H 3 PO 4 wurde getestet und bestätigt die Kinasereaktion in diesem Puffer zu löschen , ohne Phosphohistidin verschlechtern.
      1. Zum Beispiel, 7,5 ul 4x Reaktionspuffer, 7,5 ul 4x Histidinkinaseregion und 7,5 & mgr; l ddH 2 O Initiate Reaktion mit 7,5 & mgr; l [γ- 32 P] -ATP mischen. Quenche die Umsetzung mit 2,5 & mgr; l 325 mM H 3 PO 4.
    5. Ab sofort abgeschreckt Reaktionen auf Eis legen, bis alle Reaktionen wurden beendet.
      HINWEIS: die Effizienz zu maximieren, ist es ratsam, alle 15 oder 20 s, bis alle Reaktionen initiiert eine Reaktion zu initiieren, und sobald die gewünschte Reaktionszeit alle 15 oder 20 s eine Reaktions passiert hat, zu löschen, bis alle abgeschreckt werden. Für diejenigen, die den Test zum ersten Mal verwenden, ein längeres Intervall kann besser handhabbar sein.

3. Spek of Abgeschreckte Reaktionen auf Nitrocellulose

  1. Starten Sie Vakuum auf 96-Well-Dot-Blot-Vorrichtung
    1. Legen Sie die vormontierten 96-Well-Dot-Blot-Vorrichtung (Abschnitt 1.7) in einen zweiten Behälter. Dieser Behälter sollte groß genug sein, um die Vorrichtung leicht demontiert in werden, da die Vorrichtung und die Membran nach der Verwendung radioaktiv sein.
    2. Bewerben Vakuum auf den 96-Loch-Dot-Blot-Apparatur.
    3. Sobald das Gerät unter Vakuum ist, sorgfältig pipettieren die gestoppten Reaktion direkt auf die Nitrocellulosemembran in jeder Vertiefung. Wiederholen, bis alle Reaktionen auf die Membran geladen werden. Da die Bindungskapazität der Nitrocellulose (75-110 & mgr; g / cm 2) größer als die Menge an Histidin - Kinase , die getupft wird, kann angenommen werden , dass fast alle der Kinase an die Membran bindet , wenn es richtig geladen.
      HINWEIS: Je nach Gerät verwendet, muss darauf geachtet werden, nicht die Nitrocellulose zu durchstechen. Man beachte, daß das gesamte Reaktions Kontakt mit th gemachte Nitrocellulose. Es ist einfach für einige oder alle der Reaktion auf die Wände des Bohrlochs zu bleiben, und nicht die Nitrocellulose erreichen.
    4. Waschen Sie die Vertiefungen mit 100 & mgr; l eiskaltem 25 mM H 3 PO 4. Dadurch werden alle Reaktionsvolumen ermöglichen, die in der gut gefangen worden sein, die Membran und stellt die komplette Beladung aller Reaktionen zu erreichen. Lassen Sie das gesamte Volumen durch die Membran zu fließen.
  2. Vorrichtung Demontage und Nitrocellulosemembran übertragen
    1. Vorsichtig zerlegen das Gerät , bevor Sie das Vakuum abgeschaltet wird. Darauf hingewiesen, dass sowohl die Vorrichtung und Nitrocellulosemembran in dieser Zeit radioaktiv sind. Sie zu diesem Zeitpunkt nicht alle Gerätekomponenten aus dem Sekundärbehälter zu entfernen.
    2. Mit einer Pinzette, übertragen sorgfältig die Nitrocellulosemembran aus der Vorrichtung in einen Behälter mit ungefähr 200 ml 25 mM eiskaltem H 3 PO 4. Legen Sie einen Deckel auf diesem Behälter, wie die Wasch radi seinoactive. Zu diesem Zeitpunkt kann der Unterdruck abgeschaltet.

4. Die Verarbeitung Nitrocellulose

  1. Nitrowasch
    1. Stellen Sie den Behälter mit der Wasch Membran auf einer Wippe. Lassen Sie die Membran sanft für 20 Minuten zu rocken.
    2. Nach 20 Minuten dekantieren sorgfältig die verwendete Waschlösung in einen großen Eimer für die vorübergehende Lagerung von Abfällen genutzt werden. In 200 ml eiskaltem 25 mM H 3 PO 4 an die Membran und wiederholen.
      HINWEIS: Mindestens drei 20 min Waschungen sind notwendig Hintergrund zu entfernen [γ- 32 P] -ATP Signal von der Membran. Nach dem dritten Waschen, testen Sie die verwendeten Waschlösung für Strahlung mit einem Geigerzähler. Weiterhin das Waschen der Membran wie oben beschrieben, bis kein Signal in der Waschlösung vorhanden ist.
  2. Nitrocellulose Trocknen
    1. Nachdem die Membran ausreichend gewaschen wird, damit die Membran zu kurz an der Luft trocknen lassen. Dies dauert typischerweise 5 min oder weniger.

5. Die Exposition gegenüber Storage Phosphor Screen

Hinweis: Dieser Abschnitt ist optional. Aussetzen der Membran einem Leuchtstoffschirm ist in vorteilhaft, dass es ermöglicht die Sichtbarmachung der Intensität von radiomarkiertem kinase in jedem Punkt auf der Membran. Die relative Intensität dieser Punkte ist der Menge an phosphoryliertem Histidinkinase in jedem Punkt direkt proportional. Die Intensität kann mit Bildverarbeitungs-Software quantifiziert werden, und diese Ergebnisse können mit denen aus dem Abschnitt 7. Weiterhin erzeugt verglichen werden, wird dieser Schritt ermöglicht eine Qualitätskontrolle. Abnormalitäten in diesem Scan gesehen könnte unregelmäßige Ergebnisse aus Szintillationszählung erhalten erklären.

  1. Phosphor-Bildschirm Vorbereitung
    1. Vor der Membran an der Speicherleuchtstofffolie zu Belichten belichten den Leuchtstoffschirm mit weißem Licht für mindestens 5 min. Dadurch wird sichergestellt, dass jede Restbild, das von dem Bildschirm gehalten werden kann, wird gelöscht.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Bildschirm ist sauberund trocken. Falls notwendig, reinigen sanft den Bildschirm mit einer Lösung Phosphorschirm Reinigung durch den Bildschirm-Hersteller zugelassen und trocken wischen.
  2. Nitrocellulosemembran-Zubereitung
    1. wickeln Sie vorsichtig die trockene Nitrocellulosemembran in einer dünnen Plastikfolie Restfeuchtigkeit zu verhindern, dass der Phosphorschirm zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass es keine Falten oder Blasen sind.
  3. Die Exposition gegenüber Phosphorschirm
    1. Legen Sie die eingewickelt Nitrocellulosemembran in dem Speicherleuchtschirm-Kassette, legen Sie die Bildschirmseite nach unten auf die Membran, und schließen Sie die Kassette. Die Kassette nicht öffnen oder die Membran zu bewegen, bis es Zeit ist, den Phosphorschirm zu scannen, als Membranverschiebung während der Belichtung ein Doppel- oder verschmiert verursacht Bild erfasst werden.
    2. Expose für mindestens 4 h oder so lange, wie der Phosphorschirm Hersteller empfiehlt.
    3. Sobald Belichtung abgeschlossen ist, scannen Sie den Phosphorschirm und nehmen Sie das Bild mit einem Phosphor Scanner.

6. Vorbereitung Nitrocellulose-Membran für Szintillationszählung

  1. Ponceau S-Färbung und Entfärbung
    1. Die Nitrocellulosemembran in Ponceau S-Färbelösung (0,1% Ponceau S (w / v) in 5% Essigsäure) für 1 kurz eintauchen - 2 min. Befeuchten Sie die gesamte Membran mit den Fleck vor der Entfärbung.
    2. Dekantieren überschüssige Ponceau S von der Membran.
    3. Spülen Sie die Membran mit ddH 2 O , bis nur noch die Punkte aus der Histidinkinaseregion gefärbt sind. Man beachte, dass dieses Verfahren funktioniert nur, wenn alle Spots nachweisbaren Mengen an Protein enthalten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um zu bestätigen, dass die Kinase an die Nitrocellulose gebunden ist, und das Proteinbeladung ist auch in allen Flecken. Es ermöglicht auch die gepunktete Kinase leicht aus der Membran herausgeschnitten werden.
  2. Ausschneiden Flecken
    1. Mit einer Schere ausschneiden jeden Fleck auf der Nitrocellulosemembran. Es ist nicht notwendig zu schneiden perfekt Along die Kante des gefärbten Fleck; wenn die Membran ausreichend gewaschen, Hintergrund aufgrund unterschiedlicher Größe von Flecken ausgeschnitten unerheblich. Es ist nur wichtig, dass der gesamte Punkt für jede Reaktion auszuschneiden.
    2. Mit einer Pinzette, übertragen sorgfältig jeden Fleck in Szintillationsgefäße. Kein Szintillationscocktail ist notwendig , da die 32 P leicht nachweisbar durch Cherenkov - Strahlung ist.
      HINWEIS: Alternativ kann die Stelle mit einem geschärften Korkbohrer ausgeschnitten werden. Entfernen Sie jede Stelle aus der Nitrocellulose mit dem Korken Borer, und schieben Sie es in ein Szintillationsphiole mit einem Stift. Bei diesem Verfahren wird die Membran muss nicht berührt werden, weitere Strahlenbelastung zu minimieren.
  3. Die Bestimmung CPM / pmol [γ- 32 P] -ATP Lösung
    1. Punkt mehrere Verdünnungen von [γ- 32 P] -ATP - Lösung (Abschnitt 1.5) auf 1 cm x 1 cm große Quadrate aus Nitrocellulose. Kurz Luft trocknen lassen.
    2. Mit einer Pinzette, übertragen sorgfältig jedes Quadrat in ScintillationsFläschchen. Kein Szintillationscocktail notwendig. Diese Proben werden verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen, um die CPM / pmol der ATP-Lösung zu bestimmen.

7. Szintillationszählung

  1. Laden Sie alle Szintillationsgefäße in Szintillationszähler Kassetten. Legen Sie Kassetten in Szintillationszähler.
  2. Führen Sie Szintillationszählung Programm CPM für jedes Fläschchen messen. Diese Daten, zusammen mit dem CPM / pmol des radioaktiv markierten ATP-Mix (aus dem Abschnitt 6.3) kann verwendet werden, um die Menge an phosphoryliertem Histidinkinase, die in jedem Punkt zu berechnen, und somit die Rate der Autophosphorylierung. 18,19

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Representative Results

Eine repräsentative Datensatz wurde ein Bild mit eingefangen mit einer Phosphor - Imager (Abbildung 1), Ponceau S - Färbung der Nitrocellulosemembran (Abbildung 2), und Szintillationszählung Daten (Abbildung 3) erzeugt. 3A zeigt die enzymkinetischen Konstanten in einem Lineweaver-Burk-Diagramm. Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung eines gereinigten Histidinkinaseregion aus dem gramnegativen Spezies Vibrio parahaemolyticus (Gen - ID 1189383) erhalten. Das Protokoll verwendet, um dieses Kinase zu reinigen, wird in Abschnitt 1.1 beschrieben. Die endgültige kinase-Konzentration in der Reaktion betrug 7,5 uM. Die endgültigen ATP-Konzentrationen lagen im Bereich von 0 & mgr; M bis 1,28 mM. Die [γ- 32 P] -ATP Lösung war 171,97 CPM / pmol ATP. Diese Daten können alle in einem einzigen Tag erzeugt werden unter Verwendung des Verfahrens wir beschrieben haben.

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Abbildung 1: Ponceau S - Färbung der Nitrozellulosemembran. Ponceau-Färbung die Kinase gebunden an die Nitrocellulosemembran zeigt. Die Membran wurde mit Reaktionen, die verschiedene Konzentrationen von ATP getupft, aber konstante kinase-Konzentration. Kein Protein wird in den No-Kinase - Kontrollpunkte (4. und 8. Zeile) nachgewiesen. Ponceau S-Färbung Lösung war zusammengesetzt aus 0,1% Ponceau S (w / v) in 5% Essigsäure. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Fluorographie Ergebnisse. Gescanntes Bild eines Leuchtstoffschirms, der auf eine Nitrocellulosemembran ausgesetzt worden war. Die Membran wurde mit Reaktionen entdeckt con enthältstant kinase Konzentration und verschiedenen Konzentrationen von ATP. Jede Konzentration wurde dreifach getestet. Bei jeder Konzentration eine nicht kinase Kontrolle wurde eingeschlossen (4. und 8. Reihe) zu zeigen , daß radioaktiv markiertes ATP vollständig aus der Membran während der Waschstufe entfernt wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Die Szintillationszählung Daten. A) doppelt reziproke Auftragung der Autophosphorylierung von Histidinkinaseregion. Die Substratabhängigkeit Kurve wurde aus Scintillationszählung erzeugt. Phosphohistidin Bildung wurde mit der Steigung von 3B (CPM / pMol ATP) berechnet, das ebenfalls mit sc erzeugt wurde ,intillation Spektrometrie. B) Standard - Kurve des CPM / pMol ATP. Die Steigung wird verwendet, um die Menge von Phosphohistidin (pmol) in jeder Probe zu berechnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Nitrocellulose-Bindungstest wir beschrieben haben, hat viele Vorteile gegenüber bisher verwendeten Verfahren Histidin-Kinasen zu charakterisieren. Im Vergleich zu herkömmlichen SDS / PAGE-basierten Autoradiographie, ist unser Verfahren einen höheren Durchsatz und weniger zeitraubend. Die Nitrocellulosemembran ist leichter zu handhaben als SDS-Gelen, und braucht nicht befestigt zu werden. Ponceau-Färbung der Nitrocellulose ermöglicht die Proteinspots visualisiert werden. Dies bietet eine einfache Möglichkeit, jede Stelle für die Szintillationszählung auszuschneiden und zu bestimmen, dass Eiweißbelastung in allen Flecken konsistent ist. Scintillationszählung jedes Flecks liefert genaue Ergebnisse , das leicht auf die Reaktionsgeschwindigkeit umgewandelt werden kann , die Steigung der Standardkurve in 3B gezeigt werden.

Obwohl Belichten der Nitrocellulosemembran mit einem Speicherleuchtschirm Zeit auf die Gesamtdauer des Experiments hinzufügt, bietet dieser Schritt Einblick in den Erfolg des Blotting. IrgendeinAbweichungen, die in den Szintillationszählung Daten bemerkt werden, können möglicherweise durch das komplementäre Phosphor Bild erläutert. Wenn zum Beispiel wurde die Membran nicht ausreichend gewaschen wird die Phosphorbild diese Informationen zu offenbaren. Fluorographie der Membran ist an jedem empfohlen, die diesen Test verwenden will, da die Ergebnisse aus diesem Schritt ein wertvolles Zusatzinformation sein kann.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil dieses Assays ist die Fähigkeit, Daten von Szintillationszählung zu erzeugen. Ausschneiden jeder einzelne Spot für Szintillationszählung ist bevorzugt von Bildverarbeitungssoftware zu verwenden Bandenintensität zu quantifizieren, wie es typischerweise für PAGE basierten Assays durchgeführt wird. Die obere Grenze und Dynamikbereich für die Erkennung sind weit höher mit Szintillationszählung. eine Standardkurve generieren die CPM / pmol ATP machen es leicht, die Rate der Autophosphorylierung aus den Rohdaten zu bestimmen, zu berechnen. Mit dieser Methode sind wir in der Lage genau zu erfassenPicomol phosphorylierter Produkt.

Trotz der vielen Vorteile unseres Verfahrens verwendet, ist es nicht ohne Einschränkungen. Unsere Methode unterscheidet nicht zwischen 1-Phosphohistidindomäne und 3-Phosphohistidindomäne. Obwohl Phosphohistidindomäne Antikörper verwendet werden, können zwischen diesen phosphoryliert Produkten zu unterscheiden, unsere Methode hat noch den Vorteil der Verwendung Cherenkov-Strahlung Phosphorylierung zu quantifizieren. Cherenkov-Strahlung liefert einen großen dynamischen Bereich und eine hohe obere Grenze der Detektion. Je nach Nachweisverfahren unter Verwendung von Antikörpern Phosphohistidin Bildung zu quantifizieren kann aus einer geringeren oberen Grenze und der Dynamikbereich leiden. Unsere Methode ist beschränkt auch mit gereinigten Proteinen verwendet werden und nicht verwendet werden können phosphorylierte Kinasen in vivo zu detektieren. Unser Verfahren erfordert radiomarkierte Substrat, das Labors abschrecken kann, die nicht für Radioaktivität ausgestattet. Letztlich ist diese Methode vor allem geeignet für Labore, die bereits ausgestattet sind, zu handhabenRadioaktivität, und interessieren sich für einen höheren Durchsatz und weniger zeitaufwendig Alternative zu häufig SDS-PAGE-Techniken verwendet Histidinkinasen zu studieren. Diejenigen, die studieren Ser / Thr / Tyr-Kinasen kann auch diese Methode finden, nützlich zu sein, trotz der relativen Häufigkeit von alternativen Methoden für diese Proteine ​​zu studieren.

Charakterisierung von Histidinkinasen ist seit langem schwer trotz der Fortschritte bei den Methoden anderer Arten von Kinasen zu quantifizieren. Mit diesem Test kann beginnen wir diese biologisch relevanten noch schlecht verstanden Proteine ​​zu charakterisieren. Dieser Fortschritt in Methodik für Histidinkinase Autophosphorylierung Quantifizieren letztlich unser Verständnis von Zweikomponenten in Bakterien Signalisierungs verbessern. Dieser Test wird ein wertvolles Werkzeug, wie wir die Wirkung von artverwandten Stimuli und Protein-Protein-Interaktionen auf Histidin-Kinase-Aktivität in verschiedenen Zwei-Komponenten-Signalwege erkunden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Department of Education durch die Graduate Unterstützung in Bereichen der nationalen Not-Programm (P200A100044) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

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