ل

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة من قبل، ينطوي على الخلايا البطانية، pericytes، وخلايا العضلات الملساء، الخلايا المناعية، والتنسيق مع الأوعية اللمفاوية والأعصاب. الخلية متعددة، والتفاعلات المتعددة نظام تستلزم التحقيق في الأوعية الدموية في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وهكذا، في حين أن استخدام في المختبر نماذج لزراعة الخلايا قدمت رؤى الآلية، نقد شيوعا هو أنها لا ألخص التعقيدات المرتبطة مع شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات القدرة على إجراء مقارنات الوقت الفاصل بين شبكات الاوعية الدموية الدقيقة على حالها قبل وبعد تحفيز الأوعية الدموية في أنسجة الفئران مساريق مثقف. الأنسجة مثقف تحتوي على شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي تحافظ على التسلسل الهرمي بهم. وضع العلامات المناعى يؤكد وجود خلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا العضلية الملساء، pericytes والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية. فيddition، واصفة الأنسجة مع BSI-كتين يمكن مقارنة الوقت الفاصل بين المناطق الشبكة المحلية قبل وبعد التحفيز مصل أو عامل النمو يتسم بزيادة تنتشر الشعرية وكثافة السفينة. في مقارنة لنماذج ثقافة الخلية المشتركة، وهذه الطريقة توفر أداة لدراسات الخلايا البطانية النسب والأنسجة التقييم المحددة المخدرات عائية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

Introduction

نمو شبكة الاوعية الدموية الدقيقة، وإعادة عرض وقواسم مشتركة من أجل وظيفة الأنسجة، والتئام الجروح، وأمراض متعددة وعملية رئيسية هي الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية دموية جديدة من القائمة 1 و 2. لهندسة الأنسجة سفن جديدة أو تصميم العلاجات عائية القائمة على فهم أهمية ديناميات الخلوية العاملة في الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك، فإن هذه العملية معقدة. يمكن أن تختلف في مواقع محددة داخل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة ويشمل أنواع خلايا متعددة (أي الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، pericytes، الضامة، والخلايا الجذعية) وأنظمة متعددة (شبكات اللمفاوية والشبكات العصبية). على الرغم من أن في المختبر نماذج ساهمت الى حد كبير في دراسة العلاقة بين الخلايا المختلفة المشاركة في الأوعية الدموية يمكن أن تقوض أهميتها الفسيولوجية بسبب thei ص تعقيد محدود، وحقيقة أنها لا تعكس بشكل وثيق سيناريو في الجسم الحي. للتغلب على هذه القيود، ونظم ثقافة ثلاثية الأبعاد المجراة سابقا نماذج الأنسجة أنظمة الموائع الدقيقة 5 و 6 و 7 النماذج الحسابية تم تطويرها وتقديمها في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة لنموذج مع القدرة على مرور الزمن لتحقيق الأوعية الدموية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة سليمة خارج الحي. وإنشاء نماذج الوقت الفاصل جديدة للدراسات الأوعية الدموية مع هذا المستوى من التعقيد توفر أداة لا تقدر بثمن لفهم الآليات الكامنة وراء تنظيم الأوعية الدموية وتحسين العلاجات.

نموذج محتمل تمكن التحقيق المجراة سابقا من الأوعية الدموية عبر شبكة الاوعية الدموية الدقيقة سليمة والفئران نموذج الثقافة مساريق> 8. في الأعمال الأخيرة، لقد أثبتنا أن الدم وشبكات الاوعية الدموية الدقيقة اللمفاوية تبقى قابلة للحياة بعد الثقافة. الأهم من ذلك، نموذج ثقافة مساريق الفئران يمكن استخدامها لتحقيق الوظيفية التفاعلات خلية حوطية البطانية الخلايا والدم وصلات الخلايا البطانية اللمفاوية، والوقت الفاصل بين التصوير. الهدف من هذه الورقة هو تقديم لدينا بروتوكول للأسلوب التصوير في الوقت الفاصل بين. وثيقتنا نتائج ممثل أنواع الخلايا المتعددة التي تبقى قابلة للحياة بعد تحفيز الأوعية الدموية مع الدم وتقديم أمثلة على استخدام هذا الأسلوب لتحديد كمية الأنسجة ردود عائية محددة وكذلك البطانية دراسات تتبع الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب والإجراءات الحيوانية من قبل لجنة جامعة تولين في المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).

1. إعداد الإجراءات الجراحية

  1. أدوات الأوتوكلاف والمعدات الجراحية والمستلزمات الثقافة قبل الجراحة. إمدادات جراحية لكل فأر ما يلي: 1 ثنى (1)، وثنى مع قبل قطع حفرة (0.5 بوصة × 1.5 في) في الوسط، قطع من الشاش، و1 underpad ماصة. وتشمل الأدوات الجراحية: 1 مشرط بشفرة رقم 10، 2 ​​أزواج من ملاقط، وزوج من مقص غرامة. وتشمل الإمدادات ثقافة: 1 ثنى، 1 زوج من ملاقط، وأعدت إدراج لوحة 6 جيدا مع مرشحات البولي.
  2. تعقيم منصة شبكي، مرحلة الجراحية ومساحة الفوق الجراحي مع 70٪ من الإيثانول. الحفاظ على مرحلة جراحية في وعاء معقم حتى الاستخدام.
    1. إنشاء المرحلة الجراحية من خلال حفر على ما يقرب من 2 في موعد أقصاه 1 في حفرة في وسط طبق ثقافة 100 ملم. المقبل، واستخدام الصنفرة لتسهيلأي حواف حادة وإضافة طبقة من الغراء سيليكون لحواف الحفرة لخلق سطح أثار للأنسجة.
    2. بدلا من ذلك، تصميم المرحلة الجراحية باستخدام برامج CAD وجعل بنسبة 3-D الطباعة (الشكل 1).
  3. وضع underpad ماصة معقمة أسفل ويرسي قاعدة شبكي على أعلى من ذلك. وضع الستارة، دون حفرة قبل قطع، على وسادة ساخنة القادمة إلى underpad ماصة.
  4. قبل دافئة معقمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وسائل الإعلام والمالحة إلى 37 درجة مئوية. وسائل الاعلام مكان وبرنامج تلفزيوني في أطباق ثقافة منفصلة فوق وسادة التدفئة ومكان المالحة في أنبوب مخروطي 50 مل إلى جانب الإعداد للعمليات الجراحية.
  5. تأكد من فتح جميع الطرود قبل بداية عملية جراحية لضمان التعامل عقيمة لجميع المواد. وترد قائمة كاملة من الأدوات المستخدمة في هذا الإجراء في جدول المواد والأدوات الجراحية محددة.

2. Mesenterذ الأنسجة حصاد

  1. استخدام الكبار فئران ويستار الذكور (350 ± 25 غرام؛ 6-8 أسابيع من العمر). يمكن أن تكون بديلا سلالات وأعمار الفئران الأخرى.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن العضلي الكيتامين (80 ملغم / كغم من وزن الجسم) وزيلازين (8 ملغ / كغ من وزن الجسم). تأكيد الفئران تحت التخدير بواسطة معسر بين أصابع القدم للتحقق من استجابة رد الفعل. يجب أن يكون هناك شيء. تسكين وقائية لهذا الإجراء المحطة ليست ضرورية.
  3. حلق منطقة البطن وإزالة الشعر المتبقية باستخدام كريم إزالة الشعر. مسح الجلد في منطقة البطن مرتين مع 70٪ ايزوبروبيل تليها بوفيدون اليود. لمناديل وينبغي أن تبدأ الجراح في وسط الموقع الجراحي والانتقال إلى خارج منطقة المعدة بطريقة دائرية حتى لا تتداخل المناطق التي تم نقيت سابقا مع نفس قطعة من الشاش المعقم أو قطعة قطن معقمة. ثم نقل الحيوانات إلى الإعداد جراحية معقمة ووضع على قمة بلات شبكيشكل.
  4. باستخدام شفرة مشرط، وجعل 0.75 في - 1.25 في شق في القناة الهضمية التي تبدأ في 1 في أقل من القص. يجب الحرص على عدم ثقب الأمعاء أو مساريق (1 طبقة من الجلد (1)، طبقة من النسيج الضام، و1 طبقة من العضلات).
  5. وضع الستارة مع وجود ثقب قبل قطع أكثر من شق ووضع مرحلة جراحية معقمة فوق الستارة. ضمان محاذاة فتح مع شق. استخدام أدوات تطبيقها ذات الرؤوس القطن المعقم لتحديد وسحب الدقاق من خلال افتتاح المرحلة الجراحية.
  6. سحب 6-8 النوافذ المساريقي خلال المرحلة باستخدام أدوات تطبيقها من القطن ذات الرؤوس، ويجب الحرص على عدم لمس النوافذ (الشكل 1). وعادة ما يتم حصاد الأنسجة من منطقة الدقاق الأمعاء الدقيقة بدءا بالقرب من الأعور. إبقاء الأنسجة يتعرض رطبة مع ملحي معقم استعد حسب الحاجة باستخدام محقنة معقمة بالتنقيط الحل.
  7. الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن داخل القلب من الصوديوم بنتوباربيتال (0.2 مل لكل فأر). قبل إزالة لينوافذ senteric، وضمان والموت الرحيم الفئران عن طريق تحسس القلب؛ يجب أن يكون هناك نبض.
  8. إزالة الأنسجة مساريق المطلوبة باستخدام ملاقط للاستيلاء على منصة الدهون ومقص غرامة لخفض النافذة. ترك الحدود من الدهون (2 ملم) حول النافذة. غسل الأنسجة مرة واحدة في درجة حرارة PBS العقيمة ومرة ​​واحدة في وسائل الإعلام.
  9. العودة الدقاق exteriorized إلى تجويف البطن والتخلص من الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

3. مساريق زراعة الأنسجة للدراسات الوقت الفاصل بين

  1. نقل الإمدادات تعقيمها الثقافة (انظر القسم 1.1) والأنسجة لغطاء تدفق الصفحي العقيمة.
  2. استخدام ملاقط لنقل كل الأنسجة فوق غشاء فلتر البولي. الأنسجة انتزاع بواسطة لوحة الدهون لتجنب إتلاف الأوعية الدموية.
  3. وسرعان ما انتشر في الأنسجة باستخدام لوحة الدهون، والحرص على عدم لمس النافذة. عكس إدراج مع الأنسجة في الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا، وتغطي مع 3 مل من وسائل الاعلام (الشكل 1
  4. كرر الخطوات من 3،2-3،3 لكل الأنسجة والثقافة في ظروف الحاضنة القياسية (5٪ CO 37 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 5 أيام.

4. التصوير الوقت الفاصل بين من مساريق الأنسجة

  1. في يوم من التصوير، واستكمال وسائل الإعلام في كل بئر مع مترافق BSI-كتين واحتضان في ظل ظروف ثقافة معيار لمدة 30 دقيقة. غسل الأنسجة مرتين مع وسائل الاعلام خالية من كتين. ستبقى BSI-كتين وصمة عار واضحة على النسيج مساريق لمدة تصل إلى 3 أيام في الثقافة.
  2. نقل لوحة لمرحلة المجهر. تحديد الأوعية الدموية واللمفاوية على أساس التشكل وشبكة هيكلها.
  3. تحديد منطقة الشبكة المطلوبة على كل الأنسجة والتقاط صور. يحيط علما التصويروسوف يتم القبض الموقع لضمان نفس المنطقة للصور لاحقة. إذا باستخدام مرحلة الآلية، وتوثيق الإحداثيات.
  4. العودة الأنسجة إلى الحاضنة والاستمرار في الثقافة حتى نقطة النهاية المرجوة. كرر الخطوات من 4،1-4،3 حسب الحاجة اعتمادا على نقاط الوقت التجريبية المطلوبة.

5. الأنسجة Immunolabeling

  1. BSI-كتين وصفها
    1. احتضان الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 01:40 كتين FITC مترافق في وسائل الإعلام (2.5 مل من محلول الأجسام المضادة لكل بئر في لوحة 6 جيدا) تليها اثنين يشطف مع وسائل الإعلام. ليشطف، إضافة وسائل الإعلام ثم استبدل على الفور.
  2. الحي / الميت وصفها
    1. احتضان الأنسجة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 1: 500 2 مم إيثيديوم homodimer-1 و 1: 500 calcein AM 1 ملم في وسائل الإعلام (2.5 مل من محلول الأجسام المضادة لكل بئر في لوحة 6 جيدا) تليها اثنين يشطف مع وسائل الإعلام.
  3. BSI-كتين / NG2 وصفها
    1. الأنسجة انتشار على المجهر تراجعته (1-2 الأنسجة / الشرائح) والسماح ليجف. إزالة الدهون الزائدة مع مشرط عن طريق الضغط على أسفل بشدة لاستئصال الدهون.
    2. إصلاح الأنسجة في الميثانول البارد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني (3 × 10 دقيقة).
    3. لوضع العلامات الأجسام المضادة الأولية احتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 100 أرنب بولكلونل NG2 الأجسام المضادة و 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع). غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني (3 × 10 دقيقة).
    4. لوضع العلامات الضد الثانوية احتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 100 الماعز المضادة للأرنب CY2 مترافق الأجسام المضادة (GAR-CY2) و 5٪ خ ع. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني (3 × 10 دقيقة).
    5. احتضان الأنسجة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 01:40 كتين FITC مترافق في برنامج تلفزيوني تليها اثنين يشطف مع برنامج تلفزيوني. ليشطف، إضافة PBS ثم استبدل على الفور.
    6. لتحميل الشرائح، وتغطية الأنسجة مع 50:50 برنامج تلفزيوني وحل الجلسرين ومكان ساترة على القمة. ختم حواف الشريحة باستخدام طلاء الأظافر.
  4. LYVE-1 / PECAM وصفها
    1. نشر الأنسجة على شريحة المجهر (1-2 الأنسجة / الشرائح) والسماح ليجف. إزالة الدهون الزائدة مع مشرط عن طريق الضغط على أسفل بشدة لاستئصال الدهون.
    2. إصلاح الأنسجة في الميثانول البارد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    3. لوضع العلامات الأجسام المضادة الأولية احتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 200 الماوس وحيدة النسيلة المعقدة البيروكسيديز CD31 الضد و 1: 100 أرنب بولكلونل LYVE-1 الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين + 2٪ زلال المصل البقري (BSA) + 5٪ خ ع . غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    4. لوضع العلامات الضد الثانوية، واحتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: الأجسام المضادة streptavidin 500 CY3 مترافق و 1: 100 GAR-CY2 في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين + 2٪ BSA + 5٪ خ ع. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    5. لتحميل الشرائح والأنسجة مع تغطية 50:50 برنامج تلفزيوني والجلسرين حل ووضع ساترة على القمة. ختم حواف الشريحة باستخدام طلاء الأظافر.
  5. BrdU / BSI-كتين وصفها
    1. إضافة 1 ملغ / مل BrdU إلى وسائل الإعلام واستبدال وسائل الإعلام الأنسجة بمحلول BrdU. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. نشر الأنسجة على شريحة المجهر (1-2 الأنسجة / الشرائح) والسماح ليجف. إزالة الدهون الزائدة مع مشرط عن طريق الضغط على أسفل بشدة لاستئصال الدهون.
    3. إصلاح الأنسجة في الميثانول البارد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني (3 × 10 دقيقة).
    4. تفسد الحمض النووي الأنسجة في 2 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    5. لوضع العلامات الأجسام المضادة الأولية، واحتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 100 وحيدة النسيلة الماوس مكافحة BrdU في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين + 2٪ BSA + 5٪ خ ع. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    6. لوضع العلامات الضد الثانوية، واحتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 100 الضد الماعز المضادة للماوس و Cy3 مترافق (امانة عمان-و Cy3) في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين + 2٪ BSA + 5٪ خ ع. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    7. لتحميل الشرائح والأنسجة مع تغطية 50:50 برنامج تلفزيوني وحل الجلسرين ومكان ساترة على القمة. ختم حواف الشريحة باستخدام طلاء الأظافر.
  6. BSI-كتين / CD11b الوسم
    1. نشر الأنسجة على شريحة المجهر (1-2 الأنسجة / الشرائح) والسماح ليجف. إزالة الدهون الزائدة مع مشرط عن طريق الضغط على أسفل بشدة لاستئصال الدهون.
    2. إصلاح الأنسجة في الميثانول البارد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    3. لوضع العلامات الأجسام المضادة الأولية احتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 100 الماوس لمكافحة الفئران CD11b في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين + 2٪ BSA + 5٪ خ ع. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    4. لوضع العلامات الضد الثانوية احتضان الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 1: 100 امانة عمان-و Cy3 في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ سابونين + 2٪ BSA + 5٪ خ ع. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني+ 0.1٪ سابونين (3 × 10 دقيقة).
    5. احتضان الأنسجة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 01:40 كتين FITC مترافق في برنامج تلفزيوني تليها اثنين يشطف مع برنامج تلفزيوني.
    6. لتحميل الشرائح والأنسجة مع تغطية 50:50 برنامج تلفزيوني وحل الجلسرين ومكان ساترة على القمة. ختم حواف الشريحة باستخدام طلاء الأظافر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد 3 أيام في الثقافة، وصفت الأنسجة مع الميتة عدة الحية / الجدوى / السمية الخلوية لإثبات جدوى من الأوعية الدموية الدقيقة في نموذج الثقافة الفئران مساريق (الشكل 2A). بقيت غالبية الخلايا الموجودة في مساريق قابلة للحياة في الثقافة حيث تم تحديد القائمة على الخلايا البطانية على مواقعها في قطاعات الاوعية الدموية الدقيقة. وأكد تكاثر الخلايا البطانية أيضا كتين / BrdU وضع العلامات (الشكل 2D). وأكد الخلايا العضلية الملساء وجود خلية حوطية على طول السفن مع NG2 وضع العلامات (الشكل 2B). وضع العلامات لLYVE1 وPECAM حددت المتفرعة شبكات اللمفاوي والاوعية الدموية الدقيقة في الدم، وأكد على الحفاظ اللمفاوي مقابل الخلايا البطانية الدم النمط الظاهري (الشكل 2C).

تم استخدام ميزة الوقت الفاصل بين هذا النموذج من قبل وصفها microvaشبكات scular مع BSI-كتين في نقاط زمنية مختلفة، والتصوير في نفس المنطقة داخل الشبكة على مر الزمن؛ هذه القدرة هي قيمة خاصة للتحقيق في الأنسجة ردود عائية محددة. مكملات من وسائل الإعلام مع 10٪ مصل تسبب استجابة عائية قوية بعد 3 أيام من التحفيز. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد قطاعات سفينة جديدة وبراعم الشعرية بعد يوم 5 من التحفيز (الشكل 3). الوقت الفاصل بين طريقة التصوير يسمح للمقارنة كمية من المناطق الشبكة قبل وبعد التحفيز (الشكل 4). لهذه الدراسة التمثيلية، التي تؤكد صحة النتائج السابقة لدينا وكميا في عدد من السفن في منطقة الأوعية الدموية وعدد من براعم الشعرية في مجال الأوعية الدموية من صورة 4X واحدة في الأنسجة. وقد تم تحديد قطاعات الأوعية الدموية كما شرائح الخلايا البطانية الدم كتين الإيجابية الحالية بين نقطتين فرع وبراعم الشعرية ويعرف بأنه أعمى انتهى شرائح القادمة من سفينة المضيفة. مقارنة الوقت الفاصل بين المناطق الشبكة أيضا تمكين تتبع قطاعات الخلايا البطانية (الشكل 5) وتحديد الدم / سفينة اللمفاوية سوء الزخرفة (الشكل 6). وضع العلامات من الأنسجة مثقف لكتين وCD11b أكدت بالإضافة إلى وجود الضامة المقيمين الخلالي (الشكل 7) في شبكات إعادة عرض.

شكل 1
وتقع الشكل 1. النوافذ مساريقي من خلال سحب الأمعاء الدقيقة خلال المرحلة الجراحية. وقد تم تصميم المرحلة الجراحية والتي الطباعة 3-D. ثقب بيضاوي الشكل في وسط ما يقرب من 2 في موعد أقصاه 1 في الفقرة (أ). وانتشرت بعد ذلك النوافذ المساريقي على رأس القائمة لإدراج غشاء، وكان مقلوب إدراج وضعت في بئر (B). شريط مقياس = 2 سم.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
لا تزال الشكل 2. الأوعية الدموية قابلة للحياة في نموذج الثقافة الفئران مساريق. وأظهرت لايف / فحص ميت أنجزت بعد ثقافة نسبة عالية من الخلايا الحية (الأخضر) إلى الخلايا الميتة (الحمراء) على وجه التحديد على طول الأوعية الدموية (A). وصفت الأنسجة مساريق مع كتين ومكافحة NG2، لتحديد pericytes (أحمر) إلى جانب السفن (الخضراء) وللتأكد من أن أنواع مختلفة من الخلايا موجودة في الأنسجة بعد ثقافة (B). وصفت الأنسجة أيضا ضد PECAM / LYVE-1 لتحديد الدم (الحمراء) الأوعية اللمفاوية من (الأخضر) السفن (C). للتحقيق إذا خلايا الاوعية الدموية الدقيقة تخضع انتشار في الثقافة، وصفت الأنسجة مساريق مع كتين / مكافحة BrdU . على قطاعات الشعرية المسمى مع كتين (الأخضر)، وتأكدت خلايا متعددة لتكون التكاثري (أحمر) (D). الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الوقت الفاصل بين التصوير من مساريق الفئران يمكن مراقبة إعادة الاوعية الدموية الدقيقة على مدى الثقافة. ولوحظ وجود استجابة عائية قوية بعد 3 (ب) و 5 أيام (C) للثقافة مع التحفيز المصل 10٪. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملفات / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg "/>
تم تصوير الشكل 4. شبكات الاوعية الدموية الدقيقة في نموذج الثقافة الفئران مساريق قبل وبعد تكوين الأوعية الدموية. مقارنة بنفس الشبكة المسمى مع كتين يوم 0 واليوم 3 (A، B) بعد التحفيز مع 10٪ مصل تحدد سفن جديدة. أيضا تسميات كتين مجموعة من الخلايا الخلالية مجهولة. وأكد الكمي لكثافة الأوعية الدموية (C، D) وعدد من براعم الشعرية في مجال الأوعية الدموية (E، F) زيادة في كل المقاييس لكل الأنسجة. C، E) وقبل (يوم 0) وبعد (3 أيام) المقارنات في الأنسجة. D، F) مقارنة بين اليوم 0 واليوم أكدت 3 المتوسطات باستخدام الاقتران اختبار t الطالب اختلاف كبير في كل من متوسط عدد شرائح سفينة (ع <0.0001) ومتوسط عدد براعم (ع <0.00001) في منطقة الأوعية الدموية . تمثل أشرطة بيضاء اليوم 0، وتمثل أشرطة سوداء يوم 3. VALUوفاق هي متوسطات ± SEM. لهذا التحليل التمثيلي، تم حصاد 13 الأنسجة من 2 الفئران. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الفأر نموذج الثقافة مساريق يمكن استخدامها للتحقيق في مصير جزيرة الأوعية الدموية وإدماجها في الشبكات القريبة. استخدام الوقت الفاصل بين التصوير والجزر الأوعية الدموية، كما تم تعريفها قطاعات البطانية قطع، وقد تم تحديد يوم 0 وأكد علاقتهم بالشبكة المجاورة يوم 3 التحفيز بعد عائية. وحفز أنسجة مساريق مع bFGF (A، B) وعامل نمو بطانة الاوعية / PDFG-BB (C، D). وتشير سهام جوفاء أجزاء منفصلة يوم 0 والسهام الصلبة تمثل اتصال الجزيرة الشبكهك. السهام تشير إلى موقع الاتصالات بين جزيرة الأوعية الدموية وشبكة المجاورة. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. الصور الوقت الفاصل بين تثبت القدرة على مراقبة اللمفاوية والأوعية الدموية الزخرفة. اللمفاوية (ل) السفن يمكن تمييزها عن الشرايين (أ) والأوردة (ت) على أساس وضع العلامات التشكل في اليوم 0 (A). في يوم 5 بعد التحفيز مع 10٪ مصل، يتم فقدان التشكل اللمفاوي وتظهر الأوعية إلى اندمجوا مع الأوعية الدموية عائية المجاورة (B). الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

الرقم 7
لا تزال شخصية 7. الضامة الموجودة في أنسجة الفئران المساريقي مثقف. كتين / CD11b شارك في وضع العلامات من الأنسجة تربيتها لمدة 3 أيام مع 10٪ مصل تشير إلى أن كتين خلايا الخلالية الإيجابية هي مجموعة فرعية من الضامة. (أ) صورة تمثيلية لوضع العلامات BSI-كتين. (ب) Cd11b وضع العلامات في نفس مجال الرؤية. (ج) صورة المدمجة. الأسهم تحديد أمثلة من شارك في وضع العلامات. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يوثق طريقة لاستخدام نموذج الثقافة الفئران مساريق كأداة خارج الجسم الحي للتصوير الوقت الفاصل بين النمو شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. وقد أنشأت الأعمال السابقة في مختبرنا استخدام نموذجنا لل1) الأوعية الدموية 2) lymphangiogenesis 3) التفاعلات خلية خلية حوطية البطانية و 4) المضادة للعائية اختبار المخدرات 9. القدرة لتصوير أنسجة الفئران مساريق مثقف في نقاط زمنية متعددة تقدم الفحص الكمي لتقييم ردود نمو الأنسجة محددة، وتتبع التفاعلات خلية خلية خلال مختلف المحفزات عائية. انتشار زيادة الخلايا البطانية خلال الأوعية الدموية ووجود pericytes تتفق مع عملنا السابق 8 و التحقق من صحة التفاعلات الدينامية بين أنواع خلايا متعددة خلال الأوعية الدموية في أنسجة الفئران المساريقي مثقف.

معشوقة = "jove_content"> وبالمقارنة مع نماذج زراعة الأنسجة المستخدمة، وفي أنظمة زراعة الخلايا في المختبر، ونموذج الثقافة مساريق الفئران هي فريدة من نوعها بسبب حدوث النمو ضمن شبكة الاوعية الدموية الدقيقة حقيقية سليمة. النظر في المقابل الفحص حلقة الأبهر، التي أنشئت لدراسة تنتشر عائية من شرائح الأبهري في هلام الكولاجين 10. في حين تنتشر في حلقة الأبهر ينطوي على أنواع الخلايا المتعددة، تنمو براعم الشعرية من شرائح رفعه من الشريان الأورطي، والذي يختلف كثيرا عن السيناريو في الجسم الحي. نموذج شريحة الدماغ هو نموذج آخر خارج الحي، لكنها خالية من الأوعية اللمفاوية. وعلاوة على ذلك، لم يظهر نموذج شريحة الدماغ لتكون قادرة على التصوير في الوقت الفاصل بين قبل وبعد التحفيز عائية 11. نموذج آخر خارج الحي الذي تم عرضه مؤخرا هو النموذج الثقافة الشبكية. الاستفادة من نموذج شبكية العين هي أن الأوعية الدموية يحدث من microvascu سليمةشبكات لار داخل النسيج 12 و 13. لهذه النماذج، سلالات الفئران GFP المعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتكون قادرة على مراقبة الشعرية تنتشر مع مرور الوقت، ولكن للأسف، مساريق الماوس اوعائي 14، والقضاء على استبدال الفئران مساريق-GFP المعدلة وراثيا لمساريق الفئران، كما استخدمت في نموذجنا. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن وضع العلامات كتين بسيط من أنسجة الفئران مساريق في الثقافة غير كافية لتحديد نمو الشبكة في نقاط زمنية مختلفة، وبالمقارنة مع الآخر خارج الجسم الحي نماذج، نموذج لدينا يسمح للمراقبة في وقت واحد في كل من الدم والخلايا البطانية اللمفاوية.

وقد استخدم BSI-كتين في هذه الورقة إلى تصور شبكات الاوعية الدموية الدقيقة والكشف عن ردود عائية. كتين هو بنية البروتين الذي يربط إلى بروتينات سكرية في الخلايا البطانية واختير لهذا البروتوكول نظرا لوقته حضانة قصيرة مقارنة antib البطانيةعلامات ODY. كتين أقل تكلفة من الأضداد، وأنها لا تتطلب تثبيت. فإنه يمكن أيضا أن تكون مختلطة بسهولة في وسائل الإعلام والثقافة، واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة بعد انتهاء فترة الحضانة. بينما هناك حاجة لدراسات مستقبلية لتوضيح الآثار المحتملة لهذه التقنية كتين وضع العلامات على عملية عائية، نتائج ممثلة لدينا (الشكل 4) تبين أن الأوعية الدموية قوي يمكن أن يتسبب والعمل السابق 9 يدل على أن الأوعية الدموية في شبكات كتين المسمى يمكن تثبيط عبر استهداف الأوعية الدموية عامل النمو غشائي (VEGF). من المحتمل أن علامات الضد أن تستخدم كمدخل وضع العلامات بديل عندما يكون هناك حاجة لعلامات محددة أكثر، أو عندما يكون هناك حاجة للتحقيق في أنواع أخرى من الخلايا التي تكون موجودة في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مثل خلايا العضلات الملساء، pericytes، والأعصاب. أن أسلوب آخر محتمل للخلايا تصور أن يكون ترنسفكأيشن الجينات.

وقد تم تسليط الضوء على ميزة استخدام الوقت الفاصل بين نموذج الفئران مساريق في نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول. المقارنة بين الصور قبل وبعد العلاج يقلل قضايا التغير التي تؤثر على التحليل الإحصائي غير مقترن. ردود محددة يزدرع تراوحت من 20٪ إلى 233٪ زيادة في كثافة السفينة ومن 40٪ إلى 3500٪ زيادة في كثافة تنبت. لا تزال أسباب محددة لهذا الاختلاف غير معروف، ولكن قياس النمو في النسيج نفسه مع مرور الوقت تظهر القدرة على تأكيد الأنسجة استجابات محددة.

تحليل مقارن للصور عند نقاط زمنية مختلفة خلال نمو الاوعية الدموية الدقيقة كما يسمح لتعقب الخلايا البطانية. على سبيل المثال، وقد حددت مختبرنا الجزر الأوعية الدموية كما شرائح الخلايا البطانية في محيط شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي يتم قطع الاتصال من الشبكات المجاورة 15، 16. للتأكد من أن هذه الجزر تتصل الشبكه القريبةك استجابة للمؤثرات عائية، تم استخدام نموذج الثقافة الفئران مساريق. كما هو مبين في الشكل (5)، وتتبع الجزر الأوعية الدموية بعد التحفيز الأنسجة مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) أو عامل نمو بطانة الاوعية بالإضافة إلى عامل النمو المشتق من الصفيحات (PDGF). لقد أظهرت أيضا نتائج مماثلة التحفيز آخر المصل (لا تظهر البيانات هنا). بعد تحفيز الأوعية الدموية، ويمكن الاطلاع على الجزر الأوعية الدموية قطع أصلا مرتبطة الشبكات القريبة.

التطبيقات المحتملة الأخرى من طراز الثقافة مساريق الفئران يمكن الاستفادة القدرة على التحقيق في العلاقات بين اللمفاوية والأوعية الدموية والخلايا البطانية الخاصة بها وتتبع مصير الخلية خلالي. قدمت الوقت الفاصل بين الصور من نفس شبكات الاوعية الدموية الدقيقة قبل وبعد التحفيز مع 10٪ مصل في هذا النموذج الأمثلة على التكامل سفينة المحتملين اللمفاوية إلى الدم (الشكل 6). قبل التحفيز، اللمفاوية والدم VESSتميزوا إلس على أساس التشكل السفينة. بعد التحفيز، اللمفاوية مقابل الهوية الأوعية الدموية أصبحت أقل وضوحا. ويدعم إمكانية للتفاعل الخلايا البطانية اللمفاوية / الدم عن طريق مراقبة PECAM خلايا + / LYVE-1- البطانية الدم التواصل مع PECAM + / LYVE-1 + الخلايا البطانية اللمفاوية (البيانات غير مبينة هنا). هذه الملاحظات تدعم استخدام نموذج الثقافة الفئران مساريق للتحقيق اللمفاوية / خلايا الدم البطانية اللدونة. كما يسلط الضوء على الشكل 6A وصفها كتين للخلايا الخلالية واضحة. في حين أن هذا الوسم غير متناسقة وغير متجانسة من الأنسجة إلى الأنسجة، وأنها لا تؤكد وجود خلايا المقيمين الأنسجة الداخلية. CD11b وسم الأنسجة مثقف (الشكل 7) يشير إلى أن هذه الخلايا الخلالية-كتين إيجابي يمكن أن تكون مجموعة فرعية من الضامة. ونظرا للاهتمام الناشئة في مشاركة بلعم في الأوعية الدموية 20، وهي قوة إضافية للالنموذج يمكن أن يكون استخدامها لتتبع ديناميات بلعم مع مرور الوقت.

مثل الكثير من النماذج الحية السابق أخرى، وجود قيود الحالي لدراسة الأوعية الدموية في نموذج الثقافة الفئران مساريق هو نقص في تدفق الدم. وقد تبين إجهاد القص الناجمة عن تدفق الدم إلى لعب دور في مورفولوجيا الخلايا البطانية وانتشار وكذلك الأوعية الدموية 17، 18، 19. للحصول على نتائج التمثيلية المعروضة في الشكل (4)، لعدم وجود إجهاد القص وحدها قد تكون كافية لإحداث استجابة عائية في شبكات مثقف. ومع ذلك، ونحن نعلم أنه استنادا لدينا المنشور الأولي تميز نموذج الثقافة الفئران مساريق زادت أن أسباب سائل الإعلام مكملات الأوعية الدموية مقابل وسائل الإعلام وحدها. هناك حاجة لدراسات مستقبلية تتضمن تدفق داخل شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مثقف مما لا شك فيه أن تحاكي بشكل وثيقفي السيناريو الجسم الحي. ويمكن أن تشمل المناهج المحتملة لدمج تدفق إقناء؛ إدخال القنية من الشرايين تغذية الشبكة أو حتى إقناء؛ إدخال القنية المزيد من الشرايين المنبع داخل الحدود الدهون من النوافذ المساريقي. ومع ذلك، على الرغم من عدم وجود التدفق، والجدوى من أنواع الخلايا المتعددة، والحفاظ على الدم وشبكات الاوعية الدموية الدقيقة اللمفاوية، وتكاثر الخلايا خلال الأوعية الدموية يدعم مستوى زيادة النسبي نموذج الثقافة الفئران مساريق عن التعقيد بالمقارنة مع خلية مقرها في نماذج المختبر.

في الختام، يصف هذا البروتوكول، وطريقة استنساخه بسيط خارج الحي لتصوير ردود عائية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة سليمة. يقدم مثل هذا الأسلوب بديلا لخلية مقرها في نماذج المختبر لتقييم ديناميات خلية عائية في مواقع محددة داخل بيئة شبكة اتصال. كما يقدم طريقة أداة جديدة للتحقيق في الأوعية الدموية، lymphangiogenesis والدم / اللمفاوية سوء طقطقنينغ في وقت واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4, (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7, (12), e50582 (2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19, (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10, (3), e0119227 (2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63, (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5, (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3, (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212, (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8, (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23, (2), 95-121 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics