Biochemistry
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Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins
Chapters
Summary June 30th, 2019
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Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.
Transcript
Immunpräzipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, um ein Zielprotein zu isolieren und zu reinigen. Bei glatten Bedingungen können Proteine, Regulatoren oder Substrate mitimmunimmunprezipitiert werden. Anschließend kann ein neues Interaktionsnetzwerk entdeckt werden.
Die Aktivität des immunpräzipitierten Proteins kann ebenfalls beurteilt werden. Insbesondere kann die Aktivität einer Kinase auf verschiedenen Substraten durch P32-ATP-Kennzeichnung getestet werden. Dennoch kann die Aktivität von Inhibitoren, die auf eine Kinase abzielen, die an einer Krankheit beteiligt ist, bewertet werden.
Sie können Bleiverbindungen zur Entwicklung neuer Medikamente darstellen. Diese Methode kann von Säugetieren auf Hefe oder Bakterien ausgedehnt werden. Diese Technik ist nicht so schwierig.
Zu den wichtigsten Punkten: Stellen Sie sicher, dass Sie eine negative Kontrolle haben, um sicherzustellen, dass die erkannte Interaktion spezifisch ist, und wählen Sie sorgfältig Lysebedingungen aus, um Interaktionen und Aktivitäten beizubehalten. Kleine Details und Gesten sind wichtig, um den Erfolg dieser Technik zu gewährleisten, und sie werden nie in Materialien und Methoden von Artikeln beschrieben. Die Vorführung des Verfahrens wird Fabienne Godin, eine Technikerin aus unserem Labor, sein.
Nachdem zellenweise im Zellkulturraum im Biosicherheitsschrank zellenhaft zubereitet wurde, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um das Medium von den Platten zu entfernen und in einer speziellen Abfallflasche mit Bleichmittel zu entsorgen. Dann fügen Sie 10 Milliliter frisch ergänzt DMEM, und legen Sie die Platten wieder in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Zur Herstellung des Transfektionsgemisches in einem 15-Milliliter-Rohr 450 Mikroliter 10 Millimolar Tris Hydrochloridlösung bei pH 7,5 hinzufügen, ergänzt durch eine Millimolar EDTA und 50 Mikroliter 2,5 Mol Calciumchloridlösung.
Mix durch Inversion. Fügen Sie in die Röhre ein Volumen hinzu, das 10 Mikrogramm Plasma-DNA entspricht, verstärkt durch ein DNA-Midiprep-Kit, und mit dem Elutionspuffer dieses Kits verdünnt wird und dessen Konzentration bestimmt wurde. Invertieren Sie das Rohr zu mischen.
Dann, mit glatter Erregung auf einem Wirbelmischer, langsam 500 Mikroliter BES gepuffert es aline 2X Konzentrat hinzufügen, Tropfen für Tropfen in die Röhre. Bewegen Sie es sehr vorsichtig, um die komplexe Bildung zwischen DNA und Calciumphosphat nicht zu stören. Mindestens 15 Minuten oder bis zu 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Übertragen Sie nun die Platte, um sie vom Inkubator in den Sicherheitsschrank zu transfekieren. Fügen Sie die vorbereiteten DNA-Komplexe Tropfen für Tropfen auf die Zellen auf der gesamten Oberfläche der Platte. 24 bis 72 Stunden im Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Um den Proteinabbau zu verhindern, bereiten Sie den Lysepuffer auf Eis vor, wobei sie vier Milliliter Lysepuffer für jede transfizierte Platte berücksichtigen. Nehmen Sie die Platte mit transfizierten Zellen aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Medien und entsorgen Sie sie in einer speziellen Bleichabfallflasche.
Um die Zellen zu waschen, fügen Sie drei Milliliter kalte PBS auf der Seite der Platte Tropfen für Tropfen hinzu, um zu vermeiden, dass transfizierte Zellen abgelöst werden. Und wirbeln Sie die Platte sanft, um den Puffer über die oberfläche zu verteilen. Neigen Sie die Platte, um die PBS zu entfernen und entsorgen Sie sie in die Abfallflasche.
Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal. Legen Sie die Platte auf Eis. Entfernen Sie am Ende vorsichtig den Rest der PBS.
Als nächstes fügen Sie den transfizierten gewaschenen Zellen 500 Mikroliter Kaltlysepuffer hinzu. Verteilen Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte. 10 Minuten auf Eis bebrüten.
Von Zeit zu Zeit, wieder verteilen Sie den Puffer über die Oberfläche der Platte. Danach verwenden Sie einen Zellspachtel, um die Zellen von der Oberfläche abzukratzen und in einem Mikrozentrifugenrohr zu sammeln. Zentrifuge für 10 Minuten bei 10.000 mal G und vier Grad Celsius.
Sammeln Sie das überstande Lysat in ein neues Mikrozentrifugenrohr und sammeln Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot dieser Fraktion zu einem anderen neuen Mikrozentrifugenrohr. Dieses Aliquot wird verwendet, um zu überprüfen, ob transfizierte Proteine gut exprimiert sind. Entsorgen Sie das Pellet im Papierkorb.
Erstens, die Lagerlösung von Agaroseperlen in Verbindung mit dem entsprechenden Antikörper vorsichtig wieder aufsetzen. Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Spitze, um eine ein bis zwei Millimeter Öffnung zu machen. Befestigen Sie die Spitze an einer Mikropipette und ziehen Sie 40 Mikroliter der Lösung, so dass Perlen in die Spitze gelangen können.
Pipette die Perlen auf und ab mehrmals, um die Spitze zu sättigen, um das richtige Volumen der Perlen zu gewährleisten und die Perlen auf ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 500 Mikroliter TNET-Puffer, mischen Sie durch Inversion, und Zentrifuge für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, und fügen Sie 500 Mikroliter TNET-Puffer hinzu.
Mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubieren. Dann zentrifugieren Sie das Rohr für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius und waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 Mikroliter Lysepuffer durch Invertieren und Zentrifugieren. Nach dem Waschen den zuvor gesammelten Gesamtanteil lysieren in die Röhre und zwei bis vier Stunden auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius brüten.
Jetzt zentrifugieren Sie das Rohr mit den immunpräzipierten Perlen für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius. Waschen Sie die Perlen fünfmal mit 500 Mikroliter Lysepuffer durch Invertieren und Zentrifugieren. Achten Sie beim Waschen der Perlen darauf, nicht zu nah an die Perlen zu gehen, während Sie Überstand entfernen.
Andernfalls werden Perlen angesaugt und am Ende des Experiments werden keine Perlen mehr übrig bleiben. Zur Elution die erste Zentrifuge für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine 1 Milliliter Mikropipette, um den Überstand sorgfältig zu entfernen.
Dann, mit einer Hamilton-Spritze mit einer zementierten Nadel ausgestattet, entfernen Sie die letzten Tropfen des Überstandes, um das Streben der Perlen zu vermeiden. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter 4X Laemmli Puffer hinzu. Homogenisieren Sie durch sanftes Antippen des Rohres.
Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann Zentrifuge für fünf Minuten bei 10.000 mal G und Raumtemperatur. Mit einer Hamilton-Spritze das Überstand-Eluat in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Bei minus 80 Grad Celsius lagern. HEK-293-Zellen wurden mit nicht markiertem LIMK 2-1 oder einer der HA-markierten Isoformen von LIMK 2 transfiziert. LIMK 2-1 ist in den verschiedenen Bedingungen gut ausgedrückt.
Anti LIMK 2-1 Antikörper erkennt LIMK 2a und LIMK 2b Isoformen nicht und ist spezifisch, da sein Signal abnimmt, wenn Zellen mit LIMK2 small interfering RNA transfiziert werden, im Vergleich zur Kontrolle kleiner störender RNA. In verschiedenen menschlichen Zelllinien schien LIMK 2-1 in HEK-293 und HeLa exprimiert zu werden, aber nicht in C6. Coimmunopräzipitationsexperimente wurden verwendet, um die Wechselwirkung von LIMK2-1 mit der vorgelagerten Kinase ROCK zu bewerten. Jedes der verschiedenen Proteine, die von den transfizierten Vektoren kodiert wurden, waren gut exprimiert.
Die drei Isoformen von LIMK2 sowie Larp6 wurden effizient immunwirksam immunwirksam. In den Eluaten wurde ROCK mit den drei Isoformen von LIMK2, nicht aber mit Larp6, nachgewiesen und damit koimmunisiert. Die erkannte Interaktion ist dann spezifisch.
Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 wurde auf seine Kinase-Aktivität mittels Gamma P32 ATP-Kennzeichnung getestet. LIMK 2-1 nicht Phosphorylat Cofilin, während es Phosphorylat Myelin Basisprotein, oder MBP. LIMK 2-1 wird in diesem Test effizient immunpräzipiert.
Es ist wichtig, negative Kontrolle zu haben, während Immunpräzipitation durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Interaktion spezifisch ist. Die Zusammensetzung eines Lysepuffers muss sorgfältig eingerichtet werden, um Interaktion und Aktivität zu erhalten. Bei Immunpräzipitation kann die Kinaseaktivität bewertet werden, um verschiedene Substrate zu zählen.
Mutationen können leicht eingeführt werden und die Rolle bestimmter Rückstände entwirren. Funktionelle Studien können auch durchgeführt werden, um die physiologische Rolle neuer hervorgehobener Wechselwirkungen zu verstehen. Zellen müssen in einem eigenen Kulturraum innerhalb eines Biosicherheitsschranks kultiviert werden.
P32 ATP ist mit besonderer Vorsicht zu behandeln. Schutzschild zum Schutz vor Strahlung, Geigerzähler, spezifische Abfallsammlung, persönliche Brust- und Fingerabzeichen zum Erkennen radioaktiver Exposition und Filterspitzen.
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